Extracto
El crisotilo es uno de los seis tipos de asbesto, y es el único que todavía puede ser comercializado en muchos países. La exposición a otros tipos de asbesto se ha asociado con enfermedades serias, tales como carcinomas pulmonares y mesoteliomas pleurales. La asociación de la exposición al crisotilo con la enfermedad es controversial. Sin embargo,
in vitro
estudios demuestran el potencial mutagénico de crisotilo, que puede inducir ADN y daño celular. El presente trabajo tuvo como objetivo analizar las alteraciones en los pulmones pequeños cultivos de carcinoma de células después de 48 h de exposición al crisotilo, seguido de 2, 4 y 8 días de recuperación en medio de cultivo libre de fibras. Algunas alteraciones, tales como la formación de células aneuploides, se observaron aumento del número de células en fase G2 /M y las células en mitosis multipolares incluso después de 8 días de recuperación. Se detectó la presencia de fibras de crisotilo en los cultivos celulares y la morfología celular se observó por barrido láser microscopía confocal. Después de 4 y 8 días de recuperación, sólo unos pocos fragmentos de crisotilo estaban presentes en algunas células, y la morfología celular fue similar a la de las células control. Las células transfectadas con el plásmido α-tubulina BPA de etiquetado fueron tratados con crisotilo durante 24 o 48 horas y las células en la mitosis multipolar fueron observadas por microscopía de lapso de tiempo. Se establecieron sinos de estas células: la retención en la metafase, la muerte celular, la progresión a través de la fase M la generación de más de dos células hijas o fusión celular durante la telofase o la citocinesis. Algunos de ellos estaban relacionados con la formación de células aneuploides y células con número anormal de los centrosomas
Visto:. BdA Cortez, Quassollo G, Cáceres A, Machado-Santelli GM (2011) El destino de Multipolar inducida por el crisotilo mitosis y Aneuploides Población en células cultivadas del cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (4): e18600. doi: 10.1371 /journal.pone.0018600
Editor: Robert Qi, de la Universidad de Hong Kong de Ciencia y Tecnología, Hong Kong
Recibido: noviembre 30, 2010; Aceptado: 7 Marzo 2011; Publicado: 5 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Cortés et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo - FAPESP, y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico - CNPq, Brasil y por subvenciones de la Agencia Córdoba Ciencia y MINCyT (PICT 815 y PME), Argentina. BAC era un compañero de la Red de MacroUniversidades de América Latina y el Caribe, durante su estancia en Argentina. GQ es un compañero de doctorado de FONCyT (Argentina). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el asbesto es un mineral de silicato divididos en dos grupos principales - serpentinas y anfíboles. anfíboles se utilizan comúnmente en aplicaciones comerciales hasta que la asociación entre la exposición de los anfíboles con varias enfermedades graves, como la asbestosis, cáncer bronquial y mesotelioma maligno de la pleura y el peritoneo [1], [2]. En la actualidad, las fibras de anfíboles no se pueden utilizar en muchos países y han sido sustituidos por el crisotilo, una de amianto serpentina que se considera menos perjudicial para la salud humana.
El crisotilo se compone de fibras de seda curvas con una sección transversal pequeña (80 a 130 Å) y una estructura tubular. Su autorización de tejido pulmonar es más rápida que la de las fibras de anfíboles, crisotilo y no se acumula en el pulmón debido a un mecanismo que implica la fragmentación de las fibras en trozos cortos [3].
Los mecanismos que conducen al desarrollo de enfermedades como carcinomas y mesoteliomas después de la exposición al amianto no se conocen bien. Sin embargo, los efectos mutagénicos y citotóxicos de amianto se ha demostrado en estudios que utilizan células cultivadas expuestas a diferentes fibras de amianto por períodos que van desde 1 h a 72 h.
La exposición de células cultivadas a asbesto conduce a la formación de oxyradicals y los radicales libres que dañan el ADN [4], [5], [6]. Se ha demostrado que la exposición de células cultivadas a crisotilo puede causar roturas de doble cadena en el ADN después de 3 y 24 h [7], [8] y también puede causar supresiones intracromosomal y mutaciones de ADN [9]. daños en el ADN inducidos por el crisotilo puede desencadenar la apoptosis en diversos tipos de células después de 3 a 4 h de la exposición [8], [10].
micronúcleos también se observan después del tratamiento crisotilo [11]. Estos cuerpos de cromatina, que contienen un fragmento de cromosoma acéntrico o todo un cromosoma que se desprendió de la placa de la metafase, se pueden generar después de la rotura de cromosomas y las interrupciones de la mitosis, tales como husillos multipolares. Por lo tanto, los datos sugieren que el crisotilo puede causar roturas de la cadena de ADN y perturbar los husos mitóticos.
interrupciones del ciclo celular en las células expuestas al crisotilo se investigaron mediante citometría de flujo, y no se observaron alteraciones complejas. Las células tratadas con el crisotilo durante 4 a 48 horas mostró G2 /M y la retención de una disminución del número de células en fase S, identificado por la incorporación de BrdU [12].
división mitótica después de la exposición al asbesto también fue observado por lapsos de tiempo y microscopía confocal. Se encontraron algunas alteraciones, tales como defectos en la formación del huso y el fracaso de la citocinesis en la presencia de fibras internalizados. Estos experimentos muestran que las fibras largas se pueden localizar entre las células hijas durante la telofase y conducen a insuficiencia citocinesis, generando multinucleadas y células aneuploides [13], [14]. Se observaron resultados similares en las células expuestas a los nanotubos de carbono. Estas células mostraron alteraciones de los centrosomas y husos mitóticos, lo que sugiere que los nanotubos podrían interferir con microtúbulos y proteínas motoras [15].
células aneuploides se caracterizan por el contenido de ADN anormal debido a una pérdida o ganancia de cromosomas enteros o partes de cromosomas, y la mayoría de los tumores sólidos contienen células aneuploides [16], [17], [18]. La aneuploidía puede ser resultado de errores en el ciclo celular, los errores en los puestos de control mitótico que permiten daño del ADN o replicación de errores que se pasa a las células hijas, errores en la segregación cromosómica y citocinesis, que pueden ocurrir debido a la amplificación del centrosoma y la formación de husos multipolares [19 ].
en 1914, Boveri citó aneuploidía como causa de cáncer, pero el posterior descubrimiento de los oncogenes y genes supresores de tumores conducido a una nueva teoría, en el que la acumulación de mutaciones en estos genes era la causa de la transformación maligna [20]. La discusión ha continuado, y en la actualidad aneuploidía se consideran implicados en la progresión tumoral, supresión o iniciación [21], [22], [23]. Sin embargo, es evidente que la aneuploidía puede introducir mutaciones que dan lugar a la transformación maligna y conducir a la inestabilidad genética [24]
.
El presente trabajo se centra en la formación de células aneuploides después de la exposición a tres diferentes concentraciones de fibras de crisotilo , seguida de largos tiempos de recuperación en medio libre de fibra. También se analizaron las interrupciones del ciclo celular que podrían estar involucrados en la formación de células aneuploides, mediante la comparación de las alteraciones encontradas en las células normales y cancerosas expuestas al crisotilo. mitosis multipolares también fueron rastreados para determinar el destino de estas células y su contribución a la formación de células aneuploides.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Las células hK2 (una línea celular establecida a partir de carcinoma humano de pulmón no de células) [25] y las células VERO (una línea epitelial derivada de riñón de mono verde - número ATCC CCL-81) se cultivaron en Modificado mínimo Medio de Dulbecco de Eagle esencial (Sigma), suplementado con 10% fetal de suero bovino, en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 a 37 ° C.
Tratamiento crisotilo
el crisotilo 5R (Estándar Quebec) obtenido a partir de SAMA Mineração Ltda Amianto (Minaçu, GO, Brasil) fueron amablemente proporcionados por el Dr. M. Flavia Cassiola. Las fibras se lavaron con agua del grifo y activados por sonicación a pH controlado (7.4) como se describe en otra parte [26]. Para el tratamiento, las células se eliminaron enzimáticamente a partir de los frascos y se sembraron en placas de 35 mm de diámetro (2,10
5 células /placa). Después de 24 h de cultivo, el medio se cambió a 2 ml de medio fresco con las fibras de crisotilo en una concentración aproximada final de 250 g /ml, 125 mg /ml o 62,5 g /ml, rango bajo que la mayoría
in vivo
estudios (10 a 17 mg /m
3). Las fibras se mantuvieron en contacto con las células durante períodos de 24 h o 48 h, después de lo cual se cambió el medio. Después de períodos adicionales de 2, 4 u 8 días en las células normales medianas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBSA) y fija. Durante todo el tratamiento del medio de cultivo se suplementó con suero bovino fetal 10%, y se cambió cada 2 días durante el tiempo de recuperación.
ADN cuantificación
El contenido de ADN nuclear de las células hK2 crisotilo tratados y de control se cuantificó mediante análisis de imagen con los CIRES software (celda de la imagen de recuperación y evaluación del sistema Kontron Eletronik) instalados en Axioskop microscopio (Zeiss). Para el análisis, los núcleos se tiñeron por la reacción de Feulgen [16]. tratamientos crisotilo se realizaron utilizando tres concentraciones diferentes fibras (250 g /ml, 125 g /ml, 62,5 g /ml), y después de 48 h de tratamiento se usaron tres veces diferentes de recuperación en medio de cultivo libre de fibra: 2, 4 y 8 dias. Cuatrocientos núcleos de mononucleadas, binucleadas y multinucleadas se analizaron de forma independiente en el control y células tratadas con crisotilo. Las células tumorales suelen tener alteraciones genéticas y la mayoría de ellos son hiperdiploide. Desde HK2 es un
in vitro
línea celular establecida, el grupo diploide se define de acuerdo con el pico de G0 /G1 en los histogramas, y el grupo tetraploide se determinó con el doble de contenido de ADN.
citometría de flujo
el ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo utilizando el Sistema de guayaba. Se analizaron de control y el crisotilo (125 g /ml) células tratadas durante 48 h y se recuperó en medio normal durante 2, 4 y 8 días. Para las células de análisis se trataron con tripsina, se centrifugaron (1000 rpm durante 10 min), se lavó con PBSA y se fijaron con metanol: PBSA (3:01) durante 1 hora a 4 ° C. Luego, las células se centrifugaron, se lavaron con PBSA y se incubaron con una solución de 200 l de PBSA, 20 l de ARNasa y 20 l de yoduro de propidio para 1 h. Se analizó 5.000 células para cada condición experimental
Inmunofluorescencia:. Índice mitótico, la morfología celular y la presencia de fibras
hK2 células fueron tratadas con 125 mg /ml de crisotilo durante 24 hy 48 h , y también tratada durante 48 h y se recuperó para 2, 4 y 8 días en medio normal; y células VERO se trataron con 125 mu /ml de crisotilo durante 48 h y se recuperan en medio normal durante 24 h. Control y las células tratadas se fijaron con formaldehído 3,7% durante 30 min y se trataron con Triton X-100 0,1% durante 10 min. A continuación, se sometieron las células a inmunofluorescencia con anti-α y anticuerpos beta-tubulina (Sigma, diluido 1:200) y con el segundo anticuerpo anti-ratón de CY5 (Invitrogen, se diluyó 1:200). Después de esto, las células se trataron con ARNasa durante 30 minutos, los núcleos se tiñeron por yoduro de propidio y los filamentos de actina con faloidina-FITC. La morfología celular y la presencia de fibras de crisotilo fue fotografiada por láser microscopía confocal de barrido (LSM 510, Carl Zeiss). Estas preparaciones también se utilizaron para cuantificar la presencia de células multinucleadas micronucleadas, y la mitosis: preparaciones se observaron por microscopía de fluorescencia. Al menos 1.000 células /diapositivas y 100 células mitóticas fueron contados en tres toboganes diferentes para cada tratamiento y control.
Tiempo-Lapso de Microscopía
HK2 fueron transfectadas con el plásmido GFP-tagget-alfa tubulina para permitir el seguimiento de los microtúbulos durante la mitosis. La transfección se realizó con Lipofectamine 2000 Invitrogen) de acuerdo con el protocolo de fabricación. Después de 24 h de la transfección, el medio se cambió a medio con fibras de crisotilo. Las células se mantuvieron con las fibras durante 24 o 48 h, y luego se observaron por disco giratorio de lapso de tiempo microscopía confocal usando un microscopio ESD X-81 invertido (Olympus), equipado con iluminación MT20 y sistemas de adquisición de OSIS, una cámara CCD (Hamamatsu, ORCA AG), y una cámara de calentamiento (Harvard Apparatus). Cell se colocaron en cámaras especiales que contienen 2 ml de la grabación (solución 5% Hanks equilibrada de sal, 0,5% de glucosa, suero bovino fetal al 1%, Hepes 20 mM, y Glutamax 2 mM, pH 7,3) medio y la imagen con el sistema ESD utilizando una 60x 1,42 NA objetivo de inmersión en aceite. imágenes de proyección máximas se obtuvieron y se procesaron utilizando el software Metamorph y Adobe Photoshop
análisis estadísticos
Los resultados se analizaron mediante la prueba χ2 y P & lt;.. 0,05 fue considerado significativo
Resultados
El crisotilo dependiente de la concentración aneuploidía después de la recuperación en medio
hK2 células cultivadas sin fibra fueron tratados con tres diferentes concentraciones de crisotilo, y después se dejó recuperarse en medio libre de fibra para 2, 4 y 8 días. contenido de ADN nuclear se cuantificó por análisis de imagen y se agruparon los núcleos en las cinco clases siguientes: hypodiploid (contenido de ADN ≤1.49 C), diploide (contenido de ADN entre 1,5 C y 2.39 C), hiperdiploide (contenido de ADN entre 2,4 C y 3.59 C) , tetraploide (contenido de ADN entre 3.6c y 5.1C) y hipertetraploides (contenido de ADN & gt; 5.1C). (Tabla 1)
el crisotilo tratamiento dio lugar a una formación dependiente de la concentración de núcleos hipertetraploides (también llamada núcleos aneuploides). Después de 48 h de tratamiento crisotilo seguido de 2 días de recuperación en medio libre de fibra, se midió la frecuencia de aneuploidía. En las células tratadas con la concentración más alta crisotilo (250 mg /ml), 7% de las células eran aneuploides, mientras que los tratados con la concentración intermedia de crisotilo (125 g /ml) muestra 4,5% aneuploidía; la concentración crisotilo más baja (62,5 mg /ml) dio lugar a 3,5% aneuploidía, que fue mayor que la frecuencia de aneuploidía en las células de control (0,25%). Cuando se analizaron después de tiempos de recuperación más largos, la frecuencia de núcleos aneuploides aumentó, alcanzando 10,5% en las células tratadas con 250 g /ml de crisotilo seguido de 8 días de recuperación. Las células tratadas con 125 mg /ml y 62,5 g /ml de crisotilo y se dejaron recuperar durante 8 días presentados tasas de aneuploidía de 5,9% y 4,67%, respectivamente (Tabla 1, Fig. 1). Contenido
ADN nuclear de control de HK2 y el crisotilo (250 g /ml, 125 mg /ml o 62,5 mg /ml) células tratadas (por 48 h) permite la recuperación en medio libre de fibra de 2, 4 u 8 días se cuantificó, y los núcleos con contenido de ADN & gt; 5,1 C se consideraron aneuploides. Los porcentajes que se muestran son de fondo (el porcentaje de aneuploidía en las células de control, 0,25%) - resta. crisotilo tratamiento dio lugar a aneuploidía que persistió después de 8 días de recuperación (P & lt; 0,001).
Después de 48 h de exposición al crisotilo seguido de 2 días de recuperación, la población aneuploides se compone sobre todo de BI y multinuclear Células. Sin embargo, después de los tiempos de recuperación más prolongados en el medio libre de la fibra (4 y 8 días), los núcleos aneuploides eran en su mayoría en las células mononucleares (Tabla 2).
alteraciones del ciclo celular después del tratamiento crisotilo
El ciclo celular en células de control y hK2 en las células tratadas con el crisotilo durante 48 h seguido de 2, 4 y 8 días de recuperación en medio libre de fibra se analizó por citometría de flujo. Los tratamientos se llevaron a cabo con una sola concentración crisotilo (125 g /ml).
eventos del ciclo celular se clasificaron como hypodiploid /apoptótica, G1, S, G2 /M y las células hipertetraploides. De manera similar a los experimentos con la cuantificación de ADN, el grupo diploide se determinó de acuerdo con el pico de células G0 /G1 en los histogramas.
En los histogramas, la primera alteración crisotilo inducida notable en el ciclo celular era un aumento en la formación de células hypodiploid /apoptótica. Sin embargo, la frecuencia de estas células se redujo después de un largo período de recuperación, alcanzando el valor de control después de 8 días de recuperación (Tabla 3).
células tratadas con crisotilo exhibieron un número de 12% menor de G1 células comparación con las células de control, y también mostraron un 5% mayor número de células G2 /M que hizo las células de control (Tabla 3). Estas diferencias se producen independientemente de la duración del período de recuperación, y fueron más pronunciados después de períodos de recuperación más largos. Cuando se evaluó el número de células en la fase S, no se observó ninguna diferencia entre el control y las células de crisotilo tratados (Fig. 2, A).
Las células tratadas con el crisotilo y dejaron recuperar durante 2, 4 o 8 días en medio libre de la fibra se analizaron por citometría de flujo y por inmunofluorescencia. A) Histogramas en lineal (rojo) y log (color) escalas de citometría de flujo mostrar los efectos de chysotile sobre el ciclo celular, específicamente un aumento en el número de G2 /M y las células hipertetraploides; B) las células de crisotilo tratados recuperados para 2 y 4 días muestran un aumento en el número de células en metafase y una disminución de células en la anafase y telofase comparación con las células de control (P & lt; 0,01 para 48 h y P & lt; 0,001 para 4 días) .
índice mitótico de las células control y tratadas con hK2 crisotilo se cuantificó mediante inmunofluorescencia. Análisis de índice mitótico mostró que el número total de células en la fase M fue similar en el control y las células tratadas con crisotilo. Sin embargo, en las células de control, el número de células en la anafase y telofase fue mayor que el número de células en metafase, mientras que después de 48 h de tratamiento crisotilo seguido de 2 a 4 días de recuperación, el número de células en metafase fue mayor que el número de células en la anafase y telofase. Después de 8 días de recuperación, el número de células en metafase fue similar en células de crisotilo tratados y de control (Fig. 2, B).
HK2 y morfología de las células VERO y la presencia de fibras de crisotilo
control y células tratadas con hK2 crisotilo se analizaron mediante escaneo láser microscopía confocal, después del marcaje de inmunofluorescencia de los microtúbulos, filamentos de actina y los núcleos. Las fibras de crisotilo se visualizaron por su autofluorescencia (ver detalles en [13]). La presencia de células multinucleadas y micronucleadas, mitosis anormal y fibras se analizó y cuantificó
Después de 24 h y 48 h de tratamiento crisotilo, se observaron fibras largas interactuar con la superficie celular HK2 y los filamentos de actina.; algunos pequeños fragmentos de fibras también se detectaron en el interior de las células (Fig. 3, A). No se observaron alteraciones en cultivo celular, tales como un mayor número de células bi- y multi-nucleadas, micronucleadas y apoptóticos. El número de células con mitosis multipolar también aumentó, alcanzando el 7,23% de todas las células que se dividen después de 48 h de exposición al crisotilo (en el control de un 2,37% de todas las divisiones celulares eran multipolar) (Fig. 3, B).
Las células fueron procesados por inmunofluorescencia para visualizar los núcleos, los filamentos de actina y los microtúbulos, y fibras de crisotilo fueron observados por su autofluorescencia. A) Las imágenes confocales de hK2 células tratadas con crisotilo durante 24 h o 48 h que muestra las fibras largas y gruesas, que interactúan con las células y mitosis multipolar; B) se analizaron las alteraciones en la morfología celular, y después de 24 h o 48 h de tratamiento crisotilo, el número de binucleadas y células multinucleadas aumentó, así como el número de células micronucleadas, células apoptóticas y células en mitosis multipolar (P & lt; 0,001) .
Después de 48 h de tratamiento crisotilo, seguido de un período de recuperación similares, células multinucleadas, la mitosis anormal y no se observaron fibras largas y pequeñas crisotilo dentro de las células (Fig. 4, a). Un análisis posterior mostró que las células se dejaron recuperar durante largos períodos contenían menos fibras; fibras de crisotilo y fragmentos de fibras pequeñas se observaron en la región perinuclear de las células después de 4 días de recuperación, mientras que después de 8 días de recuperación no había fibras largas y unos pequeños fragmentos de fibras dentro de las células (Fig. 4, A). Después de 4 días de recuperación, el número de células bi /multinucleadas disminuyó pero era todavía más alto que en las células control, sin embargo el número de células en mitosis multipolar y micronúcleos se aumentaron (Fig. 4, B). Después de 8 días de recuperación, la morfología celular de las células de crisotilo tratados parecía a la de las células de control, que comprendía mononucleadas células, las células en mitosis bipolar y pocas células apoptóticas y micronucleados. El número de células en mitosis multipolar disminuyó en comparación con la de las células se dejaron recuperar durante 4 días; Sin embargo, en las células tratadas con crisotilo, hubo más casos de la mitosis multipolar que los que había en las células control (Fig. 4, B).
Las células fueron examinadas usando inmunofluorescencia para visualizar los núcleos, los filamentos de actina y los microtúbulos , y las fibras de crisotilo se observaron por su autofluorescencia. A) Las imágenes confocales de células hK2 de control y células tratadas con el crisotilo durante 48 h y se dejaron recuperar durante 2 días, 4 días o de 8 días, que muestra la morfología celular y la presencia de fibras de crisotilo. Después de 2 días de recuperación, se observaron fibras largas para interactuar con la superficie de las células; sin embargo, después de 4 y 8 días de recuperación, sólo se observaron fragmentos de fibras; B) las alteraciones en la morfología celular se cuantificó, y después de 48 h de tratamiento crisotilo y 4 días de recuperación, el número de células bi /multinucleadas y células apoptóticas disminuyó, pero era todavía mayor que los controles (P = 0,30 para bi /multinucleadas tras 4 días y P = 0,05 para las células apoptóticas). El número de células en el grupo micronucleadas crisotilo tratados se mantuvo mayor que en el grupo control (P & lt; 0,001 después de 4 días), y el número de células en mitosis multipolar fue mayor (P & lt; 0,001). Después de 8 días de recuperación, el número de células en mitosis las células multipolares se mantuvo más alta que en las células control (P = 0,02).
Para determinar si las células normales serían similarmente responder a crisotilo, cultivos de células VERO fueron expuestos a las fibras de crisotilo durante 48 horas y se les permitió recuperarse durante 24 h en medio libre de fibra, y luego se procesaron mediante inmunofluorescencia para analizar la morfología celular. Las células de control compone principalmente células (99,29%) mononucleadas, con células raras micronúcleos (1,55%) y sin mitosis anormales. Después del tratamiento crisotilo, se observaron células BI /multinucleadas y micronúcleos en mayor número que en las células control (6,34% y 3,89% respectivamente), y también se observaron mitosis multipolar y la citocinesis resultante en tres células hijas (7,18% de todas las divisiones celulares) ( la Fig. 5, a y B).
las células se examinaron utilizando presentado a inmunofluorescencia para visualizar los núcleos, los filamentos de actina y los microtúbulos, y fibras de crisotilo fueron observados por su autofluorescencia. A) Las imágenes confocales de células control y células tratadas con el crisotilo durante 48 h y se dejaron recuperar durante 24 h, mostrando la morfología celular y la presencia de fibras de crisotilo. Después de la recuperación, se observaron fibras largas para interactuar con las células, y las células multinucleadas, se observaron células micronucleadas y células en mitosis multipolar; B) las alteraciones en la morfología celular se cuantificó, y el tratamiento crisotilo hecho aumentar el número de células, células micronucleadas BI /multinucleadas, células apoptóticas y células en mitosis multipolar (P & lt;. 0.001)
Time- lapso de microscopía: destino de las células mitóticas anormales y la formación de los centrosomas múltiples
Para disco giratorio de lapso de tiempo microscopía confocal, hK2 células fueron transfectadas con GFP-etiquetados α-tubulina. Se observó cada célula transfectada por un período de 2 a 3 h. Cuando se descubrió que una célula de control en la metafase, que se iban alcanzando la anafase y telofase alcanzó en 30 a 100 minutos. Todas las divisiones observados en las células de control fueron bipolar (Fig. 6, A). Por el contrario, cuando se observaron las células tratadas con crisotilo, en torno al 40% de metafases fueron multipolar. Análisis de la suerte de 30 de estas células reveló patrones diferentes; cada uno de ellos se observó al menos dos veces.
Las células transfectadas con GFP-etiquetados α-tubulina se trataron con crisotilo durante 24 o 48 horas y después se observaron por lapsos de tiempo de disco giratorio microscopía confocal. Las células se observaron en la metafase de 2 a 3 h. A) Una serie temporal de imágenes de proyección máximas que muestran una mitosis bipolar que generó sólo dos células hijas después de 1 h en un cultivo de control; B) una serie temporal de imágenes de proyección máximas que muestran una mitosis tripolar de una cultura crisotilo tratados que no progresan a través de la fase M; C) una serie temporal de imágenes de proyección máximas que muestran una célula crisotilo tratados que los polos del huso organizado de una manera tripolar y progresó a la anafase y telofase la generación de tres células hijas; D) una serie temporal de imágenes de proyección máximas que muestran la citocinesis en una celda de crisotilo tratados, generando tres células hijas que adquirieron la morfología de la interfase; E) una serie temporal de imágenes de proyección máximas de una célula crisotilo-tratado que entró en la anafase generar cuatro células hijas; Sin embargo, las células se fusionaron y formaron durante la telofase sólo dos células hijas.
Cerca de la mitad de las células en metafase multipolar no avanzó a la anafase durante el período de observación, que queda en la metafase con pseudo-bipolar, tripolar o husillos cuadripolares (Fig. 6, B). En estos casos, los microtúbulos eran dinámicos, y los polos del huso estaban más dinámico cuando agrupados en husillos seudo-bipolar. Las células en metafase multipolar también se sometieron a la muerte celular, como lo demuestra la fuga del citoplasma se observa en el canal de la luz transmitida.
Algunas células en metafase multipolar después del tratamiento crisotilo también avanzó a la anafase, telofase y citocinesis. metafases tripolares generaron tres células hijas unidas por dos midbodies con la organización de microtúbulos similar a la observada en las células control (Fig. 6, C). Las tres células hijas permanecido separada y adquirieron una morfología interfase 100 minutos después del comienzo de la citocinesis (Fig. 6, D), o fusionados durante la citocinesis. En estos casos, dos de las tres células hijas se fusionaron y vinculado al puente intercelular por dos estructuras de microtúbulos. La fusión celular también se produjo durante la telofase, hasta la formación de puentes intercelulares, por lo que dos células hijas estaban vinculados por un solo cuerpo central (figura 6, E.)
La formación de husos multipolares o múltiples centrosomas no se observó durante la mitosis.; todas las instancias de la metafase fueron anormales desde el inicio de la observación. Por lo tanto, se observaron las células en interfase para identificar alteraciones que pudieran estar relacionados con la amplificación centrosoma, que era responsable de la formación de husos multipolares en la fase M subsiguiente.
Las células se observaron en interfase con dos centrosomas, y los centrosomas acercado entre sí en lugar de migrar hacia los polos opuestos. Además, la red de microtúbulos de estas células se mantuvo similar a la interfase células y no forman husos. Otra situación que se observó después del tratamiento crisotilo fue la presencia de interfase con dos cuerpos centrosoma similar - estructuras localizadas en la región perinuclear de la célula donde se concentraron los microtúbulos. Estas estructuras parecen estar formada por puntos muy pequeños que se movieron durante todo el periodo de grabación. Además, la célula se mantuvo en interfase y no avanzar a la fase M (Fig. 7, A).
Las alteraciones que podrían estar relacionados con un número anormal de los centrosomas se observaron en las células tratadas con hK2 crisotilo de 24 o 48 h. A) Una serie temporal de imágenes que muestran una celda con dos como estructuras centrosoma que no progresan a la fase M como se esperaba para una celda con dos centrosomas; B) una serie temporal de imágenes que muestran dos células en interfase unidos por un puente intercelular sin una organización mitad del cuerpo. Las células se acercaron el uno al otro durante el período de observación, lo que refleja una regresión de la citocinesis.
Otro mecanismo responsable de la formación de los centrosomas adicionales en las células es la citocinesis fracaso. Este proceso toma demasiado tiempo para ser observado en el transcurso de los experimentos de lapso de tiempo que llevamos a cabo. Sin embargo, se observaron células en interfase unidos por un puente intercelular sin una organización de microtúbulos mitad del cuerpo, y las células se acercaron el uno al otro durante el período de observación (Fig. 7, B).
Discusión
El crisotilo es consideran menos perjudiciales para la salud humana que otros tipos de asbesto, debido a la falta de una fuerte asociación entre la exposición a la fibra de crisotilo y el desarrollo de carcinomas y mesoteliomas. Sin embargo, algunos estudios han demostrado el potencial del crisotilo para causar daños en el ADN y alteraciones celulares
in vitro
, y lesiones pulmonares
in vivo
. El presente trabajo analizó alteraciones celulares relacionados con aneuploidía y la interrupción del ciclo celular, y verificado que alteraciones persisten en cultivo después de 2, 4 y 8 días de recuperación en medio libre de fibra. Además, alteraciones en la morfología celular estaban relacionadas con la presencia de fibras en cultivo durante las primeras 24 h y 48 h de tratamiento crisotilo y también después de largos períodos de recuperación. También se analizó la mitosis multipolar y la amplificación del centrosoma, que son características adicionales de tratamiento crisotilo que están estrechamente relacionados con aneuploidía.
El análisis de hK2 células por microscopía confocal se produjo indicó que las fibras de crisotilo no persistieron en cultivo de células después de 8 días de la recuperación, y después de 4 días de recuperación sólo fragmentos y fibras pequeñas estaban presentes en la región perinuclear de algunas células. Además, después de 4 y 8 días de recuperación, la morfología celular parecía a la de las células de control con respecto a la presencia de células bi /multinucleadas y micronúcleos. Sin embargo, la población aneuploides persistió en cultivo de células después de 4 y 8 días de recuperación en medio libre de fibra, y los porcentajes de núcleos aneuploides eran siempre alrededor de 10% de la población total. Los datos proporcionados por la cuantificación de ADN también mostraron que los núcleos aneuploides eran en su mayoría en las células mononucleadas después de 4 y 8 días de recuperación, mientras que durante los primeros días de la recuperación de los núcleos eran aneuploides en las células bi /multinucleadas. Todas estas observaciones están de acuerdo con los datos proporcionados por citometría de flujo, lo que indica que las células hK2 crisotilo tratados mostraron una mayor hipertetraploidy incluso después de 8 días de recuperación.
La presencia de células aneuploides es una consecuencia del tratamiento observado crisotilo después de 48 h de exposición, que persiste incluso después de 72 h de recuperación tras el tratamiento [11], [13]. Estas células podrían estar relacionados con el desarrollo del cáncer, debido a que la pérdida o ganancia de un cromosoma - o una parte del mismo - se pueden introducir mutaciones necesarias para la transformación maligna. Mostramos en este estudio que la inducción de aneuploidía en las células es crisotilo dependiente de la concentración, y como se describe anteriormente, que el porcentaje de células aneuploides se mantuvo alta en comparación con células de control después de hasta 8 días de recuperación en medio de cultivo libre de fibras.