Extracto
El anticuerpo monoclonal (McAb) es la herramienta clave para el inmunodiagnóstico del cáncer e inmunoterapia. inmunoterapia basada en McAb que se dirige a los antígenos tumorales ha tenido gran achivement. En este estudio, un clon celular que mantiene la secreción de alto título de tipo IgG1 McAb NJ001 llamado contra el cáncer humano no pequeñas de pulmón de células se obtuvo de células (NSCLC). El título de NJ001 purificado fue de 2 × 10
6. El SP70 antígeno llamado de NSCLC identificados específicamente por NJ001 fue demostrado ser una proteína con la masa molecular relativa (Mr) de 70 kDa. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica indicaban que NJ001 pudiera reaccionar positivamente a NSCLC, pero débil positiva o negativamente reaccionan con el cáncer humano de células pequeñas de pulmón (SCLC), pseudotumor pulmonar y otros tumores epiteliales. Ensayo de agar blando, la eficiencia de formación de colonias en grupos NJ001 disminuyó de una manera dependiente de la dosis. Para la concentración de 100 g /ml, 200 mg /ml y 400 mg /ml, la relación de la inhibición de la formación de colonias era 23,4%, 62,5% y 100%, respectivamente. Mientras tanto, NJ001 causó reducción significativa en el volumen del tumor y el peso del tumor en comparación con los ratones de control en el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón. La relación de inhibición del crecimiento tumoral en 200 mg, 400 mg y 800 mg grupos NJ001 era 10,44%, 37,29% y 44,04%, respectivamente. NJ001 también dio lugar a cambios cytomorphological e indujo la apoptosis de las células de adenocarcinoma de pulmón línea humana SPC-A1 significativamente. El recién desarrollado NJ001 reaccionó selectivamente a NSCLC y mostró actividad antitumoral tanto
in vitro
y
in vivo
. NJ001 es de gran valor en relación con el inmunodiagnóstico e inmunoterapia para el NSCLC y mantiene la promesa de una mayor investigación en relación con la progresión tumoral mecanismo subyacente de NSCLC
Visto:. Pan S, Wang M, Huang P, T Xu, Zhang L, Xu J, et al. (2012) El Estudio sobre el nuevo desarrollo McAb NJ001 específico para células no pequeñas de cáncer de pulmón y sus características biológicas. PLoS ONE 7 (3): e33009. doi: 10.1371 /journal.pone.0033009
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Noviembre, 2011; Aceptado: February 2, 2012; Publicado: 30 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Pan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30972821, 30901344 y 30901262), Key Medicina de Laboratorio de la provincia de Jiangsu de China, prioridad Académica Programa de Desarrollo de instituciones de educación superior de Jiangsu. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es uno de los cánceres más prevalentes y es la principal causa de muerte por cáncer debido a la falta de un enfoque de detección validado o eficaz para la detección precoz. Esta carga de salud pública es evidente en todo el mundo con las muertes relacionadas con el cáncer de pulmón de 1,5 millones en 2010 [1]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es responsable de más del 85% de cáncer de pulmón y la mayoría de los pacientes con NSCLC con enfermedad avanzada al momento del diagnóstico. La tasa de supervivencia a cinco años para los de mama, colon y cáncer de próstata, en los que las pruebas de detección están disponibles, es de cuatro a seis veces más largo que el cáncer de pulmón. La morbilidad alta /mortalidad y el fracaso para lograr un resultado diagnóstico precoz en el pronóstico sombrío [2], [3].
Las terapias para el cáncer de pulmón se basan principalmente en los modos tradicionales, como la resección quirúrgica, quimioterapia y radioterapia; sin embargo, el efecto curativo obtenido es menos que satisfactorio [4] - [6]. Recientemente, la inmunoterapia para el cáncer se ha convertido en un método utilizado como un seguimiento de la terapia tradicional. Los anticuerpos se están convirtiendo en una modalidad importante del fármaco debido a su alta especificidad y afinidad para objetivos. Más de dos docenas de anticuerpos monoclonales terapéuticos (anticuerpos monoclonales) están aprobados actualmente para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades humanas [7] - [9]. Identificación de nuevos antígenos mejorará aún más la inmunoterapia tumoral. la inmunoterapia basada en anticuerpos que se dirige a los antígenos tumorales o marcadores de superficie celular ha logrado cierto éxito como terapia contra el cáncer, incluyendo en NSCLC, con agentes tales como cetuximab, panitumumab, matuzumab, y trastuzumab [10] - [14].
En el presente estudio, hemos producido un anticuerpo monoclonal denominado NJ001, generada por la inmunización de ratones con antígeno de células vivas adencarcinoma pulmonar SPC-A1 humana. La actividad antitumoral de McAb NJ001 se exhibió tanto
in vitro Restaurant and i
n vivo
.
Resultados
Producción y Caracterización de NJ001
Tras la inmunización de ratones BALB /c con células de adenocarcinoma de pulmón humano, 3 líneas celulares de hibridoma monoclonales positivos (NM001, NM004, NM005) se confirmaron por repetido celular indirecto pruebas ELISA para producir continuamente anticuerpos y por lo tanto se seleccionaron para la expansión y reclonación. el número de cromosomas del cariotipo de cada hibridoma eran más de 95. La figura 1A fue el cariotipo de células de hibridoma NM001. Anticuerpos monoclonales purificados a partir de ascitis se adquirieron por Proteína A purificación por afinidad. El McAb de NM001 tenía el título más elevado entre los tres anticuerpos, llegando a 2 × 10
6. NM001 y NM004 mantienen secretoras de IgG1, tipo κ- McAb, mientras NM005 secretada IgG2b, tipo κ- McAb.
(A) Cariotipo de la línea celular de hibridoma NM001 (× 400). (B) Actividad de unión de los anticuerpos monoclonales para maligant humana y células nonmaligant en cultivo. sobrenadantes sin diluir de hibridomas NM001, NM004, NM005 se ensayaron por triplicado con células de ELISA indirecto como se describe en "Materiales y Métodos". Cada número representa la absorbancia media del producto final sustrato a 450 nm. Controles sin anticuerpos monoclonales exhiben una absorbancia media de 0,02. NM001 fue seleccionada para el estudio adicional, ya que exhibió la mayor proporción de unión con células tumorales de pulmón y la mayor especificidad para las líneas celulares de cáncer de pulmón en comparación con las otras líneas de células tumorales. (C) Análisis de transferencia Western para la reacción de NJ001 produce a partir de NM001 hibridoma con células diferentes (maligant humano y células nonmaligant) en cultivo. (Carril 1, SPC-A1; carril 2, A549; carril 3, NCI-H520; carril 4, NCI-H460; carril 5, HepG2; carril 6, ZR-75-30; carril 7, COLO 205; carril 8, WI-38; carril 9, CMSP, el carril 10, marcador). GAPDH se utilizó como control de carga. Los resultados indicaron que la expresión de la proteína era específico para NJ001 anticuerpos en líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas, no en otras líneas celulares de cáncer y las células normales. (D) resultados positivos y negativos representativos obtenidos a partir del análisis IIF de reacción de NJ001 con diferentes células observadas por fluorescencia y análisis de microscopía confocal (× 400). (A, SPC-A1, b, ZR-75-30; c, HepG2, d, WI-38). Presencia de NJ001 puede ser visualizado en el citoplasma celular de células SPC-A1, pero otras líneas celulares no mostró fluorescencia. La localización del antígeno específico para NJ001 puede ser en el citoplasma celular de células SPC-A1.
Cada McAb se caracterizó por los resultados de la unión a un panel de células normales y malignas que figuran en la Figura 1B. Por análisis ELISA, se determinó que anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma NM001, NM004 y NM005 mostraron proporciones de unión mayor con las líneas celulares de cáncer SPC-A1, A549, NCI-520 y NCI-H460, pero expusimos proporciones generalmente más bajos de unión en el CPCP línea celular NCI-H446, otras líneas celulares cancerosas y normales. NJ001, producido por la línea celular de hibridoma NM001, fue seleccionada para el estudio adicional, ya que exhibió la más alta especificidad para las líneas celulares de cáncer de pulmón en comparación con otras líneas celulares tumorales.
Los resultados del análisis de Western blot fueron consistentes (Figura 1C) . Sólo pudimos detectar la expresión de la proteína llamada SP70 específico para NJ001 en líneas celulares de cáncer, pero no en otras líneas celulares de cáncer y las células normales.
Resultados de inmunofluorescencia indirecta se muestran en la Figura 1D. SP70, reconocido por NJ001, fue localizado en el memberane celular y el citoplasma celular de las células SPC-A1, mientras que las otras líneas celulares no mostraron fluorescencia.
Análisis inmunohistoquímico
Los resultados del análisis de inmunohistoquímica mostró que la expresión de la SP70 era fuerte positivo en el tejido de adenocarcinoma de pulmón y el tejido de cáncer escamoso de pulmón (Figura 2A, 2B), mientras que se observó una expresión débil positiva o negativa en el tejido de SCLC, carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de ovario y de hígado cáncer (Figura 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H). SP70 no se ha encontrado en los tejidos de seudotumor pulmonar y tejidos pulmonares nontumourous adyacentes (Figura 2I, 2J)
zonas representativas de secciones tumorales de adenocarcinoma (A) NSCLC de pulmón.; (B) NSCLC cáncer escamoso de pulmón; (C) SCLC; (D) El carcinoma de mama; (E) El cáncer gástrico; (F) El cáncer de colon; (G) El cáncer de ovario; (H) El cáncer de hígado; (I) seudotumor pulmonar; (J) adyacente tejidos pulmonares nontumourous.
expresiones SP70 en el tejido de adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón escamoso, SCLC, carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de hígado, pulmonar y pseudotumor adyacente pulmón nontumourous eran 58/58, 48/48, 2/21, 3/21, 1/5, 0/5, 0/5, 1/5, 0/25 y 0/8, respectivamente (Tabla 1).
Efectos inhibitorios de NJ001 sobre SPC-A1 proliferación y la formación de colonias
el efecto de NJ001 sobre la proliferación de células SPC-A1 se evaluó a través de un [
3H ] ensayo de proliferación de timidina. En comparación con las células tratadas de control, el nivel de proliferación de las células tratadas NJ001 SPC-A1 se redujo significativamente después de 48 h y 72 h (
P Hotel & lt; 0,001,
P Hotel & lt; 0,001) (Figura . 3 células)
en comparación con las células tratadas de control, el nivel de proliferación de NJ001 tratada SPC-A1 disminuyeron significativamente después de 48 h y 72 h (**
P
& lt; 0,001).
células SPC-A1 se sembraron en una matriz de agar blando, se trató con NJ001 o MCA2849 (irrelevante McAb) (0, 100, 200, 400, 800, o 1.000 mg /ml) y se incubaron a la condición de 37 ° C con 5% de CO
2. Después de 14 días, se contó el número de colonias y las imágenes representativas se obtuvieron (Figura 4). Como se muestra en la Tabla 2, NJ001 inhibió la formación de colonias de una manera dependiente de la dosis, exhibiendo relación de inhibición 23,4% a /mL, relación de inhibición 100 g 62,5% a 200 mg /ml. Cuando la concentración alcanzó 400 mg /ml o superior, no hubo colonias mayor de 50 células, que muestra una relación de inhibición de 100%. Sin embargo, MCA2849 no inhibió la formación de colonias de SPC-A1.
Las suspensiones de células (2 × 10
4 células) mezclado con 0,3% de agarosa y diferentes concentraciones de NJ001 o MCA2849 se dispusieron en capas sobre la la parte superior de los medios de cultivo en placas de cultivo de 6 pocillos y se dejaron crecer durante 2 semanas antes se contaron las colonias. Se muestran imágenes de contraste de representación. (A) 0 mg /ml NJ001, (B) 100 mg /ml NJ001, (C) 200 mg /ml NJ001, (D) 400 mg /ml NJ001, (E) 0 mg /ml MCA2849, (F) 100 g /ml MCA2849, (G) 200 mg /ml MCA2849, (H) 400 mg /ml MCA2849.
Estos resultados sugieren que la proliferación celular NJ001 SPC-A1 inhibe eficazmente
in vitro
.
Efectos inhibitorios de NJ001 en el adenocarcinoma de pulmón de ratón modelo de xenoinjerto humano SPC-A1
en el estudio preliminar, después de 3 semanas de la inoculación, se sacrificaron los ratones. Se extirparon los tejidos del sitio de inyección en el grupo de la incubación y los tumores en el grupo de control. La histopatología mostró ningún crecimiento del tumor en los tejidos del grupo de incubación y el crecimiento del tumor en los tejidos del grupo de control (Figura 5)
.
áreas representativas de secciones de tejido de los sitios de inoculación en el grupo NJ001 (A) y los tumores extirpados en grupo de control (B).
El resultado de
in vivo
experimento se muestra en la Figura 6A. La administración de NJ001 causado diversos grados de reducción en el volumen del tumor en comparación con los ratones de control tratados con solución salina. Los volúmenes de los tumores en el grupo de NJ001 400 mg y 800 mg fueron significativamente menores en comparación con el grupo de control 17 días después de la inoculación; Además, la diferencia persistió hasta el final del tratamiento (
P
= 0,004,
P
= 0,003). Después de 3 semanas de tratamiento, los tumores se extirparon y se pesaron. En 200 mg, 400 mg y 800 mg grupos NJ001, el crecimiento del tumor [/C% (C-T)] relación de inhibición fue 10,44%, 37,29% y 44,04%, respectivamente. La relación de inhibición en 400 mg y 800 mg grupo NJ001 fue estadísticamente significativa en comparación con el grupo de control (Figura 6B,
P
= 0,032,
P
= 0,015). Al final de 3 semanas, el peso medio de los tumores en el grupo de 200 mg y 800 mg NJ001 era (1,51 ± 0,20) g y (0,94 ± 0,19) g, y la diferencia entre los dos tratamientos también fue estadísticamente significativa (
P = 0,048
).
(A) curva de crecimiento del tumor. Los animales fueron inyectados por vía subcutánea con 2 × 10
6 células SPC-A1 y por vía intraperitoneal inyectado con solución salina normal, 200 g, 400 g, o 800 g NJ001. Los volúmenes tumorales se midieron en intervalos de 4 días. Las barras de error representan la desviación estándar. (B) de peso medio del tumor en los grupos de anticuerpos y de control. Después de 3 semanas de tratamiento, los tumores se extirparon y se pesaron. Las barras de error representan la desviación estándar. *
P
& lt; 0,05 comparado con el grupo control. ∧
P
. & Lt; 0,05 en comparación con el grupo NJ001 200 mg
apoptosis de las células SPC-A1 inducidas por NJ001
Como se muestra en la Figura 7A, SPC células -A1 en el grupo NJ001 exhibieron una matriz marginados y condensada de la cromatina, así como la contracción y la formación de ampollas del citoplasma y núcleos fragmentados, que son características típicas de la apoptosis. En contraste, las células en ninguno de los grupos MCA2849 o grupo libre McAb mantuvieron una morfología normal y retienen una capacidad adecuada para proliferar.
células SPC-A1 se cultivaron con o sin 200 mg /ml NJ001 o MCA2849 durante 24 h y 48 h. (A) No se observaron cambios morfológicos en las células SPC-A1 con microscopio invertido (× 100). a, 24 h NJ001; b, 24 h MCA2849; c, 24 h McAb libre; d, 48 h NJ001; e, 48 h MCA2849; f, 48 h McAb libre. (B) La apoptosis se analizó por citometría de flujo. (C) Cada barra de la columna y el error representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (**
P Hotel & lt; 0,001). La cantidad de finales de la apoptosis se determinó como el porcentaje de Anexina V
+ /PI
+ células.
En comparación con el grupo y MCA2849 grupo libre McAb, los altos porcentajes de Anexina V
+ (tasa de apoptosis total) en el grupo NJ001 en el punto de las 24 y las 48 horas de tiempo (
P Hotel & lt; 0,001 para ambos puntos de tiempo). La diferencia de la tasa de apoptosis total en el grupo NJ001 entre 24 h punto de tiempo de 48 h punto de tiempo también fue estadísticamente significativa (
P = 0,002
, Figura 7B).
Como se muestra en la figura 7C, los porcentajes de Anexina V
+ /PI
+ células (finales tasa de apoptosis) en el grupo NJ001, grupo MCA2849 y grupo libre McAb eran 30,89%, 2,80% y 3,58% a las 24 h punto de tiempo, respectivamente. La tasa de apoptosis tardía en un paciente NJ001 era también más alto que los otros dos grupos a las 48 h punto de tiempo (
P Hotel & lt; 0,001,
P Hotel & lt; 0,001). Por otra parte, la tasa de apoptosis tardía en un paciente NJ001 aumentó significativamente después de 24 h (de 24 h a 48 h punto de tiempo) (
P Hotel & lt; 0,001).
NJ001 induce la apoptosis de SPC- A1 células de una manera dependiente del tiempo.
Discusión
la tecnología de hibridoma es una herramienta disponible que potencialmente pueden producir anticuerpos antitumorales e identificar nuevos antígenos tumorales. En los últimos años, se han realizado considerables progresos en la identificación de antígenos asociados a tumores reconocidos por anticuerpos monoclonales o anticuerpos de pacientes. En la actualidad, se han reportado más de 1.000 antígenos asociados a tumores [15] - [20]
En el presente estudio, 3 anticuerpos monoclonales fueron producidos a partir de 3 líneas celulares de hibridoma positivas monoclonales (NM001, NM004, NM005) que reaccionaron. en diversos grados a las células de cáncer de pulmón, células normales, y las otras líneas celulares de cáncer. McAb NJ001 fue seleccionada para el estudio adicional, ya que exhibe la relación de unión más alta con células de cáncer de pulmón y también exhibió la mayor especificidad para las líneas celulares de cáncer de pulmón en comparación con las otras líneas celulares de cáncer. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica indicaban que NJ001 pudiera reaccionar positivamente a NSCLC, pero débil positiva o negativamente reaccionar a de células pequeñas de cáncer de pulmón humano (SCLC), pseudotumor pulmonar y otros tumores epiteliales.
Además de la alta afinidad y la actividad antitumoral especificidad, NJ001 también exhibió tanto
in vitro
y
in vivo
. Se observó el efecto de NJ001 sobre la proliferación de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón SPC-A1. Los resultados de ensayo de agar blando mostraron que la eficiencia de formación de colonias en grupos NJ001 redujo de una manera dependiente de la dosis. El xenoinjerto se estableció mediante inyección subcutánea de células SPC-A1 y NJ001 se administró por vía intraperitoneal a 3 dosis diferentes. NJ001 causado diversos grados de disminución en el volumen del tumor y el peso del tumor en comparación con los ratones de control. Por otra parte, cuando se inyecta la misma cantidad de células SPC-A1 cultivadas con NJ001 durante 2 h en la misma forma, no hubo crecimiento del tumor en ratones desnudos. También se encontró que NJ001 indujo a los cambios cytomorphological e indujo significativamente la apoptosis de las células SPC-A1 en un modo dependiente del tiempo. Esto sugiere que la apoptosis celular inducida por NJ001 es potencialmente el mecanismo de la actividad anti-tumor. La inducción de la apoptosis está mediada a través de receptores de muerte, ya sea (una vía extrínseca), o en el nivel mitocondrial (una vía intrínseca) [21] - [23]. La identificación posterior de las vías de señalización de apoptosis en las células SPC-A1 tratados con NJ001 sería útil en la elucidación de los mecanismos por los cuales NJ001 hacen que la actividad antitumoral tanto
in vitro
y
in vivo
. Mientras que, los ensayos funcionales en nuestro estudio se llevaron a cabo sólo en las células SPC-A1 utilizados para generar NJ001. En el siguiente estudio, vamos a hacer más trabajo para observar el crecimiento efectos inhibitorios de NJ001 extenderse más allá de una única línea de células y dejar claro si la actividad biológica es específico de la línea celular probado ni representa una respuesta más generalizada NSCLC.
La importancia de antígenos tumorales reside en su utilidad terapéutica potencial de diagnóstico y [24] - [33]. Además, los antígenos tumorales también pueden proporcionar información sobre el pronóstico de los pacientes con cáncer [34]. Los antígenos asociados a tumores de cáncer de pulmón humano han sido reconocidos desde hace muchos años; Sin embargo, algunos informes han investigado los antígenos comunes o epítopos comunes de cáncer de pulmón [35], [36]. En este estudio, el antígeno que fue finalmente nombrado SP70 reconocido por NJ001 fue demostrado ser una proteína con una Mr de 70 kDa. La visualización de la unión mediante inmunofluorescencia indirecta NJ001 SP70 indicó que se encuentra en el citoplasma de SPC-A1. SP70 es un biomarcador potencial y diana terapéutica para la inmunoterapia de NSCLC.
Con el fin de explorar la función de NJ001 y la Ag correspondiente, se necesita más trabajo para evaluar la aplicabilidad clínica. Por otra parte, el matrimonio de identificación de objetivos con las tecnologías de mejora de anticuerpos en última instancia se traducirá en nuevas y mejores terapias para los pacientes de cáncer, proporcionando así un mayor apoyo en cuanto a la importancia del estudio continuo de NJ001 [7], [37] - [39].
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del animal Experimento del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing (Permiso Número: 19A5-2373). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Las células mononucleares (PBMC) de sangre periférica heparinizada se recuperaron de donantes adultos sanos de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing. Para el ensayo de inmunohistoquímica, tejidos de NSCLC (n = 106), los tejidos de SCLC (n = 21), tejidos de carcinoma de mama (n = 21), los tejidos de cáncer gástrico (n = 5), tejidos de cáncer de colon (n = 5), tejidos de cáncer de ovario (n = 5), tejidos de cáncer de hígado (n = 5), tejidos pseudotumor pulmonares (n = 25) y los tejidos nontumourous pulmonares adyacentes (n = 8) se obtuvieron del departamento de patología en el mismo hospital entre julio de 2009 y junio de 2010 .
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Tratamiento de sujetos Humanos de la primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Nanjing, y un consentimiento informado por escrito también se obtuvo de cada participante.
las células y líneas celulares
Diez líneas celulares humanas o culturas diferentes (que aparece en la Figura 1B) que representan diversos tejidos normales y neoplásicos se utilizaron para caracterizar los anticuerpos en este estudio. Todas las líneas celulares se adquirieron de banco de células de la Academia de Ciencias de China en Shanghai. líneas celulares de cáncer de pulmón humano SPC-A1, NCI-H520, NCI-H460 y NCI-H446, colon línea celular de carcinoma COLO 205 y la línea de células de pulmón fetal normal WI-38 se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% (v /v ) de suero fetal bovino (FBS) (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA). cáncer de pulmón de células A549 líneas humano, línea celular de carcinoma de mama ZR-75-30, línea celular de carcinoma de hígado HepG2 se cultivaron en RPMI1640 suplementado con 10% (v /v) de FBS. Las células mononucleares (PBMC) de sangre periférica heparinizada se recuperaron a partir de donantes adultos sanos (de la primera hospital afiliado de la Universidad Médica Nanjing) por Ficoll-Hypaque centrifugación en gradiente de densidad.
Generación de McAb
Monoclonal anticuerpos se produjeron como sigue. ratones BALB /c hembra de 6-8 semanas de edad por vía intraperitoneal fueron inmunizados con 1 × 10
6 células SPC-A1 tres veces en un intervalo de 3-4 semanas, a continuación, las células del bazo se hibridaron con ratones SP2 /0 (BALB /c mieloma línea celular) en el 50% de PEG-4000 (Sigma, EE.UU.) cultivadas en medio HAT en RPMI 1640 (Gibco, EE.UU.). Los sobrenadantes del cultivo fueron seleccionados para la reactividad de los anticuerpos a las células SPC-A1 WI-38 y el uso de una célula viva, en fase sólida ELISA. Las células diana (1 × 10
5) se sembraron por primera vez en 96 pozos y se incubaron durante 18 horas a 24 horas a 37 ° C en 5% de CO
2. El medio de crecimiento se aspiró y las células se fijaron durante 15 min a temperatura ambiente con 95% de etanol. Las membranas celulares se rompieron en Triton X-100 durante 20 minutos y las células se bloquearon a continuación con 5% de BSA durante 60 min a temperatura ambiente
.
Las células de hibridoma positivas se subclonaron usando una dilución limitante. células de hibridoma monoclonal con una alta valencia contra las células SPC-A1 se expandieron y retransfused en la cavidad abdominal de los ratones BALB /c para preparar las ascitis. Los anticuerpos monoclonales se purificaron más lejos de la ascitis a través de la proteína A de cromatografía de afinidad.
La célula de hibridoma positivos fueron tratados con colchicina. Después de Giemsa al 10% teñido, observamos células nucleares a medio plazo y analizado el cariotipo por el microscopio.
Caracterización de anticuerpos monoclonales
La composición de la cadena pesada y ligera de 3 anticuerpos monoclonales se determinaron utilizando la norma ISO Kit Strip (Santa Cruz Biotechnology, Inc, EE.UU.).
El alcance de anticuerpos monoclonales de unión a diversas células normales y malignas (enumerados en la Figura 1B) se determinaron con 0,1 ml de sobrenadante de cultivo de células de hibridoma positivas y 1 × 10
5 células diana utilizando ELISA para la detección descritos anteriormente, y la producción de sustrato se midió espectrofotométricamente a 450 nm.
indirecta Análisis de inmunofluorescencia
la inmunofluorescencia indirecta se realizó como sigue. Brevemente, las células fueron cultivadas a 80% de confluencia en cubreobjetos y después se fijaron en 95% de etanol a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las membranas celulares se rompieron en Triton X-100 durante 20 min y se bloquearon con 5% de BSA durante 60 min a temperatura ambiente, y después se incubaron con NJ001 purificada (1:80) a 37 ° C durante 1 h. Esto fue seguido por la incubación con FITC conjugado de cabra anti-IgG de ratón (1:100) durante 45 min a temperatura ambiente. Las diapositivas se counterstained con Hoechest. resultados de la tinción de inmunofluorescencia se obtuvieron usando fluorescencia y microscopía confocal (Zeiss LSM 710, Alemania).
Análisis de Western Blot
Con el fin de realizar el análisis de Western blot, las nueve líneas celulares estaban rotas inicialmente por el tampón de lisis RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,25% de Na-desoxicolato, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, 1 mg /ml de aprotinina, mM Na 1
3Vo
4 mM, NaF 1). A continuación, 25 g de proteína total a partir de las líneas celulares de nueve a electroforesis en un gel de SDS-PAGE 12%, y después se transfirió a una membrana de PVDF (Amersham Pharmacia Life Science, EE.UU.). Después de bloquear con leche no grasa al 10% en TBST, la membrana de PVDF se incubó con NJ001 (1:300) y un anticuerpo anti-GAPDH (Zhongshan Biológica, Beijing, China) durante la noche a 4 ° C para confirmar la carga equivalente de proteína en cada carril. Esto fue seguido por incubación con conjugado con HRP de cabra anti-IgG de ratón durante 1 h a temperatura ambiente. La membrana de PVDF se lavó adicionalmente 3 veces con TBST durante 15 min cada uno, y finalmente se desarrolló con ECL (Amersham Life Science) en la película de rayos X.
Inmunohistoquímica
tejidos de NSCLC (n = 106 ), los tejidos de SCLC (n = 21), tejidos de carcinoma de mama (n = 21), los tejidos de cáncer gástrico (n = 5), tejidos de cáncer de colon (n = 5), tejidos de cáncer de ovario (n = 5), tejidos de cáncer de hígado ( n = 5), tejidos pulmonares pseudotumor (n = 25) y los tejidos pulmonares nontumourous adyacentes (n = 8) se obtuvieron del departamento de patología en el primer hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Nanjing. tejidos de NSCLC incluyen tejidos de adenocarcinoma de pulmón (n = 58) y de células escamosas tejidos de cáncer de pulmón (n = 48). Las secciones de tejido se trataron con 0,3% de peroxidasa de hidrógeno durante 5 min, seguido de 30 min de bloqueo con suero normal de cabra a temperatura ambiente. NM001 (1:200) se aplicó a las secciones bloqueados y se incubó durante la noche a 4 ° C. Las secciones se incubaron durante 30 min a 37 ° C con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con HRP (1:2,000), y las señales positivas se visualizaron por el desarrollo en solución tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB). Las secciones fueron vistos bajo una cámara CCD Olympus Ax-70 DMC Es decir, conectado a un monitor de PC.
Ensayo de proliferación celular
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3H] timidina Ci /pocillo. Los ensayos de proliferación se realizaron mediante recuento de centelleo líquido de las células cosechadas. Los resultados de SPC-A1 medición proliferación celular se presentaron como el número por minuto (cpm).
Soft Agar Ensayo
formación
Colonia se analizó por el ensayo de agar blando. usando el, línea celular de adenocarcinoma de pulmón dependiente de anclaje SPC-A1 como un modelo de células tumorales, según los procedimientos de Hong KW [40]. En pocas palabras, una capa inferior de 0,5% de agarosa (Promega, U.S.A) que contiene de 2 ml de medio de cultivo se solidificó inicialmente en una placa de cultivo de 6 pocillos. A continuación, 2 ml de solución de agarosa 0,3% que contiene 2 × 10
4 células con diferentes concentraciones de NJ001 o MCA2849 (irrelevante McAb) (0, 100, 200, 400, 800, o 1.000 mg /ml) se dispuso en capas en la parte superior . Cada dosis se ensayó por triplicado. Después de incubación a 37 ° C con 5% de CO
2 ambiente durante 2 semanas, las colonias que contenían más de 50 células fueron contadas con un microscopio. La eficiencia de la formación de colonias y la relación de la inhibición de la colonia se calcularon como las fórmulas siguientes: la eficiencia de formación de colonias = (número medio de colonias /número medio de células por pocillo) x 100%; relación de inhibición de la formación de colonias = (1- número medio de colonias en NJ001 o grupo MCA2849 /número medio de colonias en McAb grupo libre) x 100%. Este experimento se repitió 3 veces.
antitetánica McAb (MCA2849) (ABD Serotec, Alemania) se utilizó como irrelevante McAb en este estudio.
xenoinjerto Experimento
Treinta BALB /c ratones desnudos hembra de 6 semanas de edad fueron adquiridos de Shanghai SLAC Animales de Laboratorio Co. Ltd. (Shanghai, china). Las células SPC-A1 se mantuvieron en medio RPMI1640 FBS 10% hasta que las células alcanzaron 80% de confluencia. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices de Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad de Medicina de Nanjing
.
En el estudio preliminar, las células SPC-A1 se incubaron con NJ001 a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora durante 2 h. Así, cada 200 l de solución salina contenía 2 x 10
6 células SPC-A1 y 400 mg NJ001. La axila lateral de 5 ratones desnudos, se inocularon por vía subcutánea con la solución, y el grupo de control, también compuesto por 5 ratones, se inyectó a las células SPC-A1 equivalentes en la misma posición. Después de tres semanas de la inoculación, los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron los tejidos para H & amp; E tinción
Los ratones se dividieron al azar en 4 grupos, con 5 ratones por grupo.. El xenoinjerto se estableció mediante inyección subcutánea de 2 x 10
6 células SPC-A1 /200 l por ratón en la axila lateral. Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal a 3 dosis diferentes (200 g, 400 g, o 800 g por ratón). El tratamiento se inició simultáneamente con la implantación y consistió en dos pasos: inyección diaria para la primera semana, seguido de inyecciones dos veces a la semana para el procedimiento de dos semanas. El grupo control recibió inyecciones de solución salina estéril en el mismo modo. Los animales fueron controlados por el tamaño del tumor a intervalos de 4 días. El volumen del tumor (mm
3) se calculó según la siguiente ecuación: Volumen = anchura
2 x longitud /2 [28], [41]. Todos los ratones se sacrificaron tres semanas después de la iniciación del tratamiento y los tumores se retiraron y se pesaron. la inhibición del crecimiento del tumor se calculó por la fórmula: Índice de inhibición del crecimiento tumoral = (peso 1-medio del tumor en el grupo NJ001 peso /medio de los tumores en el grupo control) x 100%. La toxicidad del tratamiento fue evaluada por la apariencia física de los animales
H & amp;. E tinción
Los tejidos obtenidos se fijaron en formalina al 10% y embebidos en parafina. Los tejidos embebidos se cortaron a continuación en secciones 4 micras y se colocaron en portaobjetos de vidrio para H & amp;. E tinción
Apoptosis Ensayo
células SPC-A1 se sembraron en una placa de 12 pocillos a 1 x 10
5 células por pocillo. Después de la incubación durante la noche, las células SPC-A1 se cultivaron con o sin 200 mg /ml NJ001 o MCA2849 durante 24 h y 48 h. Cada punto de tiempo se ensayó por triplicado. a continuación, se observaron los cambios morfológicos de las células y la tasa de apoptosis se determinó por citometría de flujo. En resumen, se recogieron las células, se lavaron con PBS y se resuspendieron en 500 l de tampón que contiene 10 mmol /L de HEPES-NaOH (pH 7,4), 140 mmol /L de NaCl, y 2,5 mmol /L CaCl
2 de unión. A continuación, se añadieron 5 l de anexina V-FITC (Bender MedSystems, Austria) y 5 l de solución de yoduro de propidio (PI) (Bender) y las células fueron incubadas en la oscuridad durante 15 min. La fluorescencia se analizó por citometría de flujo.