Extracto
La proteína p37 en la superficie de
Mycoplasma hyorhinis
células forma parte de un alto sistema de transporte de afinidad y se ha encontrado asociada con los animales y los cánceres humanos. Aquí mostramos en fibroblastos NIH3T3, p37 induce rápidamente la expresión de genes implicados en la inflamación y la progresión del cáncer. Esta activación de genes se debió principalmente a través del receptor Tlr4. La actividad se perdió de p37 cuando se eliminaron los C-terminales 20 aminoácidos o los cuatro aminoácidos específicos para el enlace de hidrógeno de pirofosfato de tiamina había sido reemplazada por valina. El bloqueo del receptor o la inhibición de la señalización de IL6 STAT3 produjo un aumento de la expresión del gen p37 inducida. . Dado que el cáncer asociado fibroblastos apoyar el crecimiento, invasión y metástasis a través de su capacidad para regular la inflamación relacionada con el tumor, la rápida inducción en fibroblastos de genes proinflamatorios por p37 podría esperarse para influir en el desarrollo del cáncer
Visto: Gomersall AC , Phan HA, Iacuone S, Li SF, Parroquia RW (2015) El
Mycoplasma hyorhinis
proteína p37 rápidamente induce genes en fibroblastos asociados con la inflamación y el cáncer. PLoS ONE 10 (10): e0140753. doi: 10.1371 /journal.pone.0140753
Editor: Yi-Hsien Hsieh, Instituto de Bioquímica y Biotecnología, TAIWAN
Recibido: 25 Junio, 2015; Aceptado: 30 de septiembre de 2015; Publicado: 29 de octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Gomersall et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: El CEL originales archivos para el análisis de microarrays y otros datos de apoyo han sido depositados en Figshare en http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1574136
Financiación:. ACG era un recipiente de un Premio de Australia de Postgrado .
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la proteína p37 fue descubierto por primera vez en la superficie de las células del sarcoma de ratón FS9 [1] . Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína p37 inhibieron el comportamiento invasivo de las células FS9 enfrentados por los fibroblastos de corazón de pollo [2]. Se encontró que la proteína p37 ser de
Mycoplasma hyorhinis
y forman parte de un sistema de transporte de alta afinidad de tres proteínas [3]. Estas proteínas son muy similares a los sistemas de alta periplásmico de transporte afinidad de unión de bacterias Gram negativas. La p37 N-terminal posee la secuencia de aminoácidos C-S-N requerido para una extensión de lípidos glicérido-cisteína N-terminal que se inserta en la membrana por micoplasma [4]. Cuando
M
.
hyorhinis
estaba presente, Rat-1 células y FS9, L929 y NIH3T3 fibroblastos de ratón toda invadido fibroblastos cardíacos de pollo en el ensayo de explante confrontado [5]. Si los anticuerpos monoclonales específicos-p37 se añadieron al ensayo se inhibió el comportamiento invasivo.
El descubrimiento de invasividad celular p37 inducida sugirió que
M
.
hyorhinis
infección podría desempeñar un papel en el desarrollo del cáncer.
M
.
hyorhinis
infección se ha encontrado posteriormente ser asociados con cánceres humanos y animales, incluyendo varios carcinomas [6], así como el cáncer de ovario y la metástasis de los ganglios linfáticos [7].
M
.
hyorhinis
infección se correlaciona con la metástasis y predice pobre supervivencia de pacientes con cáncer gástrico [8]. Fareed et al. analizado la respuesta inmune de los pacientes inmunizados intralinfática con células tumorales y se encontró pacientes que muestran regresión tumoral tenían un título mensurable de anticuerpos contra una proteína de 38 kDa [9]. Ilantzis et al. confirmado la proteína a p37 [10]. La proteína p37 se ha encontrado asociada con carcinomas gástricos humanos y los tumores de próstata [11, 12]. El uso de un anticuerpo dirigido el N-terminal de p37, la proteína se identificó en los carcinomas gástricos, de colon, de esófago, de pulmón, de mama y de glioma, así como en las células tumorales circulantes de pacientes con carcinoma hepatocelular [6, 13].
la adición de p37 con el carcinoma gástrico humano células (AGS) aumentó la migración en un transwell (Matrigel) de ensayo [11]. El tratamiento de las líneas de cáncer de próstata PC-3 y DU145 con p37 también aumentó su invasividad a través de Matrigel [14]. La inclusión de un anticuerpo monoclonal específico p37 inhibe esta invasión. El nivel de la metaloproteinasa 2 (MMP-2) se incrementó en los medios de p37-tratada y
p37
transfectadas las células AGS [11]. Goodison et al. sugerir el aumento de la invasividad puede representar una tasa de migración después del tratamiento p37 mayor en lugar de aumento de la capacidad para degradar el Matrigel [15]. También se encontró que el tratamiento para aumentar el P37
factor de necrosis tumoral α gratis (
TNFa)
la transcripción de genes y los niveles de TNF en los medios de las células mononucleares de sangre periférica humana [16].
diversas infecciones por micoplasmas se han asociado con el cáncer y la artritis en animales y humanos. Por ejemplo, la infección de células hematopoyéticas 32D con
M
.
fermentans
o
M
.
penetrans
durante 4-5 semanas inducidas transformación maligna y cuando se inyectan en ratones desnudos las células rápidamente formaron tumores [17].
M
.
hyorhinis
,
M
.
pneumoniae
,
M
.
hominis
,
M
.
fermentans
,
M
.
penetrans
y
M
.
arthritidas
han sido implicados en la artritis humana [18-21].
M
.
fermentans
produce artritis aguda en conejos [21].
M
.
hyorhinis
infección también se asocia con Poliserositis y la artritis de la especie porcina [22].
El objetivo de los trabajos aquí fue identificar los genes cuya expresión se activa rápidamente después del tratamiento con p37 de fibroblastos NIH3T3
in vitro
. NIH3T3 células fueron escogidos ya que son una línea de fibroblastos estándar que ha demostrado su utilidad para el estudio de enfermedades humanas incluyendo receptor de membrana cancer.The (s) responsable de la activación de genes eran también ser identificado.
Métodos
construcción de plásmidos
construcción del plásmido se realizó mediante la clonación de enzimas de restricción estándar. El
p37
gen se insertó en el
Bam HI
sitio de corte de la pRSET Un vector de expresión derivado de pUC. (Invitrogen, Cat#V351-20) (Fig S1 A)
p37 truncado se construyó utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para introducir el
Bam HI y
Nco
sitios de corte de restricción que flanquean el
gen p37
. Los cebadores inversos (S1 Tabla) introdujeron un
Nco
sitio de corte de restricción que en varios puntos a lo que facilitó la producción de secuencias de ADN que redujeron el tamaño de la proteína p37 en 20, 60, 80 ó 105 aminoácidos. Los productos de PCR fueron digeridos con la
Bam HI y
Nco
enzimas de restricción I y se ligó en el pRSET derivado de pUC Un vector de expresión (Invitrogen; Cat#V351-20) (S2 Fig) .
mutagénesis dirigida
la mutagénesis del gen que codifica p37 se realizó utilizando el mutagène fagémido
in vitro
kit de mutagénesis in (Bio-Rad; Cat#170-3581) . Los oligonucleótidos se suministran en la Tabla S2
Los cuatro aminoácidos S255, F256, S257 y K258 en p37 se cambiaron a la valina utilizando el kit QuikChange II XL mutagénesis dirigida (Agilent Technologies, Cat#200521). Y el método de diseño de cebadores desarrollado por Zheng et al. [23]. Se utilizaron dos reacciones en cadena de la polimerasa para llevar a cabo las mutaciones; los respectivos cebadores directo e inverso se muestran en la Tabla S3 y análisis de la secuencia en S3 Fig. La temperatura óptima de hibridación del cebador se estableció como 56,4 ° C.
Expresión de proteínas y aclaración
La expresión de la proteína p37, p37 proteínas truncadas (p37-20, p37-60, p37-80 y p37-105) y la proteína p37 mutada se completó en células OneShot®BL21 (DE3) (Invitrogen; Cat#C6000-03). Las células se cultivaron en caldo Luria-Bertani (LB) que contiene 100 mg ml
-1 ampicilina y se indujeron con IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido) a una concentración final de 1 mM durante 4 horas a 37 ° C con agitación . se recogieron y se resuspendieron en tampón de lisis de células inducidas (mM NaH 50
2 PO
4, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, 1 mg ml
-1 lisozima, pH 8,0) que contiene un completo, mini inhibidor de la proteasa la tableta de cóctel (Roche; Cat#11836153001). lisados crudos se obtuvieron por tratamiento con ultrasonidos (6 ciclos, intervalos de 30 segundos), seguido de agitación durante 30 minutos a 4 ° C. El lisado se clarificó por centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos a 4 ° C y se agruparon mediante filtración a través de un filtro de 25 micras.
Arginina remojo proteína aclaración
Las concentraciones más altas del p37 péptidos truncados eran ubicada en la fracción insoluble de la
E
.
coli
lisado y así aumentar los rendimientos de p37 soluble en una arginina empapa se empleó el método (argSOAK). péptidos truncados se solubilizaron con un 1 M arginina remojo antes de la purificación mediante el método descrito por Tsumoto et al. [24]. p37 nativo también fue purificado utilizando el 1 M arginina remojo para asegurar el método no inactivar la proteína
Purificación de proteínas
Purificación de proteínas se logró utilizando Profinity
TM IMAC resina (BioRad.; Cat#156-0123) con desviaciones de la fabricación del protocolo.
Dos ml de la Profinity
TM IMAC resina se añadió por cada 25 ml de lisado aclarado preparado. Para permitir la unión de la proteína de la mezcla de resina /lisado se incubó durante 1 hora a 4 ° C, con agitación. Después, la mezcla se centrifugó durante 1 minuto a 3000 g para sedimentar la resina. La resina se lavó con 10 ml de tampón de lavado (NaH 50 mM
2 PO
4, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0) mediante agitación durante 5 minutos a 4 ° C. La mezcla de resina /lavado se centrifugó durante 1 minuto a 3000 g para sedimentar la resina. las lecturas de absorbancia de proteínas a 280 nm (A
280) se tomaron de los sobrenadantes de lavado. La resina se lavó repetidamente hasta que los sobrenadantes de lavado A
280 fue de menos de 0,01.
La elución se consigue mediante la adición de 7 ml tampón de elución (50 mM NaH
2 PO
4, 300 NaCl mM, imidazol 500 mM, pH 8,0) por cada 2 ml de resina, con 1 hora de incubación, agitación a 4 ° C. La mezcla se centrifugó durante 1 minuto a 3000 g para sedimentar la resina y por cada 7 ml, se recogieron cinco alícuotas 1 ml del sobrenadante que contiene la proteína eluida. La proteína eluida se almacenó a -80 ° C
Las concentraciones de proteína se estimaron siguiendo el kit de ensayo de proteínas BCA Pierce®. (ThermoScientific; Cat#23227) y el programa de la BCA Eppendorf BioPhotometer 6131.
SDS-PAGE, tinción con azul de Coomassie y Western Blot
Las muestras de proteínas se desnaturalizaron mediante un tratamiento térmico de 95 ° C durante 10 minutos y se separaron en geles de acrilamida al 12% que separan con un gel de acrilamida al 4% de apilamiento. Los geles se construyeron siguiendo el Mini-Protean
® 3 Cell (BioRad; Cat#165-3301 /165-3302) las instrucciones del fabricante. La célula Mini-Protean 3 mini tanque (BioRad; Cat#165-3302) fue montado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los geles corrió durante 60 minutos, 200 voltios a 4 ° C (Bio-Rad PowerPac
TM Fuente de alimentación básica ).
Para determinar la eficiencia de purificación de geles de SDS-PAGE se tiñeron con 0,1% de azul de Coomassie (0,1% Coomassie Blue R-250, 40% de metanol, 10% de ácido acético) durante una noche a temperatura ambiente con agitación suave. Los geles de SDS-PAGE se fijaron antes de la tinción con azul de Coomassie con solución de fijación (50% de metanol, 10% de ácido acético) a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave. De acuerdo con geles de tinción azul de Coomassie se destiñeron usando una mezcla de metanol 40%, 10% acético solución decolorante ácido durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave.
Para la identificación de proteínas, después de separación en 12% de acrilamida separar los geles, las proteínas se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno siguiendo el BIO-RAD Mini Trans-Blot
® protocolo electroforética (Cat#170 a 3930 /170-3935). El BIO-RAD Mini Trans-Blot sistema electroforético
® corrió durante 2 horas a 200 voltios
Las membranas fueron bloqueadas en el 5% de leche desnatada en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST.: NaCl 137 mM, Tris 20, 0,1% de Tween-20), se incubaron de nuevo durante 1 hora con el anticuerpo monoclonal T7-Tag (Novagen; Cat#69522) diluido 1: 10.000 en leche 5% seca no grasa, seguido de una 1 hora de incubación con IgG de rábano picante peróxido (HRP) conjugado de cabra anti-ratón (Invitrogen; Cat#G-21040) diluido 1: 10.000 en 5% sin grasa leche en polvo
Western blots fueron desarrolladas utilizando la fosfatasa alcalina. conjugado Substrato Kit (BioRad; Cat#170 a 6432). La membrana se expone a la luz durante 10 minutos con agitación y se lava con ddH
2O para detener la reacción antes de escanear
La escalera de proteínas PageRuler prestained. (Fermentas, Cat#SM0671) se utilizó para analizar la proteína de tamaño. Análisis FODA
Microarray
ARN total fue extraído de fibroblastos NIH3T3 tratadas con 15 mg ml
-1 purifica la proteína p37 durante 24 horas o no tratados fibroblastos NIH3T3 utilizando el RNeasy® Mini Kit ( Qiagen; Cat#74104). Tres réplicas biológicas se tomaron de cada tratamiento. contaminación genómica se proyectó por PCR y se elimina el uso de desoxirribonucleasa I, amplificación Grade (Invitrogen; Cat#18068-015) por las instrucciones del fabricante. La integridad del ARN y la calidad se controlen mediante el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE.UU.).
ARN y se amplificó ADNc sintetizados de acuerdo con instrucciones del GeneChip® 3 'Manual de IVT expreso del usuario (Kit Affymetrix; Cat#P /N702646 Rev.8). Después de marcaje con biotina de ADNc y la fragmentación, las muestras se hibridan con genoma del ratón Affymetrix 430 2,0 arrays, se lava usando una estación de fluidos GeneChip® y escaneadas usando el escáner GeneChip® 3000. datos de microarrays se procesó utilizando la expresión Affymetrix ® Software Console ™ 1.2 (Affymetrix ; Cat#P /N 702387 Rev. 2) y CLC Genómica Workbench 4.7 (CLC bio, http://www.clcbio.com;. Vat#DK28305087)
RT
array 2 Profiler ™ PCR sistema
ARN total fue extraído de fibroblastos NIH3T3 que habían sido tratados con p37, p37 y S31-201, S31-201 única o no tratados fibroblastos NIH3T3 utilizando el RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Cat#74104) . Tres réplicas biológicas se tomaron de cada tratamiento. contaminación genómica se proyectó por PCR y se elimina el uso de desoxirribonucleasa I, amplificación Grade (Invitrogen; Cat#18068-015) por las instrucciones del fabricante. La integridad del ARN y la calidad se controlen mediante el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE.UU.)
ARN transcripción inversa y la RT
2 Profiler
TM Respuesta Inflamatoria & amp.; autoinmunidad matrices de PCR (SABioscience; Cat#PAMM 077A-12) se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante (SABiosciences; Parte#1022A). correlaciones positivas fuertes del ciclo umbral valores (CT) entre la matriz de PCR biológica repeticiones de cada tratamiento indican la detección qPCR fiable de la expresión génica (figura S4).
Se realizó un análisis ANOVA comparando los valores de Ct del gen del tratado muestras al control no tratado
PCR cuantitativa (qPCR)
ARN fue extraído utilizando el RNeasy® Mini Kit. (Qiagen; Cat#74104) a partir de tres réplicas biológicas de NIH3T3 tratado y no tratado fibroblastos. El ARN fue tratado con DNasa (Invitrogen, Cat#18068-015) antes de la conversión de ADN complementario (superíndice
TM III, Invitrogen, Cat#18080-044). amplificación cuantitativa de ADNc se realizó por triplicado de cada biológica replicar usando iQ
TM SYBR
® Green Supermix (BioRad; Cat#170 a 3.884) y los oligonucleótidos qPCR (S4 tabla) mediante un iCycler iQ
TM real Sistema de Detección de PCR-tiempo (BioRad; 170-8740). Las mismas condiciones de amplificación fueron utilizados para todos los conjuntos de cebadores; desnaturalización inicial a 95 ° C durante 3 minutos; proceso de amplificación de ciclo 40x través de desnaturalización a 95 ° C durante 10 segundos, hibridación del cebador 60
° C durante 30 segundos y luego una extensión a 72 ° C durante 30 segundos. fluorescencia emitida se midió durante la fase de extensión ciclada. Una extensión final de 95 ° C durante 1 minuto se completó antes de la curva de disociación. La curva de disociación se inició a 55 ° C con un aumento de 0,5 ° C hasta la temperatura final de 95 ° C se alcanzó.
Los controles negativos fueron seleccionados para eliminar la contaminación y sólo un único pico fue aceptado en la curva de disociación de cualquier gen probado. Todos los productos amplificados fueron secuenciados para indicar la especificidad de los oligonucleótidos qPCR.
doble cambio
Para normalizar las diferentes concentraciones entre muestras de todos los genes de interés los valores (GOI) Ct se restan de los valores promedio Ct de los dos genes de referencia endógena de
βactin
y
GAPDH gratis (
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa
); Ct (ecuación 1). Todos los valores de Ct se obtuvieron a partir de tres réplicas biológicas y tres repeticiones técnicas de cada biológica replicar (N = 9)
La diferencia entre el gen de interés? Ct de una muestra tratada y una muestra de control se calculó
Ecuación 1.; ΔΔCt (ecuación 2). La eficiencia de la amplificación del cambio exponencial por ciclo por gen (E) de cada cebador se calcula a partir del porcentaje de eficacia (E%); E (ecuación 3). eficiencias por ciento de 100 ± 10% y R
2≥0.985 se consideraron aceptables. Todas las eficiencias par de cebadores se pueden encontrar en la Tabla S4.
Ecuación 2Equation 3
El ΔΔCt se utilizó con el valor E cebador gen respectivo para calcular el factor de cambio relativo de expresión de genes debido a un tratamiento (Ec 4). A normalizada ΔΔCt & gt; 1 indica la regulación al alza y & lt; 1 indica regulación a la baja.
Ecuación 4
Barras de error
La desviación estándar (
σ
) se calculó sobre la base de ΔΔCt (ecuación 5). El error estándar (SE) se calculó a partir de la desviación estándar (Ec 6) y la superior (ecuación 7) e inferior barras de error (8 eq) se calcularon usando el error estándar, E-valor y doble cambio. N, el número del tamaño de la muestra = 9. Ecuación
5Equation 6Equation 7Equation 8
Los valores de barras de error para todos los gráficos se presentan en el cuadro S5.
Análisis de varianza (ANOVA)
Un análisis ANOVA se realizó en todas las qPCR datos que comparan el umbral ciclo normalizado (Ct) de las muestras tratadas a los controles o muestras de control tratados. Todos los experimentos consistieron en tres réplicas biológicas y tres técnicos repeticiones de cada réplica biológica (N = 9).
Las células de mamífero
fibroblastos
embrionarias de ratón (NIH3T3) establecidas a partir de embriones de ratón NIH Swiss, fueron obtenidos El de Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne.
condiciones de cultivo celular
fibroblastos NIH3T3 se cultivaron en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM). El medio se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS), NaHCO
3 y penicilina-estreptomicina. Se añadió Plasmocin
TM (Invivogen) para todos los medios de cultivo a una concentración de 5 mg ml
-1. La línea celular y los medios de comunicación se realizarán las pruebas de contaminación por micoplasma usando los cebadores descritos por Mycoplasma Uphoff y Drexler [25]. condiciones de amplificación por PCR utilizando una desnaturalización inicial a 95
° C durante 3 minutos y posterior proceso de amplificación de ciclo 32x través de desnaturalización a 95
° C durante 10 segundos, hibridación del cebador 65
° C durante 30 segundos y una extensión a 72
° C durante 30 segundos. fue completamente extensión final de 95
° C durante 1 minuto. La línea celular de células y todos los medios experimento resultaron negativos para la contaminación por micoplasma.
Todas las placas de cultivo se incubaron en una incubadora con camisa de agua (Forma Scientific). La incubadora se regula automáticamente a 37
° C con 5% de CO
2
Inhibidores
Se utilizaron los siguientes inhibidores:. IL6R inhibidor HOJA
TM purificado anti- ratón /rata anticuerpo monoclonal CD126 (IL6R
i
) (Biolegend; Cat#115809) (AB_2127939) a una concentración final de 0,1 mg ml
-1. La concentración final se determinó mediante RT-PCR que mostró que las concentraciones de IL6R
i
que van desde 0,1 a 0,5 g ml
-1 inhibido p37 inducida por
suero amiloide A3
(
SAA3
) expresión. La sonda química STAT3 inhibidor VI (S31-201) (Santa Cruz Biotechnology; Cat#sc-204 304) se utilizó a una concentración final de 100 mM [26]. El Viral péptido inhibidor de TLR4 (VIPER) y el péptido de control VIPER CP7 se empleó a una concentración final de 0,5 M (IMGENEX; Cat#IMG-2011set). Los M VIPER concentración de inhibición de 0,5 se determinó mediante el tratamiento de células NIH3T3 con 1 mg ml
-1 lipopolisacárido (LPS) (InvivoGen; Cat#tlrl-3pelps) inhibir con 0,25, 0,5, 0,75, 1, 5, 10 y 25 mu M VÍBORA. Se encontró que la concentración final de 0,5 M VIPER para reducir la expresión de
SAA3
de 12 veces a 5 veces. CP7 También se encontró que inhibe LPS-inducida
SAA3
expresión en concentraciones más altas, sin embargo en 0,5 M CP7,
SAA3
expresión no fue significativamente inhibido.
Célula de tratamiento
fibroblastos NIH3T3 de tratamiento se sometieron a pases en el número necesario de placas de cultivo de tejido para permitir tres réplicas biológicas por tratamiento. Todas las líneas NIH3T3 se originaron de la misma congelación hasta por lotes en el paso 10; ocurrió tratamiento antes del paso 15. Antes del tratamiento, DMEM10% de medio FCS se aspiró y los cultivos de células se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na 10 mM
2HPO
4,2 h
2O, KH 2 mM
2 PO
4, pH 7,4), a menos que se indique lo contrario.
para el tratamiento p37 se añadió la concentración requerida de p37 purificada para el medio DMEM10% de FCS que cubre las células y los cultivos se incubaron durante la cantidad de tiempo requerido. En el caso de las pruebas de tiempo, los tratamientos con células se iniciaron en momentos que permitieron para todos los cursos de tratamiento que vaya a sincronizar y listo para la extracción de RNA a T
0.
fibroblastos NIH3T3 fueron tratados con inhibidores antes de 24 horas de tratamiento con o sin p37. tiempo de incubación pre-tratamiento varía dependiendo del inhibidor; 1 hora para IL6R
i
, 2 horas para la víbora y CP7 y 24 horas para S31-201.
Los tratamientos fueron suprimidos por la lavadora y la lisis de las células para la extracción de RNA inmediata. Las células se observaron después del tratamiento para los niveles de toxicidad, si hubo un efecto tóxico observable se dio por terminado el experimento.
Migración ensayos
La migración celular fue estimulado en una monocapa utilizando un
In vitro
ensayo herida cero. fibroblastos NIH3T3 fueron cultivadas a una monocapa confluente 100% y se rascó con una punta de pipeta estéril, formando una herida de aproximadamente 300 micras de diámetro. Los restos celulares se eliminó por lavado con PBS 1x y DMEM10% de FCS se añadió con 25 mg ml
-1 p37 para los fibroblastos NIH3T3 tratadas. Los cultivos que no habían alcanzado una monocapa confluente después de 24 horas de tratamiento y las heridas que eran más o menos de 300 micras se excluyeron del análisis. Las imágenes fueron capturadas a los 0, 14, 19, 24 y 38 horas. Seis imágenes fueron capturadas por punto de tiempo por placa. placas por triplicado fueron completados en cada punto de tiempo (N = 18). Tasa de migración celular se expresó como área de superficie (m
2) cubierto por la migración de células dividido por el tiempo (horas). Para establecer la zona en la que habían migrado a las células en cada punto de tiempo, el área de la herida en cada punto de tiempo se resta de la superficie inicial de la herida. ImageJ se utilizó para determinar el área de la herida.
Resultados
perfiles de expresión génica de p37 fibroblastos NIH3T3 tratadas
recombinante
se indujo la expresión del gen p37
en
Escherichia coli
y la proteína se purificó usando cromatografía de afinidad Ni-(Fig 1). Inicialmente, se determinó el efecto de la p37 purificada sobre la migración de fibroblastos NIH3T3. En un ensayo de cicatrización de la herida 25 mg ml
-1 tratado p37 fibroblastos expuestos aumento de las tasas de migración (S5B FIG) y cierre de la herida más rápida que los controles (Fig S5A). p37 no afectó a la tasa de proliferación de las células NIH3T3. Hay un informe del tratamiento p37 causando un ligero aumento en la proliferación de las células de la próstata DU145 (sin datos proporcionados), sin embargo, las células de próstata PC3 no se vieron afectados (15).
p37 purificada se separó en un 12% SDS PAGE y se tiñeron con azul de Coomassie (A). La proteína purificada se transfirió a membranas de fluoruro de polivinilideno y se sondó con el anticuerpo monoclonal T7-Tag y de la IgG de rábano picante peróxido (HRP) conjugado anti-ratón (B) de cabra. Los patrones de peso molecular (MW) están en kilo Daltons (kDa) y se indican en la izquierda de la figura. La proteína p37 purificada corrió a la posición de aproximadamente 52 kDa. La proteína p37 se prevé que sea 43,5 kDa con un 8,5 kDa adicional como resultado de la 6x Su etiqueta y Xpress epítopo de la pRSET A marco de lectura. La identidad de la proteína p37 purificada se confirmó mediante secuenciación de proteínas.
fibroblastos NIH3T3 se incubaron con 15 mg ml
-1 p37 durante 24 horas y un análisis de microarrays de la ARN total purificado indicaron expresión de 537 genes afectados significativamente (p≤0.001); 288 de estos genes se upregulated (factor de cambio ≥ 3) (Tabla S6). Las asignaciones de ontología de genes para los 288 genes regulados positivamente de manera significativa se suministran en la figura S6. Los diez genes más fuertemente upregulated (de 9 a 64 veces) han sido reportados para influir en la progresión del cáncer y /o la inflamación (véase la discusión). Se seleccionaron para el análisis de un ocho genes regulados positivamente adicionales (de 3 a 9 veces) que también afectan a la inflamación /cáncer. Los datos de microarrays para los dieciocho genes se validó mediante PCR cuantitativa (qPCR) (Fig S7). Upregulation en respuesta al tratamiento p37 fue confirmada por catorce de los genes. Los cambios veces se mantuvo relativamente constante entre los diferentes experimentos (más reciente). Se utilizó posteriormente 25 mg ml
-1 p37 y tratamientos de 24 horas; plegables cambios fueron comparables entre los experimentos.
La haptoglobina gratis (
Hp
) fue una excepción.
El análisis de microarrays identificaron 249 genes fuertemente regulados negativamente (doble cambio ≥ 3) (Tabla S7). Regulación a la baja de cinco de estos genes se ha asociado con la progresión tumoral y la activación de las proteínas de fase aguda (APP) genes (Tabla S8).
Efecto de diferentes concentraciones de p37 y los tiempos de tratamiento
fibroblastos NIH3T3 se incubaron con 0,5, 1, 5 y 25 mg ml
-1 p37 durante 24 horas. Las concentraciones más bajas p37 eran menos eficaces en la estimulación de la expresión de genes a pesar de
Complemento Componente 3 gratis (
C3
) y
La lipocalina 2 gratis (
Lcn2
) estaban todavía significativamente activado por 5 mg ml
-1 p37 (Tabla 1).
para determinar los cambios en la expresión génica con el tiempo NIH3T3 fibroblastos fueron tratados con 5 mg ml
-1 p37 para 2 , 4, 8, 12 y 24 horas.
angiopoyetina-4 como gratis (
Angptl4
),
amiloide sérico A3 gratis (
SAA3
),
molécula de adhesión celular vascular 1 | (
VCAM1
) y
la interleucina 6 gratis (
IL6
) expresión aumentó fuertemente durante las primeras 4 horas de tratamiento, pero la activación se había reducido a niveles bajos o estaba ausente en el 24 hora (Tabla 2). El notable aumento de
Lcn2
y
ocurrieron C3
expresión entre 12 y 24 horas.
La decorina gratis (
Dcn
) y
factor inhibidor de leucemia gratis (
LIF
) expresión aumentado durante las primeras 4 horas, posteriormente se cayó y luego aumentó ligeramente de nuevo a las 24 horas.
a pesar de cierta variabilidad en cambio veces se produjo cuando los fibroblastos NIH3T3 fueron tratados con 25 mg ml
-1 p37 durante 24 horas (Tabla 1 y experimentos posteriores), cinco genes
Angptl4
,
SAA3
,
Dcn
,
C3
y
Lcn2
se activaron sistemáticamente más de 10 veces. Tres genes
El hialuronano sintasa 2 gratis (
HAS2
),
Hp
y
LIF fotos: por lo menos 5 veces.
P37 activa la expresión de genes a través del receptor
Tlr4
los rápidos aumentos en
Angptl4
,
LIF
,
SAA3
,
IL6
y
VCAM1
p37 expresión en fibroblastos tratados sugirió la proteína p37 es la señalización a través del receptor tipo toll 4 (Tlr4). fibroblastos NIH3T3 poseen Tlr4 desde 1 mg ml
-1 lipopolisacárido tratamiento (LPS) durante 6 horas dio lugar a un aumento de 28 veces en la
IL6
expresión en fibroblastos NIH3T3 [27]. Nos trataron fibroblastos NIH3T3 con 1 mg ml
-1 LPS durante 24 horas y encontramos un 2 veces y un aumento de 12 veces en
IL6
y
SAA3
expresión, respectivamente (datos no mostrada). El Viral péptido inhibidor de TLR4 (VIPER) y su péptido control (CP7) [28] se utilizaron para determinar si las señales de p37 a través de Tlr4. fibroblastos NIH3T3 se incubaron durante 24 horas con p37 (25 mg ml
-1) o pre-tratada durante 2 horas con el VIPER o péptidos CP7 (0,5 M) antes de la adición de p37. Se determinó el efecto de los péptidos sobre los niveles de expresión de los siete genes más fuertemente inducidos por p37 (Fig 2). La expresión p37 inducida de los siete genes se inhibió significativamente por VIPER. Aunque se produjo alguna inhibición inducida por CP7, en la mayoría de los casos esto fue significativamente menor que la inhibición causada por VIPER. El tratamiento de fibroblastos NIH3T3 con VIPER 0,5 M o CP7 solo no tuvo ningún efecto sobre los genes probados, con la excepción de
SAA3
que fue downregulated por 0,5 veces (Fig S8A).
PCR cuantitativa ( qPCR) análisis de fibroblastos NIH3T3 tratado con 25 mg ml
-1 p37 durante 24 horas (negro) o pre-tratados durante 2 horas con VIPER (grises) o el péptido CP7 de control (blanco) antes de 25 mg ml
-1 p37-tratamiento durante 24 horas. Las diferencias significativas entre CP7 o víbora + p37 p37 tratamientos y el tratamiento se calcularon utilizando análisis ANOVA (p = 0.05 +, ++ p≤0.01, p≤0.001 +++).
El truncamiento de p37 o la mutación del sitio de unión de TPP inhibe la activación de genes
Cuatro péptidos p37 truncado se prepararon a partir del cual 20, 60, 80 o 105 aminoácidos habían sido retirado de la C-terminal. péptidos solubles (25 mg ml
-1) purificado utilizando el método argSOAK se utiliza para tratar los fibroblastos NIH3T3. La capacidad de p37 para inducir la expresión génica se perdió cuando los 20 aminoácidos C-terminales estaban ausentes (Fig 3). La excepción fue
Angptl4
cuyo nivel de expresión inducida por el péptido truncado 20 amino ácido fue similar a la del péptido p37 de longitud completa. Los niveles de expresión de los otros genes analizados (se muestran siete) no se vieron afectados significativamente por los péptidos p37 truncado.
El análisis cuantitativo por PCR de fibroblastos NIH3T3 tratadas con 25 mg ml
-1 p37 exclusión de 20 aminoácidos (aa), 60aa, 80aa o 105aa (gris oscuro a negro) de la C-terminal; durante 24 horas. Arginina remojo (argSOAK) p37 purificada (gris oscuro) disminuye ligeramente (negro) la expresión del gen p37 inducida en fibroblastos NIH3T3. Las diferencias significativas entre los fibroblastos tratados y no tratados se calcularon utilizando análisis ANOVA (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001)
La estructura cristalina de p37 se ha definido a. 1,9 Å de resolución [29]. P37 es una proteína de la clase alfa /beta que consiste en dos dominios separados por una hendidura, que se une modelización indica pirofosfato de tiamina (TPP).