Extracto
El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CECC) es una enfermedad agresiva con una supervivencia pobre y es el sexto cáncer más común en todo el mundo. El reflujo gastroesofágico es un evento común en pacientes SCCHN. GPR4 es una proteína G de protones de detección de receptor acoplado a, que puede ser activado por la acidosis. El objetivo de este estudio fue explorar el papel de GPR4 en la exposición al ácido y la angiogénesis tumoral en el CECC. En este estudio, se confirmó que sobreexpresan GPR4 en las células SCCHN podría aumentar la expresión y secreción de IL6, IL8 y VEGFA a pH 5,9. Este efecto podría ser inhibida por SB203580 (un inhibidor de la p38). El análisis de transferencia Western indicó que la fosforilación de p38 en las células infectadas aumento GPR4 a pH 5,9, que podría ser inhibida por SB203580. En ensayo de formación de tubo, las células HMEC-1 se incubaron con medio condicionado (CM, pH 5.9, 6.5, 7.4) derivada de control y GPR4 infectaron células de SCCHN. La longitud del tubo fue significativamente mayor en las células HMEC-1 incubadas con CM de células infectadas GPR4 comparación con las células de control en pH5.9, lo que indica el efecto pro-angiogénicos de GPR4 en pH ácido. Los anticuerpos neutralizantes de IL6, IL8 y VEGFA podrían inhibir la formación de tubos de células HMEC-1. In vivo, el efecto de GPR4 sobre la angiogénesis se investigó con el modelo polluelo corioalantoidea membrana (CAM). Control y GPR4 infectaron células SCCHN fueron sembradas en la superficie de leva superior (n = 5 en cada grupo) y 5 l de DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5, 7,4) se añadió a la superficie de la célula de cada 24 h. Cuatro días más tarde, la leva superior se recogieron y la relación del área vascular a la zona de CAM se cuantificó usando Image-Pro Plus 6.0 software. células infectadas GPR4 podrían reclutar más vascular que las células de control en pH5.9. En conclusión, hemos sugerido que GPR4 induce la angiogénesis a través de la secreción de IL-6, IL-8 y VEGFA mediado por p38 inducida por GPR4 a pH extracelular ácido en SCCHN
Visto:. Jing Z, Xu H, Chen X, Q Zhong, Huang J, Zhang Y, et al. (2016) El Protón-Sensing G-proteína del receptor acoplado GPR4 promueve la angiogénesis en el cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 11 (4): e0152789. doi: 10.1371 /journal.pone.0152789
Editor: Ramani Ramchandran, Colegio Médico de Wisconsin, Estados Unidos |
Recibido: Septiembre 29, 2015; Aceptado: 18 Marzo de 2016; Publicado: 14 de abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Jing et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por fondos del programa de Yangfan de la Administración Municipal de Beijing Hospitales (sin XMLX201507.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CECC) es una enfermedad agresiva con una supervivencia pobre y es el sexto cáncer más común en todo el mundo [1]. La incidencia global es de aproximadamente 600.000 casos cada año [2]. El tabaquismo y el abuso del alcohol son los principales factores de riesgo para la CECC. El reflujo gastroesofágico es un evento común en pacientes SCCHN [3], lo que indica que está asociado con un riesgo elevado de cáncer de la laringe y la faringe cáncer [4]. monitoreo de doble sonda de pH de veinticuatro horas indica el pH del esfínter esofágico superior como por debajo de 4 [5]. La exposición al ácido puede conducir a diversos trastornos otorrinolaringológicos tales como laringitis crónica, nódulos vocales, edema de Reinke, úlcera de contacto y granulomas, estenosis laríngea, y laringoespasmo paroxística [6]. En el carcinoma de células escamosas de esófago, la exposición al ácido continua promueve el desarrollo vascular [7], que desempeña un papel crítico durante la iniciación y progresión del tumor maligno [8].
El G receptores acoplados a proteínas de protones con sensor (GPCR) que incluye GPR4, GPR65 (TDAG8), GPR68 (OGR1), y GPR132 (G2A) recientemente han sido identificados como nuevos sensores de pH que se proponen para ser activado por el pH extracelular ácido [9]. Se ha demostrado que GPR4 se sobreexpresa en varios tipos de tumores malignos [10, 11]. En el carcinoma de ovario epitelial, densidad de expresión GPR4 se acompaña de una mayor densidad microvascular (MVD) [10], y esto se correlacionó con el estado de la metástasis de los ganglios linfáticos y el estadio clínico. Esto indica que GPR4 puede estar implicada en la angiogénesis relacionada con el cáncer. En CECC, la correlación entre la exposición al ácido, la angiogénesis tumoral y GPR4 no ha sido bien estudiado. En un estudio anterior, se confirmó que GPR4 podría activar AP1 y ERK vías de señalización a pH extracelular ácida [12]. AP1 es uno de los sitios de regulación de IL6, IL8 y VEGFA [13-15]. GPR4 como un sensor de pH se correlaciona positivamente con una mayor densidad microvascular, por lo que la hipótesis de que podría aumentar la expresión de IL-6, IL-8 y VEGFA e inducir la angiogénesis en el pH extracelular ácido. En este estudio, hemos sugerido que GPR4 angiogénesis inducida a través de la secreción de IL-6, IL-8 y VEGFA GPR4 inducida a pH extracelular ácido en el CECC.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el permiso ética para este estudio fue concedida por el Comité de Ética de Investigación del hospital Tongren de Beijing (Pekín, china).
Cell Cultura y
las líneas celulares de SCCHN células y células FaDu Tca8113, células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1) se utilizaron en el estudio. FaDu células se obtuvieron de Estado clave de laboratorio de las enfermedades orales, la Universidad de Sichuan [16]. Tca8113 células se obtuvieron de China Infraestructura de Recursos línea celular. células HMEC-1, obtenidas de Thermo Fisher, fue generada por Ades et al [17]. Todas las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Hyclone, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Gibco) y 1% de penicilina /estreptomicina. Todas las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.
Generación de adenovirus recombinante que lleva genes GPR4
El adenovirus recombinante que expresa GPR4 (Ad-GPR4) se generó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente [18]. Brevemente, GPR4 fue sub-clonado en el vector adenoviral pAdxsi (Sinogenomax, China). El constructo adenoviral recombinante se transfectó en el embalaje células HEK293 y después estas células se congelaron-descongelaron varias veces para liberar partículas virales intracelulares. Los títulos virales fueron probados en células HEK293 y se obtuvo el número de unidades formadoras de placas (pfu) utilizando un ensayo de formación de placas.
infección de la célula y el ácido Estimulación
FaDu células y las células fueron Tca8113 se sembraron en placas de seis pocillos, llegando al 80% de confluencia por el día siguiente. A continuación, las células fueron infectadas con Ad-GPR4 o Ad-null (un adenovirus recombinante en blanco como control). Dieciocho horas más tarde, se llevó a cabo la estimulación de ácido como se describe anteriormente [12]. En resumen, 18 h después de la infección, los medios de cultivo se sustituye por DMEM /F12 libre de suero (pH 5,9, 6,5 y 7,4). Las células se recogieron después de la estimulación durante 6 h. se utilizó SB203580 (un inhibidor de p38, 1 M) para determinar si el p38 mediada la secreción de las citoquinas pro-angiogénicos. Para llevar a cabo la inhibición de p38, las células infectadas se GPR4 privadas de suero durante 4 horas y se trataron con SB203580 1 M durante 1 h antes de la estimulación ácido y luego los medios de cultivo fueron sustituidos por DMEM libre de suero /F12 (pH 5,9). Las células se recogieron 6 horas después.
medio condicionado
Para preparar el medio condicionado (CM), las células y las células FaDu Tca8113 fueron infectadas con Ad-GPR4 o Ad-nula durante 18 h, la cultura medios se sustituyeron por DMEM /F12 libre de suero (pH 5,9, 6,5 y 7,4), y las células sin infección actuaron como control. Seis horas después, el medio se centrifugó (4ºC, 1500 rpm) y se recogió y se almacenó a -80 ° C hasta su uso el sobrenadante.
PCR en tiempo real (qPCR) y PCR semicuantitativa
ARN total de FaDu y las células y los tejidos Tca8113 SCCHN se aisló usando el reactivo TRIzol (Life Technologies, EE.UU.). La transcripción inversa se realizó utilizando un Kit FastQuant RT (Tiangen, China). qPCR se realizó como se recomienda por el fabricante. Los siguientes cebadores se utilizaron para qPCR: IL6 sentido 5'-TGAGAGTAGTGAGGAACAAG-3 ', 5'-antisentido CGCAGAATGAGATGAGTTG-3'; IL8 sentido 5'-CCTGATTTCTGCAGCTCTGTGT-3 ', 5'-antisentido GGTGGAAAGGTTTGGAGTATGTCT-3'; sentido VEGFA 5'-GCCCACTGAGGAGTCCAACATC-3 ', 5'-antisentido CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3'. Los cebadores para PCR de GPR4 fueron los siguientes: sentido 5'-AACCTCTATCGGGTGTTCGTG-3 ', 5'-antisentido TTGGCTGTGCTGTTCCTCTTGG-3'. GAPDH se amplificó como un estándar interno. El nivel de ARN relativa en cada muestra se determinó por el método 2 (-Delta Delta C (T)).
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA): perfil
Las células de control de las células infectadas y GPR4 se estimularon durante 6 h con DMEM /F12 libre de suero (pH 5,9). A continuación, el medio se centrifugó (4ºC, 1500 rpm) y se recogió el sobrenadante. La concentración de IL6, IL8, y VEGFA en el medio de cultivo se cuantificó con un kit de ELISA según las instrucciones del fabricante (Abcam).
análisis de transferencia Western
Las células se lisaron en tampón RIPA ( Beyotime, china) suplementado con un PMSF 1 mM. Un total de 100 mg proteínas se sometieron a electroforesis en geles al 10% de SDS-PAGE, y electrotransferred a membranas de nitrocelulosa (Invitrogen, EE.UU.). Western blot se realizó como se describe anteriormente [12]. GPR4 anticuerpos fue adquirido de LifeSpan Biosciences (LifeSpan, EE.UU.). Fosfo-p38 (p-p38), p38 total (p38), receptor de fosfo-VEGF 2 (Tyr1175) y el anticuerpo VEGF receptor 2 se adquirieron de Cell Signaling Technology (Cell Signaling, EE.UU.). GAPDH (Santa Cruz, CA) se utilizó como control de carga lisado.
Tubo de Ensayo de Formación
Para confirmar el efecto de GPR4 en la formación del tubo en HMEC-1, se realizó un ensayo de angiogénesis en reducido el factor de crecimiento Matrigel (BD Biosciences). Un día antes de ensayo de formación de tubo, HMEC-1 Las células se sembraron en un disco de 10 cm. Después de recubrir la placa de 96 pocillos con Matrigel siguiendo las instrucciones del fabricante, se recogieron las células HMEC-1 y se resuspendieron a 1 x 10
5 /mL utilizando CM suplementado con 2% de FBS. Después se añadieron 0,1 ml de suspensión de células a la placa de 96 pocillos. VEGFA (1 ng /ml) se utilizó como un control positivo y DMEM sirvió como control negativo. La placa se incubó a 37 ° C, 5% de CO
2 durante 12 h para permitir la formación de estructuras similares a capilares. Fotos fueron tomadas usando un microscopio de luz y la longitud del tubo (píxeles) se contó usando Image-Pro Plus 6.0 del software.
Chick corioalantoidea de membrana (CAM) Modelo
fertilizados libres de patógenos específicos (SPF) los huevos se obtuvieron de Beijing Centro de Investigación Animal de Laboratorio. Los huevos fueron incubados en un incubador humidificado a 37,0 ° C con 60% de humedad. El día 10, los grandes vasos y el saco se marcaron en el huevo usando la fuente de luz fría (STORZ, Alemania). Después de la desinfección con alcohol al 75%, una ventana redonda se abrió en la parte superior de la cáscara de huevo, el mantenimiento de la membrana de la cáscara de huevo exterior. Un agujero de punta fue perforado en el lugar de la bolsa de aire. A continuación, se añadieron 20 l de solución salina normal a la membrana de cáscara de huevo. La membrana de la cáscara de huevo se perforó con una aguja fina y el agujero de punta pequeña en el saco de aire aspiraron usando una bombilla de pipeta de goma, de modo que la solución salina normal separó la membrana de la cáscara de huevo exterior de la CAM. La membrana de la cáscara de huevo se despegó sin perturbar la CAM. La ventana estaba cubierta con parafilm y el huevo fue colocado en la incubadora durante otro día. A continuación, se sembraron 1 x 10 células infectadas
6control y GPR4 sobre la superficie de leva superior (n = 5 en cada grupo). Se selló la ventana cuadrada en el huevo. Después, se añadió 5 l DMEM /F12 (pH 5.9, 6.5, 7.4) a la superficie de la célula cada 24 horas. Cuatro días más tarde, la leva superior fueron cosechadas y la relación de la zona vascular a la zona de la CAM se cuantificó usando Image-Pro Plus 6.0 del software.
Bioinformática
Se utilizó el método de Bioinformática como Li [ ,,,0],19] se describe, brevemente, matriz de datos relacionados con los cánceres de la U133 genoma Affymetrixhuman además de la plataforma 2.0 se cargaron hacia abajo desde la base de datos GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), y los genes expresados diferencialmente en Los tumores se analizaron utilizando la base de datos TumourProfile (http://tumour.bjmu.edu.cn/, no publicado) como Wang et al anteriormente descrito procesamiento de datos de microarrays y métodos de análisis [20, 21]. El perfil de expresión de GPR4 en una variedad de tipos de cáncer y el control correspondiente tejidos (normal o no tumoral) Se realizaron búsquedas en esta base de datos, y los niveles de expresión se representan como puntuaciones medias de rango (ARS).
La inmunohistoquímica ( IHC)
especímenes
embebidos en parafina-de laringe o de muestras de carcinoma de células escamosas de la hipofaringe, junto con muestras de tejido normal peri-carcinoma se obtuvieron del banco de muestras de tumores de cabeza y cuello del hospital Tongren de Beijing [12]. diapositivas de tejido en parafina fueron desparafinados, rehidratada y se colocaron en 10 mmol /L de tampón de citrato (pH 6,0), y se calienta dos veces en un horno microondas durante 5 min cada uno. Los portaobjetos se incubaron con 3% de H2O2 durante 10 minutos, se lavaron con PBS, se bloquearon con suero normal de cabra 10% para 30 min, y después se incubó con anti-GPR4 (diluido 1: 100; concentración final, 2 mg /ml, vida útil, EE.UU. ) o IgG de conejo normal como control a 4 ° C durante la noche. Después del lavado, los portaobjetos se tiñeron con el kit de sistema de amplificación catalizada firmado (código DAKO k5007) y las imágenes fueron fotografiadas con un microscopio Olympus IX70. expresión semicuantitativa de GPR4 se calculó utilizando Image-Pro Plus 6.0 del software.
Análisis de Datos
El análisis bioinformático de las diferencias en la expresión GPR4 entre los tipos de cáncer y tejidos de control fueron evaluados utilizando la Wilcoxon Rank- sumtest en el entorno de software R (http://www.r-project.org/). corrección de la función R "p.adjust" de Bonferroni se utilizó para ajustar los valores de P. Los datos experimentales se analizaron mediante la prueba t de Student con el software SPSS19.0. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
GPR4 Estimula pro-angiogénicos secreción de citoquinas a pH ácido de pH extracelular
Para investigar si GPR4 podría inducir. la expresión de citocinas pro-angiogénicos a pH extracelular ácido, que detecta la expresión de IL6, IL8, y VEGFA a diferentes valores de pH (pH 7,4, 6,5 y 5,9). La sobreexpresión de GPR4 en las células infectadas GPR4 fue validado por qPCR y Western Blot (Figura 1A). Los niveles de mRNA de IL6, IL8, y VEGFA en las células Ad-GPR4 aumentaron significativamente en comparación con las células Ad-nulos a pH 5,9 (Fig 1B). En comparación con los controles, no hubo inducción 67.8-, 118- y 12,5 veces para IL6, IL8 y VEGFA, respectivamente, en las células Ad-GPR4. Esto indicó que el pH extracelular ácido mejora la expresión de citoquinas pro-angiogénica a través de GPR4, que se confirmó, además, al nivel de proteínas. Las concentraciones de IL6, IL8, y VEGFA se incrementaron significativamente en el sobrenadante de células sobreexpresados GPR4 en comparación con las células de control a pH 5,9 (Fig 1C). El inhibidor, SB203580, podría reducir la expresión y secreción de IL6, IL8, y VEGFA (Fig 2A y 2B), lo que sugiere que p38 puede estar implicado en la inducción de citoquinas por GPR4. Western blot se realizó para investigar si GPR4 podría aumentar la fosforilación de p38 a diferentes pH. La fosforilación de p38 aumentó en las células sobreexpresados GPR4 a pH 5,9 (Fig 2C), que podría ser inhibida por SB203580 (Fig 2D). Nuestros resultados fue corresponsal con que, en SCCHN, p38 es constitutivamente activa y conduce a aumento de la secreción de citoquinas IL6 y IL8 [22].
ARN total y proteínas de las células Ad-GPR4-FaDu, Ad-null- se aislaron células FaDu después de la estimulación ácido durante 6 h. Se llevaron a cabo qPCR y Western blot. (A) La sobreexpresión de GPR4 en células Ad-GPR4-FaDu se comfirmed por qPCR y Western blot. (B) La expresión de IL6, IL8, y VEGFA aumentaron significativamente en las células infectadas GPR4 a pH 5,9. (C) se recogieron los sobrenadantes de las células y las concentraciones de IL6, IL8 y VEGFA se detectaron por ELISA. Resultados similares se observaron en las células Tca8113 (S1) Fig.
(A) En las células Ad-GPR4-Fadu SB203580 reduce la expresión de IL-6, IL-8 y VEGFA a un pH de 5,9. (B) SB203580 reduce la secreción de IL-6, IL-8 y VEGFA. (C) GPR4 aumento de la fosforilación de p38 en pH5.9. (D) SB203580 inhibe la fosforilación de p38 en las células GPR4 sobreexpresados. Resultados similares se observaron en Tca8113 células S2 (FIG).
GPR4 promueve la angiogénesis in vitro
Para probar si GPR4 podría promover la formación del tubo, las células HMEC-1 se incubaron con CM deriva a partir de células de control y células GPR4 sobreexpresados. Las longitudes de los tubos (flechas) se incrementaron significativamente en las células HMEC-1 incubadas con CM de células infectadas GPR4 en comparación con células de control a pH 5,9 (Fig 3A). Esto indicó que la sobreexpresión de GPR4 en SCCHN podría inducir la angiogénesis in vitro a pH ácido. En SCCHN, la angiogénesis es activada por IL-8, IL-6 y VEGF [23, 24]. Para probar si el efecto de la angiogénesis inducida por GPR4 fue mediada directamente por IL6, IL8 y secreción VEGFA, los anticuerpos monoclonales neutralizantes (amp I +; D Systems) de IL6, IL8 y VEGFA se añadieron a la CM de células Ad-GPR4-FaDu, respectivamente , el anticuerpo IgG de isotipo se utilizó como control negativo (Fig 3B). Estos anticuerpos neutralizantes reducen la longitud del tubo de HMEC-1, y por otra parte, los efectos de anticuerpos neutralizantes podrían invertirse mediante la adición de la cantidad en exceso de estos factores (S3 FIG). Esto sugirió que la angiogénesis inducida GPR4 a través de IL-6, IL-8 y la secreción VEGFA. Vascular receptor del factor de crecimiento endotelial 2 (VEGFR2) es el receptor principal de VEGF y el principal mediador de la señalización pro-angiogénesis inducida por VEGF en células endoteliales. Para probar si GPR4 aumento de la fosforilación VEGFR2 en células HMEC-1, se realizó transferencia de Western. Los resultados mostraron que la fosforilación VEGFR2 aumento en las células HMEC-1 incubadas con CM (pH 5,9) derivados de células GPR4 sobreexpresados (Fig 3D).
(A) la longitud del tubo (flechas) de las células HMEC-1 se aumentado en CM derivado de células Ad-GPR4-FaDu en comparación con las células FaDu-Ad-nula a un pH de 5,9. (B) Los anticuerpos neutralizantes de IL6, IL8 y VEGFA inhibieron la formación de tubos en las células HMEC-1. anticuerpo de isotipo IgG se utilizó como control en la neutralización prueba de anticuerpos. (C) VEGFA (1 ng /ml) se utilizó como un control positivo y DMEM sirvió como un control negativo en el ensayo de formación de tubo. longitudes de tubo (píxeles) se cuantificaron a partir de 6 campos representativos utilizando Image-Pro Plus 6.0 del software. (D) GPR4 aumento de la fosforilación VEGFR2 en células HMEC-1 a pH 5,9. Se observaron resultados similares en células Tca8113 (S4) Fig.
GPR4 promueve la angiogénesis in vivo
En vivo, el potencial angiogénico de GPR4 en SCCHN se verificó en el modelo CAM. células infectadas GPR4 sembradas sobre la CAM reclutaron más vascular de células de control a pH 5,9. La densidad vascular se cuantificó mediante el cálculo de la relación de la zona vascular a la zona de CAM. En las células Ad-nulo y Ad-GPR4-FaDu, las densidades vasculares que rodean el tumor eran 8,46%, y 16%, respectivamente (Fig 4). Esto indicó que la sobreexpresión de GPR4 en SCCHN podría promover la angiogénesis in vivo a pH ácido. El estudios in vivo e in vitro indicaron que GPR4 induce angiogénesis en un pH ácido, un sello distintivo de la progresión del tumor.
Las células Ad-GPR4-FaDu reclutaron a más vascular que las células Ad-null-FaDu solamente a pH 5.9. No se observaron diferencias entre las células Ad-GPR4-FaDu y células Ad-GPR4-FaDu a pH 7,4 y 6,5. Las relaciones de área vascular a la zona de la CAM se cuantificaron utilizando Image-Pro Plus 6.0 del software. Resultados similares se observaron en las células Tca8113 (Fig S5).
GPR4 se sobreexpresa en SCCHN
GPR4 se sobreexpresa en diversos tipos de neoplasias, incluyendo cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, los cánceres de hígado y riñón [11]. Para evaluar la expresión diferencial de GPR4 a través de múltiples tipos de cáncer y su correspondiente control (normal o no tumoral) tejidos a nivel de mRNA, se realizó un análisis de la bioinformática integrado basado en los datos de tumores establecidos ómicas de la base de datos GEO. Las puntuaciones de rango medio (ARS), se sintetizaron los valores de P-corrección de Bonferroni ajustados (Tabla 1), y GPR4 se reguló en el carcinoma renal de células claras de células renales, CECC y el adenocarcinoma colorrectal. La sobreexpresión de GPR4 en SCCHN se ve apoyada por el BioXpress (http://hive.biochemistry.gwu.edu/tools/bioxpress) [25]. La base de datos BioXpress indica que GPR4 es upregulated en 85,37% de las muestras de SCCHN en comparación con sus muestras normales apareadas en base a la secuenciación de ARN (RNA-seq); el conjunto de datos depositados en el Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) de un total de 72 pacientes se ha recogido y utilizado para el análisis [25].
Se recogieron 12 muestras de SCCHN (Tabla 2) y se realizó RT-PCR (Fig 5A y 5B) e inmunohistoquímica (IHC) tinción (Fig 5C y 5D). Todos los pacientes sufrían de reflujo gastroesofágico. Como se muestra en la figura 5, GPR4 se amplificó en 9/12 muestras y upregulated en los tejidos tumorales (figura 5A) en comparación con los tejidos normales peri-tumorales (Fig 5B). La proteína GPR4 expresa en niveles más altos (flechas rojas) en las células tumorales en comparación con las células epiteliales de tejidos normales peri-tumorales. Resultados similares se observaron tanto en la laringe e hipofaringe.
(A) RT-PCR de GPR4 en los tejidos cancerosos. (B) RT-PCR de GPR4 en tejidos normales peri-canceroso. GAPDH se utilizó como estándar interno. (C) Imagen Representante de IHC de este tipo de cáncer moderadamente diferenciado. el tejido normal (D) Peri-cancerosos del mismo paciente como C. densidad óptica (E) integrada (IOD) de células de expresión positivas (flechas) se calculó utilizando Image-Pro Plus 6.0 software. En total, se incluyeron 12 casos de SCCHN. El nivel de inmunorreactividad se calificó mediante el cálculo de la densidad óptica integrada (IOD) de células positivas de expresión.
Discusión
En este estudio, hemos sugerido que, cuando se expone a un ambiente ácido, GPR4, uno de los GPCRs de protones de detección, podría inducir la angiogénesis a través de la secreción de citoquinas pro-angiogénica en SCCHN. Las citocinas incluyen IL-6, IL-8, y VEGFA, y esto fue confirmado por qPCR y ELISA. El efecto pro-angiogénicos de GPR4 fue observado por el ensayo de formación de tubo y el modelo CAM.
La angiogénesis es una de las características del cáncer [26]. Los tumores no pueden crecer más allá de un tamaño crítico o metástasis en otro órgano sin vasos sanguíneos [27], por lo que deben reclutar nuevos vasos sanguíneos por angiogénesis. El "cambio angiogénico 'se equilibra con moléculas pro-angiogénicos y anti-angiogénicos [27]. Una de las señales que desencadenan este interruptor es un pH bajo. En las células de melanoma humano, pH ácido aumenta la expresión de los factores proangiogénicos VEGFa y IL8 [28]. GPR4 predominantemente funciona como un sensor de protones y se expresa endógena en HMEC-1 y HUVEC. La acidosis extracelular puede activar GPR4 y dar lugar a la producción de cAMP [29]. acidosis hipercápnica también puede activar GPR4 para estimular la adhesión HUVEC la expresión de moléculas y adhesividad [30]. En otro estudio, se demostró que GPR4 juega un papel fundamental en el crecimiento, la migración y la formación de tubos por las células endoteliales, pero los cambios de pH no podía regular la producción de cAMP en HMEC-1 y HUVEC [31]. En HUVEC, acidosis activa GPR4 y aumenta la expresión de IL1, IL2, IL6 y IL8 [32]. GPR4, como un sensor de pH, está totalmente activa a pH ácido 6,8 y parcialmente activa en el intervalo fisiológico (pH 7.4 a 6.8) [33, 34]. El reflujo gastroesofágico es un evento común en pacientes con cáncer de cabeza y cuello [3], lo que significa que la mucosa y el carcinoma son a menudo expuestos a un pH bajo. La relación entre el bajo pH y la angiogénesis tumoral en CECC no ha sido bien estudiado. En este estudio, hemos sugerido que, en células Ad-null-FaDu y Ad-null-Tca8113, bajo pH no pudo aumentar la expresión de IL-6, IL-8, y VEGFA. En las células Ad-GPR4, la expresión de IL6, IL8, y VEGFA aumentó significativamente en comparación con el control a pH 5,9 pero no a pH 6,8 y pH 7,4, que puede indicar que GPR4 está completamente activa a pH 5,9 en SCCHN y esto es consistente con nuestro estudio anterior [12].
el ensayo de formación de tubo y el modelo CAM verificó el efecto pro-angiogénicos de GPR4. CM derivado de células Ad-GPR4-FaDu inducida tubos más largos en las células HMEC-1 y densidad más vascular en CAM que en los otros grupos a pH 5,9. Los anticuerpos neutralizantes de IL6, IL8 y VEGFA reducen las longitudes de tubo de las células HMEC-1, lo que indica que GPR4 indujo la angiogénesis a través de IL6, IL8 y la secreción de VEGF. VEGFA e IL6 son reconocidas como las principales moléculas pro-angiogénicos en el CECC y se han relacionado con la agresividad de la enfermedad y la mala evolución de los pacientes [35-40]. IL8, un producto final de la vía VEGF, también se observó en niveles altos en SCCHN [40]. Debido al importante papel de la angiogénesis en la progresión tumoral, agentes antiangiogénicos se han desarrollado. En xenoinjertos FaDu SCCHN, la administración a largo plazo de bevacizumab, un anticuerpo del factor de crecimiento endotelial vascular, modulada efectivamente eficacia de la quimioterapia [41]. En la fase II de ensayos clínicos en pacientes con CECC, bevacizumab más cetuximab o quimioterapia mostraron alentadores resultados de eficacia [42, 43]. La sobreexpresión de IL-8 dio lugar a la resistencia a bevacizumab en CECC, así co-focalización de VEGF y IL8 puede ayudar a superar la resistencia y aumentar la eficacia terapéutica.
medicamentos antiácidos, incluyendo antagonista de la histamina 2 receptores (ARH2) y los inhibidores de la bomba de protones (IBP ) siempre se utilizan en el tratamiento de pacientes SCCHN. Algunos estudios han revelado que el uso de medicamentos antiácidos puede tener ventajas terapéuticas significativas para los pacientes SCCHN [44, 45]. Uno de los mecanismos puede ser porque los medicamentos antiácidos pueden modular la adhesión de células tumorales al endotelio [44]. En el presente estudio, hemos demostrado que promueve GPR4 factores pro-angiogénicos secreción a pH ácido. Estos resultados indican que la inhibición de GPR4 o pH ácido puede conducir a la inhibición de la angiogénesis tumoral. Así especulamos que otro mecanismo probable es que los medicamentos antiácidos pueden inhibir la secreción de factores pro-angiogénicos aumentando el pH, y luego reducir la angiogénesis, que desempeña un papel crítico durante la progresión del tumor. Anteriormente, hemos demostrado que el pH extracelular ácida aumenta la expresión de metaloproteinasas de matriz (MMP) a través de la vía de señalización de ERK en células GPR4 sobreexpresados. En este estudio, mostramos que GPR4 podría aumentar la fosforilación de p38 a pH 5,9, que podría ser inhibida por SB203580. SB203580 podría reducir la expresión de citoquinas pro-angiogénicos, que pueden indicar p38 juega un papel importante en la mediación de la expresión de citoquinas.
En conclusión, sugerimos que GPR4 induce la angiogénesis inducida a través de GPR4-IL6 mediado por p38, IL8 y VEGFA la secreción ácida a pH extracelular en el CECC.
Apoyo a la Información
S1 Fig. GPR4 estimula la secreción de citoquinas a pH ácido en las células Tca8113.
De ARN total y proteínas de las células Ad-GPR4-Tca8113, se aislaron células Ad-null-Tca8113 después de la estimulación ácido durante 6 h. Se llevaron a cabo qPCR y Western blot. (A) La sobreexpresión de GPR4 en células Ad-GPR4-Tca8113 se comfirmed por qPCR y Western blot. (B) La expresión de IL6, IL8, y VEGFA aumentaron significativamente en las células infectadas GPR4 a pH 5,9. (C) Se recogieron los sobrenadantes de las células y las concentraciones de IL-6, IL-8 y VEGFA fueron detectados por ELISA
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S2 Fig. SB203580 reduce la secreción de citoquinas mediante la inhibición de la fosforilación de p38 en las células Tca8113.
(A) en las células Ad-GPR4-Tca8113, SB203580 reduce la expresión de IL6, IL8 y VEGFA a pH 5,9. (B) SB203580 reduce la secreción de IL-6, IL-8 y VEGFA. (C) GPR4 aumento de la fosforilación de p38 en pH5.9. (D) SB203580 inhibe la fosforilación de p38 en las células infectadas GPR4
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S3 Fig. Los efectos de anticuerpos neutralizantes podría ser revertido por la adición de la cantidad en exceso de IL-6, IL-8 o VEGFA en el ensayo de formación de tubo
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S4 figura . tubo de ensayo de formación de células Tca8113.
(A) la longitud del tubo (flechas) de las células HMEC-1 se incrementó en CM derivado de células Ad-GPR4-Tca8113 en comparación con las células Tca8113 Ad-null- a pH 5,9. (B) Los anticuerpos neutralizantes de IL6, IL8 y VEGFA inhibieron la formación de tubos en las células HMEC-1. isotipo de anticuerpos IgG se utilizó como control en la neutralización prueba de anticuerpos
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S5 Fig. Las células Ad-GPR4-Tca8113 reclutaron a más vascular que las células Ad-null-Tca8113 solamente a pH 5,9 en el modelo CAM
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S1 Archivo . archivo de Excel que contiene los datos de apoyo de información de este estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0152789.s006 gratis (XLSX)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Wang Pingzhang ( Departamento de Inmunología, Facultad de Ciencias médicas básicas, Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud; Centro de la Universidad de Pekín de Genómica de Enfermedades humano) para el análisis de la bioinformática
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