Extracto
El desgaste muscular que se produce con la caquexia por cáncer es causado por un desequilibrio en las tasas de síntesis de proteínas musculares y la degradación. El
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ratón es un modelo de cáncer colorrectal que se desarrolla la caquexia que es dependiente de IL-6 circulante. Sin embargo, la regulación de IL-6 de la facturación de proteínas musculares durante el inicio y la progresión de la caquexia en el
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ratón no se conoce. la progresión de la caquexia se estudió en
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ratones que fueron ya sea estable peso (WS) o tenían inicial (≤5%), intermedio (6-19%), o extrema (≥20% ) pérdida de peso corporal. La iniciación de la caquexia reducida% MPS 19% y una más ~ 50% con la pérdida de peso adicional. IGF-1 del músculo de expresión de ARNm y de mTOR objetivos se suprimieron con la progresión de la pérdida de peso corporal, mientras que el músculo AMPK fosforilación (Thr 172), la actividad de AMPK, y la fosforilación raptor (Ser 792) no aumentaron con el inicio de la pérdida de peso, pero eran inducida como caquexia progresó. ATP degradación de proteínas dependiente aumentó durante el inicio y la progresión de la caquexia. Sin embargo, la degradación de proteínas ATP independiente no se incrementó hasta caquexia había progresado más allá de la fase inicial. IL-6 administración del anticuerpo receptor previno la pérdida de peso corporal y suprimió la degradación de proteínas musculares, sin ningún efecto sobre el músculo% MPS o IGF-1 de señalización asociado. En resumen, la reducción MPS% durante la iniciación de la caquexia está asociada con IGF-1 /mTOR represión de señalización, mientras que la activación AMPK muscular y la activación de la degradación de proteínas ATP independiente ocurren más tarde en la progresión de la caquexia. IL-6 tratamiento con el anticuerpo receptor bloqueado progresión caquexia través de la supresión de la degradación de la proteína muscular, mientras que no rescatar a la supresión de la síntesis de proteínas musculares. La atenuación de la señalización de IL-6 fue eficaz en el bloqueo de la progresión de la caquexia, pero no suficiente para revertir el proceso
Visto:. Blanco JP, Baynes JW, SL Welle, Kostek MC, Matesic LE, Sato S, et Alabama. (2011) El Reglamento de Facturación Skeletal Muscle Protein durante la progresión del cáncer caquexia en el
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ratón. PLoS ONE 6 (9): e24650. doi: 10.1371 /journal.pone.0024650
Editor: Se-Jin Lee, Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Febrero, 2011; Aceptado: August 16, 2011; Publicado: 19 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 White et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por la subvención 5R01CA121249 de la Nación Institutos de Salud (NIH) y el Instituto Nacional del cáncer (NCI) al Dr. Carson. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pérdida de masa muscular esquelética es un sello distintivo de la caquexia y la preservación de la masa muscular es fundamental para la supervivencia de muchos pacientes con cáncer [1]. A menudo, los pacientes con cáncer no son diagnosticados hasta que se produzca una pérdida significativa de peso corporal [2], lo que limita las opciones de tratamiento en pacientes caquécticos [3]. Por el contrario, los pacientes diagnosticados durante las etapas iniciales de la caquexia (& lt; 5% de pérdida de peso corporal) tienen un tiempo mucho mejor supervivencia y los resultados del tratamiento de quimioterapia [5] - [6]. La comprensión de la regulación de la pérdida de masa muscular a lo largo de la progresión de la caquexia es fundamental para el desarrollo de ambas estrategias de prevención e intervención para el tratamiento de la caquexia [4]. Desafortunadamente, no tenemos una comprensión limitada de la regulación de volumen de negocios de proteínas musculares durante las etapas iniciales de la caquexia. Además, la progresión de la pérdida de masa muscular se acelera durante la progresión de la caquexia [5]. Este proceso no lineal crea lagunas en nuestro conocimiento, que se basa en gran medida de los cambios regulatorios durante las últimas etapas de la caquexia.
La señalización celular que altera el delicado equilibrio entre las tasas de síntesis de proteínas musculares y la degradación se piensa al ser una base vital necesaria para una mejor comprensión mecanicista de la pérdida de masa muscular con el cáncer. Mientras acelerada degradación de proteína muscular ha reconocido la importancia de la progresión de la atrofia, la regulación de los mecanismos proteolíticos largo de la progresión de la caquexia sigue siendo incierto. proteólisis muscular, principalmente a través de mecanismos dependientes de ubiquitina, se incrementa durante la etapa de la caquexia tarde [6], mientras que un solo informe ha informado de ninguna diferencia en la proteolisis muscular durante las etapas iniciales de la caquexia en ratones portadores de tumores [7]. Del mismo modo, el papel de la síntesis de proteínas durante la progresión de la caquexia es incierto. Mientras que la reducción en la síntesis de proteínas se ha demostrado en pacientes con estadio caquexia finales [8], y en ratones portadores de tumores que tienen al menos una reducción del 16% en el peso corporal [7], la regulación durante las etapas iniciales de la caquexia y la eventual transición a severa pérdida de peso garantiza mayor exploración.
La capacidad del músculo para sintetizar la proteína es sensible a muchos estímulos, incluyendo el estado de energía, hormonas anabolizantes, hormonas catabólicas, y cargar [9]. La vía /mTOR similar a la insulina factor de crecimiento 1 (IGF-1) de señalización a través de PI3K /Akt puede integrar la retroalimentación de una variedad de estímulos relacionados con el crecimiento de regular miofibras tamaño [10]. Circulantes de IGF-1 y el músculo IGF-1 la expresión génica se reducen generalmente con la caquexia [11] incluyendo la caquexia [12], [13]. Además, la activación de mTOR músculo también se reduce después de al menos una pérdida de 12% del peso corporal y disminuye aún más durante la etapa de la caquexia tarde [14], [15]. IGF-1 de señalización también puede regular músculo degradación de la proteína a través de la supresión de la caja forkhead O (FOXO), cuyos objetivos de la transcripción incluyen músculo atrogina-1 /MAFbx, anillo muscular Finger-1 (MuRF1) y los genes relacionados con la autofagia [16], [ ,,,0],17], [18]. Muscle 5'-adenosina monofosfato proteína-quinasa activada (AMPK), un sensor de estado de energía celular, también regula la síntesis de proteínas [19], [20], [21]. AMPK se activa por bajo estado de energía celular y también la contracción del músculo [22]. AMPK puede inhibir la señalización mTOR través de varios mecanismos, incluyendo la fosforilación de rapaces en Ser792 [23], que eviten la unión y la posterior fosforilación de p70S6K y 4EBP1. Además, la activación AMPK ha demostrado que aumenta la degradación de proteínas en miotubos, se asocia con un aumento en FOXO transcripcional objetivos atrogin1 y MuRF1 [24]. En teniendo ratas y ratones tumor, la activación de AMPK durante la progresión de la caquexia ha demostrado ser variable y su papel en la regulación de la pérdida de masa muscular con caquexia es difícil de interpretar [25]. El presente estudio tiene por objeto aclarar el papel de la AMPK en la regulación del recambio de las proteínas del músculo durante la caquexia.
Hay evidencia emergente para lisosomal /autofagia para jugar un papel en la enfermedad de desgaste muscular [26], [27]. De manera similar a otros métodos de la degradación muscular, la autofagia es un proceso esencial en el músculo esquelético requerida para eliminar orgánulos, es decir, las mitocondrias y las porciones del citoplasma [28]. Supresión de ATG7, un gen crítico de la autofagia, da lugar a la atrofia del músculo esquelético, las mitocondrias anormal y la desorganización de sarcómeros [29]. En contraste con el sistema de la ubiquitina, la autofagia es no específica, proceso independiente de ATP, que digiere partes de la célula en lugar de proteínas individuales. Los componentes moleculares de la autofagia /vías lisosomales están bien descritos, sin embargo, la regulación no es bien conocida. Varios genes han sido identificados como que incluye, LC3β, Gabarpl1, Atg12l, PI3kIII, Ulk2, Atg4β y Beclin1 relacionados con la autofagia. Ha habido informes que muestran los genes relacionados con la autofagia aumentan durante la distrofia muscular [30], diabetes [31], la sepsis inducida por el desgaste [27] y el cáncer caquexia relacionada [31], [32].
Pro- citoquinas inflamatorias IL-6 se ha implicado en la regulación de la pérdida de masa muscular durante la caquexia en los seres humanos y roedores [33]. Los ratones transgénicos que sobreexpresan IL-6 tienen la atrofia muscular asociada con el aumento de expresión de mRNA lisosomal y relacionados ubiquitina y proteínas [34], [35]. En los seres humanos, la administración de IL-6 puede causar una reducción en la síntesis de proteínas del músculo esquelético [36]. Debido a los efectos catabólicos que pueden ser mediados a través de IL-6 durante la caquexia, se han propuesto varios tratamientos para inhibir la actividad IL-6 para evitar la progresión de la caquexia. La administración de un anticuerpo del receptor de IL-6 ha respondido con eficacia el desgaste muscular en ratones portadores de tumores [36], [37]. Además, la inhibición de la actividad IL-6 puede reducir ambas vías de ubiquitina y de degradación lisosomal en el músculo gastrocnemio de C-26 ratones portadores de tumores [37]. Estos datos sugieren que la IL-6 inhibición puede reducir la degradación de la proteína muscular; sin embargo, el efecto sobre la síntesis de proteínas musculares no ha sido explorado. Es necesario seguir trabajando para dilucidar el asocian entre la IL-6 y la señalización de síntesis de proteínas musculares durante la progresión de la caquexia. Hemos informado anteriormente de pérdida de masa muscular en el
Apc
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ratón para depender de circulantes de citocinas proinflamatorias IL-6 [38], [39]. Sin embargo, la regulación del recambio de proteínas durante el inicio y la progresión de la pérdida más severa no ha sido bien estudiada durante la caquexia. El propósito de este estudio fue determinar la regulación de IL-6 de la facturación de proteínas musculares durante el inicio de la caquexia y la progresión hacia la más grave en el
Apc
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ratón. Nosotros medimos directamente la síntesis de proteínas musculares, degradación de proteínas musculares, y la señalización asociada durante las diferentes etapas de la pérdida de peso. También examinamos si la IL-6 señalización del receptor era importante para la regulación de estos procesos durante la progresión de la caquexia. Relacionada con los procesos que inician la caquexia, la hipótesis de que la síntesis de proteínas se reduciría sólo durante las últimas etapas de la caquexia, mientras que la degradación de proteínas dependiente de ATP sería el principal responsable de la iniciación de la pérdida de masa muscular. Después de la iniciación de la caquexia, la hipótesis de que la supresión de la IL-6 señalización rescataría la masa muscular a través de la inducción de la síntesis de proteínas musculares y la represión de ATP dependiente de la degradación de proteínas.
Métodos
Animales
La Universidad de Institucional de Cuidado de animales de Carolina del Sur y el empleo Comisión aprobó todos los experimentos con animales en este estudio.
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Min /+ ratones
sobre un fondo C57BL /6 fueron adquiridos originalmente de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) y se han criado en la Universidad de Facilidad de Recursos Animales de Carolina del Sur, como se describe anteriormente [40]. Hombre
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Min /+ gratis (n = 21) los ratones de entre 14 y 20 semanas de edad fueron alojados en grupo y sacrificó a edades que proporcionaron la estratificación de la pérdida de peso corporal para permitir el estudio de la progresión de la caquexia . Los 4 grupos utilizados en este estudio fueron el peso estable (WS; n = 5), inicial (≤5%; n = 6), intermedio (6-19%; n = 4), y extremo (≥20%; n = 6) grados de pérdida de peso corporal, cuando se compara con el peso corporal pico. Para bloquear la progresión de la caquexia, un conjunto separado de
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Min /+
ratones se trataron con un anticuerpo del receptor de IL-6 (n = 5) o de control de PBS (n = 7) durante dos semanas , a partir de después de la aparición de caquexia (16 semanas). De tipo salvaje C57BL /6 controles también fueron tratados con el anticuerpo del receptor de IL-6 (n = 6) o de control de PBS (n = 6) a las 16 semanas. La sala se mantuvo en un ciclo de 12:12 light:dark con el período de luz a partir de 0700. Los ratones se les proporcionó alimento estándar para roedores (Harlan Teklad Dieta de roedores,#8604, Madison, WI) y agua
ad libitum
.
Colección músculo
los ratones recibieron una inyección subcutánea de ketamina /xilazina /cóctel de acepromacina (1,4 ml /kg de peso corporal) antes de que el gastrocnemio se disecó. longitud de la tibia se midió como un indicador de tamaño del cuerpo de los animales y un factor de corrección para los pesos del músculo esquelético. Treinta minutos antes del sacrificio, todos los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 150 mM
2H
5-fenilalanina (Cambridge Isótopo Laboratories) en una solución de NaCl 75 mM a una dosis de 2 ml /100 g de peso corporal [41 ]. En el sacrificio, los músculos gemelos fueron lavadas en PBS, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, se pesaron y se almacenaron a -80 ° C hasta su posterior análisis.
se realizó tejido intestinal Colección
recogida de tejido intestinal como se describió anteriormente con una ligera modificación [39], [42], [43], [44]. En pocas palabras, el intestino delgado se cortaron cuidadosamente en el extremo distal del estómago y en el extremo proximal del ciego. El intestino grueso se eliminó desde el extremo distal del ciego hasta el ano. tejido adiposo del mesenterio se eliminó con fórceps y el intestino delgado se cortó en cuatro secciones iguales. Todas las secciones intestinales se lavaron con PBS, se abrieron longitudinalmente con un par de tijeras, y aplanadas con un hisopo de algodón entre dos trozos de papel secante. secciones intestinales fueron fijadas en paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS durante la noche y se transfieren a PBS para el almacenamiento a 4 ° C para su posterior análisis.
Pólipo Counts
Se realizaron recuentos Polyp como se describe anteriormente [ ,,,0],39], [42], [43], [44]. secciones intestinales En pocas palabras, el 4% PFA-fijo de todos los animales se tiñeron brevemente en 0,1% de azul de metileno, y se colocaron bajo un microscopio de disección. Los pólipos se contaron por el mismo investigador de una manera ciega. Los pólipos se clasificaron como de gran tamaño (& gt; 2 mm de diámetro), intermedio (1~2 mm) o pequeños (& lt; 1 mm).
IL-6 Receptor administración del anticuerpo
El MR16 -1 anticuerpo del receptor de IL-6 fue un generoso regalo de Chugai Pharmaceutical CO., LTD, Tokio, Japón. El anticuerpo se administró a una dosis de 300 ug /ratón en solución salina tamponada con fosfato mediante inyección intraperitoneal cada tres días durante dos semanas a partir de las 16 semanas de edad. PBS se inyecta como un vehículo de control.
La proteína miofibrilar Síntesis
Muestras de músculo gemelo se homogeneizaron en 1 ml de agua. Las miofibrillas y otras proteínas insolubles se sedimentaron por centrifugación y los sobrenadantes que contienen aminoácidos libres se utilizaron para determinar la relación de libre
2H
5-fenilalanina (m /z 239 fragmento) a endógena fenilalanina (no marcado) (m /z 234 fragmento). Las relaciones se determinaron mediante análisis de espectrometría de masa GC de los
t -butildimetilsililo
derivados de estos aminoácidos. proteínas miofibrilares se lavaron, se hidrolizaron y se analizaron para
2H enriquecimiento
5-fenilalanina mediante el control de la m /z 237 y 239 fragmentos, como se describe en detalle por Welle et al. [41].
La tasa fraccional de síntesis miofibrilar,% por día, se calculó como el enriquecimiento% de trazador en el hidrolizado de proteínas miofibrilares, dividido por el enriquecimiento del marcador en la reserva de aminoácidos libres de tejido muscular . enriquecimiento de proteína miofibrilar se determinó a partir de la m /z 237 y m /z 239 iones porque el isotopomer más ligero (m /z 234) saturó el detector MS. El miofibrilar /relación de enriquecimiento libre se multiplica por 48 para obtener los valores% /día debido a la incorporación del marcador se produjo durante un período de 30 min.
La degradación de proteínas
Para ensayar la degradación de proteínas musculares solubles, se puede utilizar un ensayo de proteolisis proteasomal modificado reportado por Hu et al [45]. El músculo gastrocnemio se retiró y se congeló en nitrógeno líquido. extractos musculares (~ 40 mgs) se homogeneizaron en tampón de cosecha enfriado con hielo (Tris-HCl 5 mM (pH 8,8), 1% de glicerol, 1 mm EDTA, EGTA 1 mm, recién constituida de 1 mm β-Me, y 50 mm EP -475). Los homogeneizados se centrifugaron a 30.000 ×
g
de 30 min, y luego se utilizaron las fracciones solubles para medir la degradación de proteínas. Para la determinación de degradación de proteínas, extractos de músculo se dializaron frente a un tampón basal [20 mmTris-HCl (pH 7,6) 10% de glicerol, 2 mm ditiotreitol (DTT), 10 mM de acetato de magnesio y cloruro de potasio 20 mm] para eliminar tirosina acumulado. Partes alícuotas de los extractos se incubaron durante 2 horas a 37 C con o sin un sistema de ATP generación (1 mm ATP, 100 mg /ml de creatina quinasa, y 10 mm fosfocreatina); También se añadió ubiquitina (250 g /ml). La reacción se detuvo con ácido tricloroacético, proteínas precipitadas se eliminaron por centrifugación, y la tirosina libre se midió fluorométricamente (450 nm de excitación /550 nm de emisión) para calcular la tasa de degradación de la proteína [46].
AMPK Actividad
actividad AMPK utilizando un kit de Linco (St. Louis, MO). En resumen, se añadieron los homogeneizados de músculo entero a una placa de 96 pocillos recubierta con el sustrato AMPK IRS-1, se incubaron durante 2 h, seguido de la adición de un anticuerpo secundario, conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) y específico para Ser fosforilada 794 en IRS -1. Por último, se añadió agente de iluminar a la placa para cuantificar el fósforo-IRS-1 y determinar la actividad de la AMPK.
Aislamiento de ARN, síntesis de cDNA y PCR en tiempo real
El aislamiento de ARN, síntesis de ADNc, y PCR en tiempo real se realizó como se describió anteriormente [47], utilizando reactivos de Applied Biosystems (Foster City, CA). Fluorescencia sondas marcadas para el 18S ARN ribosómico (colorante VIC) IGF-1, alfa actina esquelética, C2 subunt proteasomal, C7 subunidad proteasomal, atrogin1, MuRF1 (colorante FAM) y se adquirieron de Applied Biosystems y se cuantificaron con TaqMan Universal de mezcla maestra. Los datos se analizaron por software ABI usando el ciclo umbral (C
T), que es el ciclo en el cual la emisión de fluorescencia está a medio camino entre la detección y la saturación de la reacción.
Western Blotting
se realizó análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [48]. Brevemente, el músculo gastrocnemio congelado se homogeneizó en tampón y la concentración de proteína Mueller determinado por el método de Bradford [49]. músculo crudo homogenado 40 g se fraccionó en 6% -15% en geles de SDS-poliacrilamida. Los geles se transfirieron a membranas de PVDF durante la noche. Las membranas fueron teñidas con rojo Ponceau para verificar la igualdad de carga de cada gel. Las membranas se bloquearon durante la noche en leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween-20 (TBS-T). Los anticuerpos primarios para p-Akt (Ser473), Akt, p-4EBP1 (Ser65), 4EBP1, p-mTOR (Ser2448), mTOR, p-S6K (Thr389), S6K, p-AMPK (Thr172), la AMPK, p- Stat3 (Tyr705), Stat3, se diluyeron p-Raptor (Ser792), Raptor, Beclin-1, ATG7, LC3β, ubiquitina, atrogin1 (señalización celular) y SOCS3 (Santa Cruz) 1:1000 a 1:500 en 5% de leche en TBS-T, seguido de 1 hora de incubación con las membranas a temperatura ambiente. IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano secundaria de anticuerpos (Señalización Celular) se incubó con las membranas en diluciones 1:2000 durante 1 hora en 5% de leche en TBS-T. aumento de quimioluminiscencia (ECL) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) se utiliza para visualizar las interacciones antígeno-anticuerpo. Las imágenes fueron escaneadas digitalmente y transferencias se cuantificaron por densitometría usando software de imagen científica (Scion Image, Frederick, MD).
Análisis estadístico
A una manera ANOVA se utilizó para determinar las diferencias en
apc
Min /+
ratones con diferentes grados de pérdida de peso corporal. Un ANOVA de dos vías se utilizó para determinar las diferencias entre el genotipo y el tratamiento con el anticuerpo del receptor de IL-6. Los análisis post hoc se realizaron con métodos de Student-Newman-Keuls. Se utilizó una prueba t de pre-planificado para comparar los ratones de tipo salvaje con peso estable
Apc
Min /+
en la Tabla 1. La significación se fijó en p. & lt; 0,05
resultados
el peso corporal, masa grasa y estado inflamatorio durante la progresión de la caquexia en el
Apc
Min /+
ratón
los ratones fueron sacrificados entre el 14 al 20 semanas de edad, que es el rango de edad para el desarrollo de la caquexia en
Apc
Min /+ ratones
, y clasificados de acuerdo al porcentaje de pérdida de peso corporal en el momento del sacrificio en comparación con su peso corporal pico. Los grupos fueron designados como estable el peso (sin pérdida de peso), ≤5% de pérdida de peso corporal (inicial), la pérdida de 6-19% en peso (intermedia) y la pérdida de ≥20% (extremo). Peso estable
Apc
Min /+ ratones
, (14 semanas de edad), tenían pesos corporales similares a los ratones de tipo salvaje con ajuste de edad (Tabla 1). Durante el inicio de la caquexia, circulantes de IL-6 (
P
= 0,02; Tabla 1) y el bazo peso (
P
& lt; 0,001) se aumentó ligeramente, en comparación con peso estable
apc
Min /+
ratones, y aumentaron aún más con la progresión de la pérdida de peso corporal intermedio (
P Hotel & lt; 0,001, Tabla 1). No hubo más cambios en la circulación de la IL-6 o el bazo de peso durante la progresión de intermedio a la pérdida de peso corporal extrema. Epidídimo masa grasa se redujo en un 63% (
P
& lt; 0,001; Tabla 1) durante el inicio de la caquexia y continuado a disminuir con la progresión de la caquexia (
P
& lt; 0,001; Tabla 1). longitud de la tibia, un índice de tamaño del cuerpo en general, no fue diferente entre ningún grupo (Tabla 1), indicando que el crecimiento óseo normal se produce durante la progresión de la caquexia.
síntesis de proteínas miofibrilares se reduce durante la iniciación de la caquexia
Durante el inicio de la caquexia,
Apc
Min fue disminución de la masa muscular gastrocnemio /+ ratón
17% (
P = 0,001
; Tabla 1), y como caquexia progresaba la masa muscular siguió disminuyendo (
P Hotel & lt; 0,001; Figura 1A). Durante el inicio de la caquexia hubo una correspondiente reducción del 19% en la tasa de síntesis de proteína miofibrilar (
P = 0,001
; Figura 1 A), que continuó disminuyendo aún más con la pérdida de peso intermedio (
P
& lt; 0,001). A diferencia de la pérdida de masa muscular, no hubo mayor disminución en la tasa de síntesis de proteína miofibrilar entre los
Apc
/+ ratones Min
que presentan pérdida de peso intermedio o extrema. se correlacionó masa muscular gastrocnemio (
P = 0,003
; Figura 1B) con la tasa de síntesis de proteína miofibrilar en todos los grupos de
Apc
/+
ratones Min. la masa muscular y la síntesis de proteínas antes del desarrollo de la caquexia fueron similares entre los de tipo salvaje y peso estable
Apc
Min /+ ratones (Figura
S1A y B).
síntesis de proteínas y IGF 1 de expresión se midieron en
Apc
Min /+ ratones
durante la progresión de la caquexia. A) la síntesis de proteína miofibrilar. B) La correlación entre el peso y la síntesis de proteínas musculares. C)
Alta
: western blot representativo de formas fosforiladas y el total de Akt (Ser 473), mTOR (Ser2448), p70s6k (Thr389) y 4EBP-1 (Thr37 /46).
Baja
: La relación de fosforilados y Akt total, mTOR, p70 y 4EBP1 en el músculo gemelo normalizado al grupo WS. D) IGF-1 de expresión y E) correlación entre IGF-1 la expresión génica y la síntesis de proteínas. F) Skeletal alfa expresión de ARNm de actina. Los valores son medias ± SE. La significación se fijó en p & lt; 0,05. † Significa diferente de ratones WS. &erio; Significa diferencia de los ratones con pérdida de peso corporal ≤5%. $ Significa diferencia de los ratones con pérdida de peso corporal 6-19%. WS, peso estable.
Para evaluar los cambios en la señalización celular implicada en la regulación de la síntesis de proteínas, que mide el IGF-1 /activación de la vía Akt /mTOR durante el inicio y la progresión de la caquexia. la fosforilación de Akt (Ser 473), por lo general asociada con la promoción de anabolismo muscular, se mantuvo sin cambios durante el inicio de la caquexia. Con la transición a la pérdida de peso intermedio y extremo encontramos músculo Akt fosforilación que se incrementó aproximadamente 2 veces (
P
& lt; 0,001; Figura 1C). Durante el inicio de la caquexia, hubo una tendencia para la fosforilación en Ser mTOR residuo 2,448 a disminuir (
P
= 0,06; Figura 1C), mientras que la fosforilación de los objetivos de mTOR, p70 (Thr389) y 4EBP1 (Ser65), se redujeron un 20% (
P = 0,001
; Figura 1 C) y 55% (
P Hotel & lt; 0,001) durante las etapas iniciales de la caquexia, respectivamente. Con la transición a la pérdida de peso intermedio, el mTOR (-50%), y p70 (-37%) de la fosforilación se redujeron aún más (
P
& lt; 0,001; Figura 1C). Con la pérdida de peso corporal extrema solamente la fosforilación de p70 tuvo una disminución adicional (Figura 1C)
Muscle expresión-1 mRNA IGF disminuyó 28% (
P
= 0,001; Figura 1D). Durante el inicio de caquexia. Aunque IGF-1 la expresión de ARNm se redujo aún más con la pérdida de peso intermedio (Figura 1D), no hubo una reducción adicional en el músculo IGF-1 de expresión con la pérdida de peso extrema. Muscular IGF-1 de expresión y la tasa de síntesis de proteína miofibrilar se correlacionaron en todos los grupos de pérdida de peso (
P = 0,03;
Figura 1E). Muscular de IGF-1 en la expresión estable de peso
Apc
ratones /+
y de tipo salvaje Min fueron similares (Figura S1C). A pesar de la reducción en la síntesis de proteína miofibrilar, no se encontraron efectos de la caquexia en esqueleto alfa expresión de ARNm de actina (Figura 1F) lo que implica que la reducción en la síntesis de la proteína miofibrilar no se debió a una reducción en la disponibilidad de ARNm.
AMPK muscular se induce la fosforilación durante extrema de peso corporal
fosforilación de AMPK muscular (Thr 172) y la actividad no se cambiaron durante el inicio de la caquexia (Figuras 2A y 2B). A medida que avanzaba la caquexia, tanto la fosforilación y la actividad de la AMPK se incrementaron con la pérdida de peso intermedio, y aumentaron aún más con la pérdida de peso extrema (Figuras 2A y 2B). actividad de la AMPK y el estado de fosforilación fueron similares entre los de tipo salvaje y
Apc
Min /+
antes del desarrollo de la caquexia (Figura S2A y B). AMPK puede inhibir la actividad de mTOR través de varios mecanismos, un ser fosforilación de rapaces en Ser792. Las alteraciones en la fosforilación de rapaces coincidieron con la fosforilación de AMPK durante el desarrollo de la caquexia. Raptor fosforilación no se incrementó durante la iniciación de la caquexia, pero aumentó con la pérdida de peso intermedio y se incrementó aún más con la pérdida de peso extrema (Figura 2C).
activación AMPK se midió en
Apc
Min /+
ratones durante la progresión de la caquexia. A) la actividad de AMPK en el músculo gastrocnemio normalizado a los ratones WS. B)
Alta
: western blot representativo de la AMPK fosforilada (Thr172) y AMPK total en el gastrocnemio.
Baja
: La relación de fosforilada a las formas totales de la AMPK en el músculo gemelo. C)
Alta
: western blot representativo de raptor fosforilada (Ser792) y raptor total en el gastrocnemio.
Baja
: La relación de fosforilada a las formas totales de rapaces en los músculos gemelos. Los valores son medias ± SE. La significación se fijó en p & lt; 0,05. † Significa diferente de ratones WS. &erio; Significa diferencia de los ratones con pérdida de peso corporal ≤5%. $ Significa diferencia de los ratones con pérdida de peso corporal 6-19%. WS, peso estable.
degradación de la proteína muscular está regulada por ambos procesos ATP dependientes e independientes
degradación de proteínas totales, determinada por ensayo de liberación de tirosina no fue diferente entre los de tipo salvaje y el peso estable
Apc
Min /+
ratones (Figura S3). Sin embargo, la degradación total se incrementó en un 45% (
P = 0,001
; Figura 3A) en ratones con pérdida de peso inicial mientras que la degradación se incrementó un 134% y 188% durante la pérdida de peso corporal intermedia y extrema, respectivamente. El aumento inicial en la degradación de proteínas se debe a la degradación de ATP dependiente. Durante la caquexia extrema, hubo un aumento tanto en la degradación dependiente e independiente de ATP. En contraste con la degradación de ATP dependiente, ATP degradación independiente siguió aumentando con la pérdida de peso corporal más severa (Figura 3A). la degradación de proteínas totales fuertemente correlacionada con la masa del gastrocnemio en todos los grupos de la pérdida de peso (
P
& lt; 0,001; Figura 3B). Además, la degradación de proteínas se correlacionó significativamente con el porcentaje de pérdida de peso corporal en el
Apc
Min /+ ratones
(
P Hotel & lt; 0,001; Figura 3C). Para explorar más a fondo el papel de ATP vías proteolíticas dependientes e independientes, que mide componentes de la vía proteasoma dependiente de ubiquitina. Durante el inicio de la caquexia, la ubiquitinación de la proteína muscular aumentó 56% (
P
= 0,001; Figura 3D) y aumenta aún más (
P
& lt; 0,001) con una mayor pérdida de peso corporal. expresión C7 y C2 proteasoma subunidad aumentó en un 94% (
P
= 0,001) y el 81% (
P = 0,008
; Figura 3E), respectivamente, durante el inicio de la caquexia y aumentó aún más con la progresión de caquexia extrema. No hubo diferencias en la ubiquitinación, C7 o C2 expresión entre los
Apc
Min /+
ratones con pérdida de peso intermedio y extremo.
La degradación de proteínas se midió en
Apc
Min /+
ratones con pérdida progresiva de peso corporal. A) La degradación de proteínas determinada por ensayo de liberación de tirosina. Las barras blancas representan la degradación dependiente de ATP; Las barras negras representan la degradación del ATP independiente. B) Correlación entre la degradación de la proteína y el peso gastrocnemio. C) Correlación entre la degradación de la proteína y el porcentaje de pérdida de peso corporal. D)
Alta
western blot representativo de proteínas ubiquitinated en los músculos gemelos.
Baja
La cuantificación de proteínas ubiquitinated normalizado a peso estable
Apc
Min /+
ratones. E) La expresión de genes de C7 y C2 proteasomal subunidades. F).
Alta
: western blot representativo de formas fosforiladas y totales de FOXO3.
Baja
: La relación de FOXO3 fosforilada y total. G) La expresión de genes de atrogin1 y MuRF1. H) western blot Representante de atrogin1 proteína. Los valores son medias ± SE. La significación se fijó en p & lt; 0,05. † Significa diferente de los grupos WS. &erio; Significa diferencia de los ratones con pérdida de peso corporal ≤5%. WS, peso estable.
señalización Akt también puede regular la vía de degradación muscular a través de la fosforilación y la posterior inhibición del factor de transcripción FOXO3 en Ser 253. Durante el inicio de la caquexia, la fosforilación FOXO3 se redujo en un 39% (
P
= 0,001; Figura 3F), y reducido aún más durante la transición a la pérdida de peso intermedio, pero no reducido aún más con el cuerpo extrema pérdida de peso (Figura 3F). Atrogina-1 y la expresión de ARNm MuRF1, Foxo ligasas E3 regulado muscular, demostraron diferentes patrones de expresión durante el desarrollo de la caquexia. Atrogin1 mRNA aumentó 79% (
P
= 0,01, Figura 3G) durante el inicio de la caquexia, y se indujo con más pérdida de peso intermedio y extremo. expresión MuRF1 mRNA no se incrementó durante la iniciación de la caquexia o la transición a la pérdida de peso intermedio. Sin embargo,
Apc
Min /+
ratones con pérdida de peso extrema mostraron un 92% (
P
= 0,02, Figura 3G) aumento de la expresión MuRF1. expresión de la proteína Atrogin1 se incrementó en un 79% (
P = 0,004
; Figura 3H) durante la pérdida de peso corporal inicial. &erio; SEGUNDO). UN). SEGUNDO). DO). UN).