Extracto
CD133 es una molécula de membrana que ha sido, polémico, reportado como un marcador de CSC en el cáncer colorrectal (CCR). En este estudio, hemos tratado de aclarar la expresión y función de CD133 en el CCR. Inicialmente, el tamaño de la población CD133-expresión (CD133 +) en ocho líneas celulares de CRC bien descritos se midió por citometría de flujo y se comprobó que oscila de 0% a & gt; 95%. La línea celular HT29 tiene un CD133 + población de & gt; 95% y fue elegido para la evaluación funcional de CD133 después gen desmontables de interferencia por ARN. Un ensayo de curso de tiempo mostró que la inhibición de CD133 no tuvo efecto significativo sobre la proliferación celular o la apoptosis. Sin embargo, CD133 desmontables se tradujo en una mayor susceptibilidad a la apoptosis inducida por estaurosporina (p = 0,01) y la reducción de la motilidad celular (p & lt; 0,04). Desde caída de genes puede causar "fuera de objetivo" efectos, la línea celular SW480 (que tiene un CD133 + población de 40%) se clasifican en poblaciones puras CD133 + y CD133- para permitir la comparación funcional de poblaciones isogénicas separadas únicamente por la expresión de CD133. En concordancia con los experimentos desmontables, un ensayo de curso de tiempo no mostró diferencias significativas entre el proliferativas CD133 + /CD133- poblaciones. También una mayor resistencia a la apoptosis estaurosporina inducida (p = 0,008), mayor motilidad celular (p = 0,03) y una mayor eficiencia de formación de colonias se observó en el CD133 + población que la población CD133- tanto en 2D y la cultura 3D (p & lt; 0,0001 y p & lt ; 0,003 respectivamente). Por último, se probó la plasticidad de la expresión de CD133 en las células tumorales. Análisis cuantitativo de PCR mostraron que no había represión transcripcional en la población de CD133- SW480. El cultivo prolongado de una población pura CD133- dio lugar a la reaparición de células CD133 +. Llegamos a la conclusión que la expresión de CD133 en CRCs está asociado con algunas de las características atribuibles a stemness y que no es la plasticidad de la expresión de CD133. son necesarios para delinear la base mecanicista de estas características más estudios
Visto:. Elsaba TMA, Martínez-L Pomares, Robins AR, Crook S, Seth R, D Jackson, et al. (2010) La célula madre de marcadores asociados con la formación de colonias CD133 mejorada y la motilidad celular en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 5 (5): e10714. doi: 10.1371 /journal.pone.0010714
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Febrero 2010; Aceptado: April 27, 2010; Publicado: 19 de mayo de 2010
Derechos de Autor © 2010 Elsaba et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Nottingham y CR-Reino Unido. Tarek Elsaba es un beneficiario de una beca de doctorado que ha sido proporcionada por el gobierno egipcio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los últimos años han visto el surgimiento de la "hipótesis de las células madre del cáncer", que postula que una población minoritaria de las células dentro de un tumor formado por células madre del cáncer (CSC) [1], [2]. Esta población es supuestamente responsable de la generación de la mayor parte del tumor que consiste en células en diferentes grados de diferenciación. La jerarquía de un tumor se por lo tanto cree que es similar al tejido de la que se origina el tumor y células madre cancerosas se consideran homólogos neoplásicos de células madre en el tejido normal. A este respecto, se espera que los CAC para tener un fenotipo de células madre similares (generalmente referido como "stemness"). Este se caracteriza por características tales como la capacidad ilimitada replicativa, multipotencia y resistencia a la apoptosis [3]. El fenotipo de células madre también puede incluir cito-protectores estrategias como la capacidad para extruir activamente sustancias peligrosas procedentes de la celda, una característica que puede ser la base de la resistencia a los agentes quimioterapéuticos [3], [4].
en paralelo con la aparición de la hipótesis de las células madre del cáncer, ha habido un creciente interés en el aislamiento y estudio de las células madre cancerosas. Un número de estudios afirman tener células madre cancerosas aisladas a partir de varios tipos de tumores diferentes, tales como el cerebro [5], [6], de mama [7], colon [8], [9], carcinoma hepatocelular [10] y el cáncer de páncreas [11] . Estos estudios han usado marcadores CSC putativos para separar las células madre a partir de la diferenciación de células dentro de un tumor. Un método común de la separación es el método de eliminación de colorante (es decir, la población lado [12]), aunque la identificación de un número de marcadores de superficie celular (tales como CD24, CD44, CD166, y las integrinas) ha permitido el uso de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar células madre cancerosas [13]. Un marcador reportado consistentemente como un marcador de células madre en tumores de diferentes orígenes es CD133 (también conocido como Prominin 1).
El gen CD133 (
PROM1
) mapas en el cromosoma 4p15 y codifica un 120 kD glicoproteína transmembrana (ENSG00000007062). La proteína CD133 es pentaspan receptor de la superficie celular, aunque no se conoce ni su ligando ni sus mensajeros secundarios. Se reconoció por primera vez como un marcador de superficie de células madre hematopoyéticas [14], [15]. Más tarde, se usa para reconocer las células madre de cáncer en muchos tumores sólidos que surgen en, por ejemplo, de mama [13], páncreas [16] y el hígado [17].
Dos estudios recientes identificados CD133 como marcador de las células madre en el cáncer colorrectal (CRC) [8], [9]. En estos estudios, CD133 que expresan las células fueron aisladas (CD133 +) de CRCs primarias y se mostró a tener la capacidad de formar tumores como xenoinjertos en ratones desnudos; por el contrario se muestra CD133- células de los mismos tumores tener una capacidad muy limitada para formar xenoinjertos e incluso que se atribuyó a la contaminación por las células CD133 +. Análisis de los xenoinjertos que se formaron mostró que el tamaño de la población CD133 + era similar a la observada en el tumor primario y, además, la capacidad de propagar continuamente los xenoinjertos fue estrechamente asociada con la expresión de CD133. Estudios posteriores, sin embargo, no han validado estas observaciones [18] y en un estudio se ha informado de que, de hecho, la población CD133- tiene la mayor colonia de capacidad [19] formando. Nuestro estudio trata de aclarar aún más la expresión y la función de CD133 en el CCR. Se utilizaron dos enfoques: expresión (i) CD133 se evaluó funcionalmente en HT29 después de gen desmontables y celular (ii) SW480 se sometió a clasificación en un CD133 + de la población y una población CD133- seguido de análisis funcional comparativo de las dos poblaciones
Materiales y Métodos
El cultivo de tejidos, citometría de flujo y la célula activada por fluorescencia
Ocho líneas celulares de cáncer colorrectal humano (Caco2, DLD1, HT29, Lovo, LS1034, SW480, SW620, SW837) eran mantenido como se ha descrito anteriormente [20]. Identidad de todas las líneas celulares se confirmó mediante la huella dactilar de mutaciones en
KRAS, BRAF, PI3KCA, CDC4, TP53
y microsatélites pruebas de inestabilidad.
Evaluación del tamaño de la expresión de (CD133 +) población CD133 en cada línea celular se llevó a cabo por citometría de flujo utilizando un ficoeritrina (PE) de anticuerpo marcado - CD133 /1 (clon AC133 /1, Miltenyi Biotec, UK). Las células se separaron usando una solución de disociación celular no enzimática (Sigma) y aproximadamente 5 × 10
5 células se incubaron con anticuerpo (diluido 1:100 en FACS de lavado (0,5% de albúmina de suero bovino; NaN 2 mM
3; 5 mM EDTA)) durante 15 minutos a 4 ° C. Un isotipo y la concentración acertaron PE etiquetado se utilizó anticuerpo de control (Miltenyi Biotec, Reino Unido) y muestras marcadas con este anticuerpo se utiliza para establecer los niveles de activación periódica. Después de tres lavados de 5 minutos con FACS de lavado, las células se resuspendieron y se fijaron en una solución que contiene FACS lavar con 1% de formaldehído. Determinación del porcentaje de células CD133 + y clasificación de líneas celulares en poblaciones CD133 + /CD133- se realizaron en un flujo Epopeyas Altra citometría de máquina (Beckman Coulter). Los resultados se analizaron usando WinMDI 2.9 software de ordenador.
Para células activadas por fluorescencia (FACS) de SW480, las células se marcaron utilizando el mismo protocolo, pero sin la etapa de fijación final. Con el fin de evaluar la plasticidad de la expresión de CD133, se mantuvieron células clasificadas en cultivo durante 3 semanas antes de someterse a re-evaluación. Para todos los otros experimentos, las poblaciones + /CD133 CD133- se ensayaron inmediatamente después de su clasificación.
La extracción de RNA, la detección de variantes de empalme y la cuantificación de ARNm
ARN total fue extraído a partir de células utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de mucosa colónica normal se recogieron con plena aprobación del comité de ética local (Oxford Comité Ético de Investigación B, REC C02.310 referencia). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes cuyas muestras se ensayaron para determinar CD133 expresión y empalme variantes. Se extrajo el ARN y el ADN complementario (ADNc) se sintetizó como se describe anteriormente [20].
dos principales variantes de empalme se han descrito para CD133. La variante más grande AC133-1 (NM_006017) fue identificado primero y contiene todos los exones [15]. La segunda variante, AC133-2, empalmes a cabo el exón 4, que es de 27 pares de bases y codifica una secuencia de 9 aminoácidos en el primer dominio extracelular de CD133. Expresión de variantes de empalme se ensayó mediante RT-PCR utilizando un cebador corriente arriba en el exón 3 y un cebador aguas abajo en el exón 5 (primer secuencias disponibles de los autores). Esto produciría un producto de 199 pares de bases de AC133-1 y 172 pb de AC133-2. Punto final análisis de PCR se llevó a cabo mediante la visualización de los productos de PCR en geles de agarosa. Sin embargo, dado que la amplificación preferencial del producto más pequeño puede producir artefactos de datos, se repitió el estudio usando PCR en tiempo real (con SYBR verde como el colorante indicador) en el termociclador Mx3005P (Stratagene, Reino Unido). Especificidad de la PCR fue validado por secuenciación directa bidireccional. La presencia de variantes de empalme se probó en ADNc obtenido a partir de las líneas celulares de CRC, las poblaciones según CD133 + y CD133- de SW480, así como 10 muestras de mucosa colónica normal
+/- poblaciones
Ordenada CD133 se sometieron a análisis de los niveles de mRNA por el análisis cuantitativo de RT-PCR utilizando el método de la curva estándar. El análisis se realizó por triplicado para cada muestra y
CD133
valores se normalizaron a la limpieza de genes
HPRT
. Cada reacción se realizó en un volumen final de 25 l en un termociclador Mx3005P (Stratagene, Reino Unido). Los datos para Q-PCR se analizaron usando el software MxPro-QPCR.
Gene desmontables
gen desmontables se consiguió mediante la transfección de las células HT29 (demostrado tener una expresión de alto CD133) con CD133-específica pequeña ARN de interferencia (siRNAs). Aproximadamente el 2 × 10
5 células fueron sembradas en 2 ml de medio DMEM con 10% de SFB en placas de 6 pocillos (Corning) 24 horas antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con CD133-específica de sigilo dúplex de siRNA (secuencia: 5'-GAGUCGGAAACUGGCAGAUAGCAAU-3 ', Invitrogen) a una concentración final de 33 nM usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos son anotados en adelante como HT29
CD133-. Los controles consistieron en células transfectadas con siRNA control mezclado (secuencia: 5'-GAGGGAACAGUCGGAUAGACCUAAU-3 '). Y se anotan en adelante como HT29
SSC (siRNA control revueltos)
Western Blot
Para la transferencia Western, los lisados se prepararon y se cuantificaron como se describe anteriormente [20]. Las muestras (30 g) se sometieron a dodecil sulfato de sodio poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE) utilizando un gel de resolución de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana Hybond-P PVDF (Amersham Bioscience). Después de bloquear con 5% albúmina de suero bovino (BSA) /0.1% TPBS (Tween 20 en solución de PBS) durante 60 minutos, la membrana se incubó durante la noche a temperatura ambiente con CD133 (C24B9) Conejo mAB (Señalización Celular) en una concentración de 1:1000. La membrana se lavó con 0,1% TPBS 3 veces durante 5 minutos cada uno después se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo con peroxidasa de rábano unido secundario (Sigma Aldrich) (1:10000, anti-IgG de conejo) diluido con 5% de BSA /PBS que contiene 0,1% de Tween 20. Después de 3 lavados, la membrana se visualizó reactivos de quimioluminiscencia potenciada (Thermo Scientific) para un control de carga, se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-β-actina (Sigma Aldrich) en una dilución de 1:2000 contra la proteína β-actina.
ensayos de proliferación
Un ensayo de curso temporal para la proliferación se realizó después de genes desmontables y después de la clasificación de células. Para HT29, cada pocillo de una placa de 24 pocillos se sembró con 10
4 células 24 horas después de la transfección con cualquiera de CD133 específico o revueltos control de siRNA. El número de células se evaluaron en los días 1, 3 y 5. Para SW480 las poblaciones CD133 + y CD133- según se sembraron a 10
4 células por números de células y así evaluados en los días 1, 3, 5, 7 y 9. Al menos dos experimentos independientes, cada uno por triplicado, se llevaron a cabo. Un ensayo de azul de metileno [21], [22] se utilizó para cuantificar el número de células viables adherentes.
Stauropsorine la apoptosis inducida por
estaurosporina se utilizó para evaluar la resistencia conferida por CD133 a tensiones exógenas apoptóticas . Para HT29, cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Costar) se sembró con cualquiera HT29
CD133- o HT29
células ssc 72 horas después de la transfección. Aproximadamente 5 × 10
4 células fueron sembradas por pocillo y se incubaron con estaurosporina (Sigma) a una concentración final de 8 mM durante 24 horas. Después de este período, se midieron las células viables y apoptosis. Para SW480, cada pocillo de una placa de 96 pocillos se sembró con 10
5 células de las células clasificadas y se añadió estaurosporina 24 horas más tarde a una concentración de 8 mM. Después de otras 24 horas, se evaluó el número de células /cuerpos apoptóticos viables. El ensayo se realizó por triplicado y se repitió al menos en dos experimentos independientes.
2 dimensiones (2D) y 3 (3D) colonia dimensional ensayo de formación de
La capacidad de aislado solo CD133 + y CD133- células para formar colonias se ensayó tanto en 2 cultura dimensional (2D) y 3 cultura dimensiones (3D). Para el cultivo 2D, 300 células recién según se sembraron en pocillos individuales de una placa de 6 pocillos y se cultivaron durante 14 días. Las células fueron teñidas con azul de metileno y las colonias que contienen más de 20 células fueron contadas. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y en dos ocasiones.
cultura 3D se realizó para evaluar la capacidad colonogenic de las poblaciones clasificadas en condiciones no adherentes. Las células (2500 de cada población CD133 + y CD133-células) se contaron y se resuspendieron como células individuales en 0,7% de agarosa de grado ADN (Sigma Aldrich) .Este se superpone sobre una base de agar grado ADN 1% (Sigma Aldrich) y la parte superior e capas de base se mezclaron con 2X DMEM. Los experimentos se realizaron por triplicado y medio cambian dos veces por semana. Después de dos semanas, se contó el número de colonias que se desarrollaron dentro de cada pocillo y se visualizó con un microscopio después de teñir con 0,05% de cristal violeta durante 1 hora y se fotografiaron campos representativos. Por tanto en 3D y la cultura 2D, la eficiencia de formación de colonia por ciento (CFE) se calculó como sigue,% CFE = (Número de colonias obtenidas /Número de células cultivadas) X 100 [23]. Los valores log transformadas se utilizaron para el análisis estadístico.
in vitro
la migración de ensayo
ensayos de migración celular Transwell se realizaron utilizando una cámara de Boyden que contiene un filtro de policarbonato con un 8 micras tamaño de poro (Costar). Se añadió medio de cultivo (600 l) suplementado con 20% de FBS a la cámara inferior y 2,5 × 10
se añadieron 5 células de las poblaciones clasificadas en la cámara superior (en 100 l de medio de cultivo suplementado con 10% FBS). El número de células que migran a través de la membrana se contó manualmente después de 24 horas. Los ensayos se realizaron por triplicado y en dos ocasiones separadas. La migración celular también se midió utilizando una célula hiriendo ensayo realizado en placas de 6 pocillos (Costar). Las células se cultivaron hasta la confluencia y luego en ayunas durante 24 horas en medio libre de suero. Una punta de pipeta de 200 l estéril se utiliza para crear tres heridas paralelas separadas y la migración de las células a través de la línea de la herida se evaluó después de 24 horas. Se tomaron fotografías con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) (Canon, Japón) unido al microscopio de contraste de fase invertida a una potencia de X40. La distancia entre los bordes se midió a los 6 puntos igualmente distribuidos utilizando el software ImageJ [33] y después se analizó mediante una prueba t de dos colas. Los experimentos se repitieron en dos ocasiones separadas.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 13.0 software. Todas las evaluaciones se realizaron mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas. Para los estudios que implican celular y recuento de colonias, se analizaron el número de células. En los estudios con una salida numérica de fluorescencia, se utilizaron los valores de fluorescencia primas.
Resultados
poblaciones CD133 expresar en líneas celulares
El tamaño de la población CD133 + se ensayó en 8 aproximadamente se analizaron líneas celulares de CRC por citometría de flujo y en cada caso 500 000 células. En dos líneas celulares (DLD1 y SW837), las células CD133 + no eran detectables. Se encontró que el tamaño de la población CD133 + a ser & gt; 95% en dos líneas celulares (Caco2 y HT29). En las restantes líneas celulares, una población bimodal estuvo presente con un CD133 + población que oscila entre 32-64% (Figura 1).
Ocho líneas celulares de CRC se probaron y se mostraron variación del tamaño de la población de células CD133 +. (A) Flujo de muestra citometría de imágenes se muestra para Caco2 (paneles de la izquierda, & gt; 95% de células positivas) y SW837 (paneles de la derecha). El análisis se realizó utilizando AC133 1 anticuerpo /(panel superior) y gating se realizó para cada línea celular utilizando un control de isotipo (panel inferior), PMTLin 1 es photmultiplier lineal tubo 1 que indica la dispersión lateral) (b) muestra que en dos líneas celulares no hay células CD133 + identificadas, mientras que en dos líneas celulares de casi todas las células eran CD133 +. Las líneas celulares restantes habían variable tamaño de la población de células CD133 +.
Splice variantes de CD133 en líneas celulares de CRC y normal de la mucosa
La expresión de los dos principales variantes de empalme de CD133 (AC133- 1 y AC133-2) se ensayó mediante RT-PCR en ambas líneas celulares y muestras de mucosa normal. Un solo producto fue visto en geles de agarosa, que, en la secuenciación, se encontró que era la variante de empalme AC133-2 más corta de la que el exón 4 se empalma a cabo (Figura 2a y 2c). Sin embargo, más cortos los productos de PCR se someten a amplificación preferencial y es posible que los productos de mayor tamaño pueden pasarse por alto tanto por electroforesis en gel de agarosa y la secuenciación (especialmente si está presente en niveles bajos). El análisis se perfeccionó mediante la realización de PCR utilizando SYBR verde como un colorante indicador. Evaluación de la curva de disociación mostró la presencia de un solo producto de PCR solamente (Figura 2b).
Las líneas celulares y muestras de mucosas normales se ensayaron para la expresión de los dos principales variantes de corte y empalme CD133 mediante RT-PCR con cebadores anclados en cualquiera de los lados del exón empalmado fuera (exón 4). se identificó datos se muestran unos ejemplos que demuestran solamente un solo producto cuando los productos de PCR se analizaron en ambos (a) en gel de agarosa y (b) la técnica más sensible Q-PCR utilizando SYBR Green como reportero. M = marcador de tamaño, NC = control negativo, * representa DLD1. (C) La secuenciación de los productos mostró que el exón 4 se corta y empalma de la secuencia de codificación se está expresando por tanto, sólo la variante de empalme más corta (AC133-2). La secuencia anterior es el electroferograma de AC133-1 con el exón 4 se muestra entre líneas.
Desmontables de CD133
HT29 tiene un alto nivel de expresión de CD133. Las células fueron transfectadas con cualquiera de CD133 específico o revueltos control de siRNA y se ensayaron 72 horas después de la transfección. Western blot mostró que la proteína era prácticamente indetectable en el cuando se utilizó CD133 siRNA específico. En contraste, la transfección del ARNsi de control no tiene efecto en la expresión de proteínas (Figura 3).
Células
HT29 fueron transfectadas ya sea con CD133 específica siRNA (HT29
CD133-) o revueltos control ((HT29
SSC). Western Blot confirmó la pérdida de expresión de CD133 por el gen desmontables. ß-actina muestra la carga igual de proteínas.
Asociación de expresión de CD133 con la proliferación celular
Se comparó la proliferación tasa entre las células con niveles altos y bajos CD133 utilizando dos enfoques experimentales. En HT29 la proteína CD133 fue derribado y el número de células monitoreado durante 5 días (Figura 4a) mientras SW480 fue sorteado en CD133 + /poblaciones CD133- y el número de células fueron monitoreados durante 9 días (Figura 4b). Ambos experimentos mostraron los mismos resultados, es decir, no hubo diferencia significativa entre las células con expresión alta o baja CD133. del mismo modo, los recuentos de flotante cuerpos apoptóticos durante este período no mostraron ninguna diferencia (datos no mostrados).
La proliferación celular se evaluó después de desmontables de CD133 en HT29 (Figura 4a) y la clasificación de SW480 en poblaciones puras CD133 + y CD133- (Figura 4b). Un ensayo de evolución en el tiempo se llevó a cabo durante varios días sin asociación observada entre el número de células CD133 y.
Asociación de expresión de CD133 con la formación y la apoptosis inducida por estaurosporina colonia
Una característica que puede ser esperado en las células madre es la resistencia a la apoptosis tras el estrés exógeno. Ambos enfoques experimentales se utilizaron para probar el efecto de los niveles de CD133 en la resistencia a la apoptosis cuando se expone a estaurosporina durante 24 horas. Resultados concordantes se obtuvieron lo que indica que los altos niveles de CD133 confiere resistencia estaurosporina. Menos células HT29
CD133- viables que estaban presentes HT29
células SSC (Figura 5a, p = 0,01); por el contrario mayor número de células viables estaban presentes en la población CD133 + ordenados que la población CD133- (Fig. 5b, p = 0,008). Sin embargo no había diferencia entre las células cuando se exponen a DMSO solo.
CD133 dio resistencia a la apoptosis inducida por estaurosporina. La figura 5a muestra que después de la exposición a estaurosporina había menos células viables después de la transfección con CD133 siRNA específico (HT29
CD133-) que con control mezclado (HT29
ssc) (p = 0,01). No hubo diferencias entre las células después de la exposición a DMSO. La figura 5b muestra que el CD133 + población de SW480 mostraron células mostraron significativamente mayor resistencia que la población CD133- (p = 0,008). células Figura 5c y 5d muestran CD133 + fueron significativamente más clonogénico de células CD133- (p & lt; 0,0001 y p & lt; 0,003) en cultivo 2D y 3D respectivamente. Figuras 5e (colonias formadas por células CD133 +) y 5F (colonias formadas por células CD133-) muestran que ambas poblaciones CD133 + y CD133- de SW480 fueron capaces de formar colonias de células individuales (colonias típicas se muestran).
Otra característica de "troncalidad" es la capacidad de formar colonias. Esto fue probado por el crecimiento de las células individuales en agar blando de dos semanas de cultivo (3D) y de cultivo 2D y la ordenada CD133 + y CD133 - se compararon células. En ambos casos, las colonias eran visibles después de dos semanas, pero el número de colonias fue significativamente mayor en las células CD133 + (P & lt; 0,0001 y P & lt; 0,003). En cultivo 2D y 3D respectivamente (Figura 5c y 5d)
Asociación de expresión de CD133 con la migración celular
análisis comparativo de la motilidad celular entre las células con expresión alta y baja CD133 se puso a prueba mediante ensayos de migración transwell. Ambas condiciones experimentales producen resultados concordantes. Un número significativamente menor HT29
CD133- células migraron a través de la membrana de HT29
células SSC (Figura 6a, p = 0,04). números contrario, significativamente mayor de células CD133 + migrado que las células CD133- (Figura 6b, p = 0,03). Un ensayo hiriendo celular también se utilizó siguiente gen desmontables que mostraron que los bordes de la herida fueron significativamente más estrecha en HT29
células ssc que en HT29 células
CD133- (p & lt; 0,001) lo que confirma la relación entre la expresión de alto CD133 y el aumento motilidad celular (Figura 6c).
migración
Transwell se midió después de desmontables de CD133 en HT29 y clasificación de SW480 en poblaciones CD133 +/-. Un número significativamente menor HT29
CD133- células migraron a través de la membrana de HT29
células SSC (Figura 6a, p = 0,04). Por el contrario, un mayor número de células CD133 + ordenados migrado que las células CD133- (Figura 6b, p = 0,03). También se realizó un ensayo de heridas y desmontables gen se asoció con marcado retraso en el cierre de la herida, que era visiually perceptible después de sólo 24 horas (Figura 6c) y estadísticamente significativa (p & lt; 0,001).
Plasticidad de la expresión de CD133 en líneas celulares
La línea celular SW480 se clasifica en las poblaciones CD133 + y CD133- que se mantuvieron en condiciones de cultivo de tejidos y se sometieron a análisis periódico por citometría de flujo. Inmediata re-análisis mostró que las poblaciones CD133 + y CD133- fueron, respectivamente, 97,6% y 99,9% de pureza (Figura 7a). PCR cuantitativa mostró represión de la transcripción de CD133 en la población CD133- y aunque CD133 ARNm todavía era detectable, fue sólo en el 15% del nivel visto en el CD133 + de la población (Figura 8).
SW480 se clasifica en CD133 poblaciones positivas y negativas que luego se cultivaron por separado. (A) de apertura de puerta se fija de modo que se recogieron sólo las poblaciones extremas que, al repetir el análisis inmediato, se demostró que las poblaciones muy puros. (B) Después de un cultivo prolongado, tanto de las poblaciones clasificadas se convirtió bifásica. Las proporciones de las células CD133 + y CD133- se estabilizaron después de tres semanas y no cambiaron después de que (a pesar de que no eran los mismos que la línea celular parental original).
Q-RT-PCR análisis de las poblaciones según mostró que no había represión transcripcional de
CD133
en la población CD133- (aunque los niveles bajos de mRNA eran todavía detectable).
cultivo prolongado resultó en ambas poblaciones revertir a un perfil bimodal. La población CD133 +, después de 3 semanas, consistió en células 70% CD133 + y células CD133- 30%, las frecuencias que se mantuvo estable a partir de entonces durante al menos 3 meses. Los resultados van en contra de los informes publicados en los que las poblaciones puras de células CD133 + revierten al índice normal de CD133 +/- poblaciones [8]. Las células CD133- desarrollaron una población de células CD133 +, que, después de 3 semanas, llegó a 17%, pero no aumentó después (Figura 7b).
Discusión
El CD133 + población es variable en la celda CRC líneas
Hemos examinado un gran número de células a partir de ocho líneas celulares de CRC bien establecidas por citometría de flujo para cuantificar el tamaño de la población CD133 +. Se encontró que, en dos líneas celulares (DLD1 y SW837) no hay células CD133 detectable +, en dos líneas celulares (Caco2 y HT29) el CD133 + población era & gt; 95% de las células tumorales del total, mientras que las restantes líneas celulares tenían tamaños de la población que van desde 32% -64%. Nuestros datos están de acuerdo con estudios realizados por letaet al. y Dalerba et al. [18], [24] que informó de niveles similares de expresión de CD133 en las líneas de células HT29, Lovo y ninguna expresión en DLD1. Nuestros datos son sin embargo discrepante con los de O'Brien y Ricci-Vitiani [8], [9], aunque la causa de esta discrepancia es desconocida. Una posibilidad es que nuestros estudios utilizaron líneas celulares establecidas, mientras que los otros estudios utilizaron nuevas líneas celulares derivadas de sus propios laboratorios. Es posible que el cultivo prolongado puede causar cambios en la regulación mantenidos CD133 aunque esto en sí mismo sugiere que la expresión de CD133 no es un muy buen marcador de células madre cancerosas. Las diferencias en la técnica pueden proporcionar otra explicación aunque utilizamos los mismos anticuerpos como O'Brien y Ricci-Vitiani y mantuvimos los tiempos de incubación con el anticuerpo primario hasta los 15 minutos. De cualquier manera, nuestros datos han demostrado de manera inequívoca que en 4/8 líneas celulares, la población CD133 + está ausente o comprende casi toda la población de células tumorales. Estos datos, junto con otros datos que se presentan a continuación, nos llevan a la conclusión de que CD133 probablemente no es un marcador específico de las células madre en el CCR.
Sólo variante de CD133 de empalme AC133-2 se expresa en el tejido del colon
a pesar de una amplia variedad de variantes de empalme se han descrito para CD133, sólo uno (denominado AC133-1 y que fue el primero en ser clonado) se ha asignado un número de secuencia de referencia. Este contiene la secuencia completa de codificación de longitud, mientras que una segunda variante de empalme (AC133-2, el segundo en ser clonado) aparece para empalmar a cabo el exón 4. Nuestro análisis de las 8 líneas celulares de CRC y 10 muestras de mucosa normal, utilizando tanto el punto final y metodologías en tiempo real, identificado solamente AC133-2 variante. Esto sería consistente con el estudio de Yu et al. [25] en el que AC133-2 se informó como la variante de empalme que está presente en muchos compartimentos de células madre mientras que se limita a AC133-1 cerebro fetal y el músculo esquelético.
expresión CD133 está asociado con algunas de las características de el fenotipo de células madre
con el fin de evaluar la función de CD133, la línea celular HT29 se probó después desmontables de CD133 por la interferencia de ARN. Este método también puede producir efectos "fuera de objetivo" y así se utilizó un enfoque complementario para separar SW480-una línea de células CD133 + con una población de 40% - en las poblaciones puras CD133 + y CD133-. Ambos tipos de experimentos dieron resultados similares. En primer lugar, los niveles de CD133 no parecen alterar la proliferación celular o la apoptosis. Sin embargo, hubo diferencias significativas en las características que pueden considerarse como parte del fenotipo de células madre. Por lo tanto altos niveles de CD133 se asociaron con mayor clonogenicidad y la resistencia a la apoptosis inducida por estaurosporina. Este último puede ser debido a una resistencia innata a la apoptosis (posiblemente mediada por tales informado de la asociación como entre la expresión de CD133 y genes anti-apoptóticos, tales como FLIP (caspasa 8 inhibidor) y Bcl-2 [26]. Alternativamente, puede ser debido a citoprotectores estrategias mejoradas, tales como la capacidad para extruir de forma activa las sustancias tóxicas del citoplasma [3].
motilidad celular
Otra de las características que encontramos para ser asociado con la expresión de CD133 se ha mejorado. Otros estudios han sugerido un papel para CD133 en células motilidad ya que se expresa clásicamente en salientes de membrana [27], [28]. en ciertas situaciones, tales como la embriogénesis y cicatrización de heridas, las células madre necesitan adquirir características de motilidad. en los CAC, las características de la motilidad mejorada puede permitir la invasión y metástasis de ocurrir, una idea apoyada por el estudio de Rappa y otros que halló expresión CD133 se asoció con metástasis en las células del melanoma [29]. Nuestros datos, sin embargo, contradicen las de Horst et al. [30] que no encontró que la expresión de CD133 se asoció con la motilidad celular en Caco2.