Extracto
señalización de Wnt aberrante está implicada en numerosos cánceres humanos, y la comprensión de los efectos de modulación de los miembros de la vía puede conducir al desarrollo de nuevas terapias. La expresión de la proteína secretada relacionada con Frizzled 4 (SFRP4), un modulador extracelular de la vía de señalización Wnt, se pierde progresivamente más agresivas en los fenotipos de cáncer de ovario. Aquí mostramos que SFRP4 recombinante (rSFRP4) tratamiento de una serosas resultados de la línea celular de cáncer de ovario en la inhibición de la señalización de Wnt dependiente de β-catenina como se mide por el ensayo de reportero de TOP /FOP Wnt y la disminución de la transcripción de los genes Wnt objetivo, AXIN2, CyclinD1 y Myc. Además, el tratamiento rSFRP4 aumentó significativamente la capacidad de las células de cáncer de ovario a adherirse al colágeno y fibronectina, y la disminución de su capacidad para migrar a través de una herida infligida. Llegamos a la conclusión de que estos cambios en el comportamiento celular pueden estar mediados a través de mesenquimal epitelial de transición (MET), como tratamiento rSFRP4 también produjo un aumento de la expresión del marcador epitelial E-cadherina, y la expresión de vimentina y torsión reduce. Combinados, estos resultados indican que la modulación de un solo controlador de acceso aguas arriba de la señalización de Wnt puede tener efectos sobre la señalización Wnt aguas abajo y el comportamiento de células de cáncer de ovario, como mediado a través del epitelio a la plasticidad mesenquimales (EMP). Esto plantea la posibilidad de que SFRP4 se puede utilizar tanto en el diagnóstico como terapéutico en el cáncer de ovario epitelial
Visto:. Ford CE, Jary E, Ma SSQ, Nixdorf S, Heinzelmann Schwarz-VA, Ward, RL (2013) La Wnt gatekeeper SFRP4 modula la EMT, la migración celular y la señalización de Wnt aguas abajo en células cáncer de ovario seroso. PLoS ONE 8 (1): e54362. doi: 10.1371 /journal.pone.0054362
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Julio, 2012; Aceptado 11 de diciembre de 2012; Publicado: 11 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Ford et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado en parte por subvenciones de la fundación de la curación del cáncer de Australia (# 1008633, CEF), Nacional de Salud e Investigación médica del Consejo CJ Martin Fellowship (# 466005, CEF), Instituto del cáncer de NSW (# 09 /CRF /2-02, VHS) , William Maxwell Trust (VHS) y el australiano Real y Nueva Zelanda Colegio de Obstetras y Ginecólogos (VHS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial tiene la mayor mortalidad de todos los cánceres ginecológicos femeninos [1], [2]. A pesar de los últimos conocimientos sobre la heterogeneidad de esta enfermedad [3] - [6], y un debate sobre la celda de origen [7], [8], la mayoría de los pacientes con cáncer de ovario epitelial reciben el mismo tratamiento sistémico (carboplatino, paclitaxel [5] se requiere más investigación sobre las vías moleculares que sustentan esta enfermedad con el fin de identificar nuevos tumores marcadores y dianas para la intervención terapéutica Una vía que ha sido identificado como de importancia potencial en el cáncer de ovario es la vía de señalización Wnt [9] -.. [11 ].
la vía de señalización de Wnt es una ruta de desarrollo crucial que participa en la diferenciación, la polaridad, la migración, invasión, adhesión y la supervivencia [12]. Estos mismos procesos celulares son componentes clave de la génesis tumoral y la metástasis, y de ahí el papel de la señalización de Wnt en el cáncer humano cada vez más está siendo investigado junto con las estrategias terapéuticas dirigidas a componentes de la vía. la desregulación de la vía de señalización Wnt se ha implicado en numerosos tipos de cáncer, incluyendo aquellos con alta prevalencia y /o malos resultados como el colorrectal, de mama, de ovario, y cáncer de próstata (revisado en [13]).
Esta red de señalización multifacético tradicionalmente se ha simplificado dividiendo la red en canónica (β-catenina dependiente) y las vías no canónicos (β-catenina independientes). canónica de señalización Wnt implica la unión del ligando Wnt a uno de los diez receptores Frizzled (Fzd) en la presencia de una proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) co-receptor. Esto genera una cascada de eventos que conducen a la desmontaje del complejo destrucción Axin /APC /GSK3 y la estabilización de β-catenina. La acumulación de β-catenina en los resultados de citoplasma en la translocación al núcleo y la activación mediada por TCF /LEF de los genes diana implicados en la diferenciación y proliferación celular. abajo objetivos clave de la señalización de Wnt canónica activado incluyen C-myc (
MYC
), CyclinD1 (
CCND1
) y AXIN2 (
AXIN2
) [12].
La vía Wnt está regulada en varios niveles, con los antagonistas de Wnt o "guardián" de proteínas que reciben atención en los últimos años, debido a su inactivación frecuente en el cáncer. Este grupo de moduladores Wnt incluye la familia Dickkopf (DKK1-4), WIF-1 y la familia de proteínas receptoras secretadas frizzled (SFRP1-5). SFRPs son proteínas extracelulares solubles se caracterizan por su frizzled-como cisteína dominio rico (CRD), que se piensa que es responsable de su capacidad para modular la señalización de Wnt uniéndose directamente a ligandos Wnt o receptores Frizzled. SFRPs se han demostrado que funcionan como supresores de tumores en otros tipos de cáncer [14] - [17]. Hemos demostrado anteriormente que uno de estos porteros, SFRP4, es secretada en el torrente sanguíneo y perdió progresivamente más agresivas en los fenotipos de cáncer de ovario, como el tipo de cáncer II [18]. Además, los pacientes que carecen de expresión SFRP4 tenían un peor pronóstico que aquellos que expresan SFRP4 [18].
transición epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso de desarrollo clave que las células cancerosas secuestran para aumentar su agresividad y potencial invasivo [19] . A pesar de tipo complejo y específico de células, las células sometidas a la EMT se pueden caracterizar por la pérdida de E-cadherina y el aumento de la vimentina, Twist and Caracol. El proceso de transición también puede ocurrir en la dirección opuesta (mesenquimales a la transición epitelial (MET).) Ahora se entiende que MET es de igual importancia en la organogénesis y la metástasis, y que existen muchos estados de células intermedias o "metaestables" como transición células entre los dos extremos [20], [21]. Este proceso dinámico que se ha denominado epitelio mesenquimal a la plasticidad, o EMP. Muchas vías de señalización se han relacionado con EMP, en particular el TGF-β, Notch y vías de Wnt.
En el presente estudio se investigan los efectos funcionales de la modulación de un controlador de acceso vía Wnt clave, SFRP4 en la señalización de Wnt, célula comportamiento y EMT. Se presenta por primera vez que re-expresión de SFRP4 en una línea celular de cáncer de ovario epitelial inhibe la señalización de Wnt, aumenta la adherencia, inhibe la migración celular e inhibe la EMT. Dado que la expresión SFRP4 se ha demostrado que se pierde en la gran mayoría de pacientes con cáncer de ovario [18], esto plantea la posibilidad de que la modulación de la señalización de Wnt a través de SFRP4 u otros miembros de la vía Wnt aguas arriba puede representar una nueva vía para la terapia dirigida en el cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
cultivo de células
OVCAR3 células humanas de cáncer de ovario seroso, obtenidas a partir de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE.UU.) se cultivaron en RPMI que contenía 10% de suero de ternera fetal. El medio se suplementó con penicilina /estreptomicina (90 unidades /ml de penicilina; 90 mg /ml de estreptomicina) y 1,8 mM glutamax (Life Technologies). Todas las células se cultivaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2, a 37 ° C y se demostraron estar libres de contaminación por micoplasma.
reportero ensayos Wnt
Se sembraron células OVCAR3 a una concentración de 5000 células /pocillo en blanco de fondo placas de 96 pocillos. Las células fueron privadas de suero durante la noche y co-transfectaron con 0,2 g de cualquiera de TOPflash (3 sitios de unión × TCF4) o FOPFLASH (3 × mutado TCF4 sitios de unión) plásmidos de expresión (Millipore, Temecula, CA, EE.UU.), y 0,1 g PRL-TK (vector Renilla-TK-luciferasa, Promega) como un control, usando Lipofectamine2000. Las células se trataron posteriormente con dosis crecientes de rSFRP4 y /o Wnt3 recombinante un (rWnt3 un 0,1 g /ml) durante 48 horas antes de las actividades de luciferasa se midió usando un Glomax 96 de microplacas luminómetro (Instrumento Biosystems Turner, Sunnyvale, CA, EE.UU.). la actividad de la luciferasa de luciérnaga se normalizó la eficiencia de transfección dividiendo por la actividad de la luciferasa de Renilla. La relación de TOP /FOP se utilizó como medida de la β-catenina transcripción impulsada. actividad media y las desviaciones estándar se obtuvieron a partir de muestras octopulate transfectadas.
transcriptasa inversa-PCR cuantitativa (qPCR)
Tras el tratamiento con ADNasa, 1 g de ARN total fue transcrito a cDNA utilizando el kit de RT Quantitect (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Controles que contienen ARN, pero sin la transcriptasa inversa se incluyeron para todas las muestras. qPCR se realizó por triplicado en una máquina de 3005 P Stratagene MxPro usando 25 ng de molde de ADNc y SYBR mezcla verde /Rox maestro (Qiagen). La expresión se normalizó a tres genes de limpieza diferentes (SDHA, HSPCB, YWHZA) utilizando el método de normalización Vandesompele [22]
Primer secuencias utilizadas para qPCR fueron SFRP4:. Hacia delante (F) 5 'TGTGTTACGAGTGGCG 3', inversa ( R) 5 'GGGGGATTACTACGACTG 3', CDH1: R F 5 'AGGCCAAGCAGCAGTACATT 3' 5 'ATTCACATCCAGCACATCCA 3', 'CCAAACTTTTCCTCCCTGAACC 3' VIM F 5 R5 'GTGATGCTGAGAAGTTTCGTTGA 3', 'GCCAATCAGCCACTGAAAGG 3' TWIST F 5 R5 'TGTTCTTATAGTTCCTCTGATTGTTACCA 3' , 'TCAAGTGCAAACTTTCGCCAACC 3' R5 'TAGCCAGAACCTATGTGATAAGG 3' AXIN2 F 5, 'CGTCTCCACACATCAGCACAA 3' MYC F 5, R5 'CACTGTCCAACTTGACCCTCTTG 3', 'GGCGGAGGAGAACAAACAGA 3' CCND1 F 5 R5 'TGGCACAAGAGGCAACGA 3', JNK F 5'TCTGGTATGATCCTTCTGAAGCA 3 'R5' TCCTCCAAGTCCATAACTTCCTT, RHOA F 5 'GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT 3' R5 'GGCTGTCGATGGAAAAACACAT 3', RAC1 F 5 'TGTAGTCGCTTTGCCTATTGATG 3' R5 'CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3', PRKCA F 5 'GCTTCCAGTGCCAAGTTTGC 3' R5 'CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3', SDHA F 5 'CTTGAATGAGGCTGACTGTG 3' R5 'ATCACATAAGCTGGTCCTGT 3', R HSPCB F 5 'TCTGGGTATCGGAAAGCAAGCC 3' 5 'GTGCACTTCCTCAGGCATCTTG 3', 'ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 3' YWHZA F 5 R5 'CCGCCAGGACAAACCAGTAT 3'.
Western Blots
Los lisados celulares se prepararon por lisis de células en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, pirofosfato de sodio 5 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, fluoruro de sodio 50 mM, 0,27 M de sacarosa, 1 × completa inhibidor de la proteasa (Roche, Basilea, Suiza)). Los lisados se centrifugaron y se recogió el sobrenadante para el análisis de la concentración de proteína usando el kit BCA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). lisados de proteínas nucleares se prepararon por lisis de células en helado Núcleos Buffer (10 mM Tris, pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, EDTA 0,1 mM y 0,5% NP-40, inhibidores de la proteasa) y se incubaron en hielo durante 10 minutos . Los núcleos se recuperó por centrifugación a 900 g durante 3 min, se lavaron en núcleos de tampón de lavado (Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM y EDTA 0,1 mM que contiene inhibidores de la proteasa) y se resuspendieron en tampón de lisis. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Para el Western Blot, los anticuerpos contra SFRP4 (ab32784, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), E-cadherina (# 3195, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.), vimentina (# 5741, Cell Signaling Technology), Twist (# sc15393, se utilizaron Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), β-catenina (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), histona H3 (# 9715s, señalización celular) y α-tubulina (# 3873, Cell Signaling Technology). Las bandas de proteínas fueron detectados y cuantificados utilizando la imagen Quant LAS 4000 (GE Healthcare).
Migración ensayos
Se sembraron células OVCAR3 en ibidi Cultura-Inserción (ibidi GmbH, Am Klopferspitz 19, 82152 Martinsried , Alemania) y se trataron durante 24 horas con rSFRP4 (5 g /ml). inserciones ibidi se retiraron y el cierre de la herida resultante se controló durante las próximas 48 horas. Imágenes de la herida fueron capturados en diferentes puntos de tiempo utilizando el sistema Leica DMIL microscopio (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).
ensayos de adhesión
placas de cultivo de tejidos se revistieron con soluciones de 10 mg /ml tipo I colágeno (Sigma, Castle Hill, Australia), 5 mg /ml de fibronectina (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos) o el 3% de BSA en PBS y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Las placas se enjuagaron con 80% de etanol, se incubó en 3% de BSA en medio libre de suero durante 30 min a 37 ° C y se aclararon de nuevo con PBS. Las suspensiones celulares se añadieron a las placas recubiertas y se dejaron adherir durante 4 horas a 37 ° C. Las placas se lavaron suavemente con PBS, se fijaron con etanol al 96% y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. El exceso de tinte se eliminó lavando ampliamente placas con agua estéril. Después las placas se habían secado, las células se lisaron con 50% de ácido acético y la absorbancia se leyó a 595 nm usando un lector de microplacas SpectraMax Absorbancia Plus384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (SD). Las estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student de dos colas. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001
Resultados y Discusión
SFRP4 inhibe la señalización de Wnt en una línea celular de cáncer de ovario seroso
a raíz de nuestro trabajo previo que indica que la pérdida SFRP4 fue un evento frecuente en el cáncer epitelial de ovario [18] hemos determinado si la adición de recombinante humana SFRP4 (rSFRP4)
in vitro
podría inhibir la señalización de Wnt dependiente de β-catenina. Seleccionamos la línea celular de cáncer de ovario seroso OVCAR3 para estos experimentos ya que carece de cualquier expresión SFRP4 detectable y se había informado anteriormente a exhibir la señalización de Wnt constitutiva (como se evidencia por la acumulación /presencia de β-catenina nuclear, [23]). La estimulación de las células OVCAR3 con Wnt3a recombinante (rWnt3a) resultó en un aumento significativo en la señalización de Wnt dependiente de β-catenina como se mide a través de TOP /FOP FLASH luciferasa ensayo indicador de Wnt (Figura 1A), confirmando que era de hecho una línea celular sensible Wnt. A continuación, prueba concentraciones crecientes de rSFRP4, y se encontró que se requería 5 g /ml de rSFRP4 para inhibir significativamente β-catenina dependientes de señalización Wnt (Figura 1A). Esta concentración de rSFRP4 también ha demostrado inhibir los niveles de proteína de β-catenina en el núcleo (Figura 1B). a continuación, se utilizó esta concentración en todos los experimentos posteriores.
células (A) OVCAR3 fueron co-transfectadas con pRL-TK (Renilla) y, o bien TOPflash o plásmidos de expresión FOPFLASH. Las células se trataron posteriormente con dosis crecientes de rSFRP4 y /o recombinante Wnt3 un (rWnt3a 0,1 g /ml) durante 48 horas antes de las actividades de luciferasa se midió usando un luminómetro de microplacas Glomax 96. actividad media y las desviaciones estándar se obtuvieron a partir de muestras octopulate transfectadas. Los resultados representan la media de 3 experimentos y las barras representan la desviación estándar (S.D.) de la media. *
P Hotel & lt; 0,05. (B) representativo que muestra inmunotransferencias aumentaron SFRP4 y la disminución de expresión de la proteína β-catenina nuclear en las células OVCAR3 después del tratamiento de 72 horas con rSFRP4 (5 mg /ml). expresión SFRP4 panel superior (SFRP4, ab32784, Abcam, Cambridge, Reino Unido), segundo panel de α-tubulina expresión (α-tubulina#3873, señalización Cell Technologies, Danvers, MA, EE.UU.), tercer panel β-catenina nuclear (# sc7963, Santa Cruz de Biotecnología), el panel inferior de la histona H3 (# 9715s, señalización celular). (C) El análisis densitométrico de la expresión de proteínas SFRP4 en 3 experimentos separados. Las barras representan la S.D. de la media. *
P Hotel & lt; 0,05. (D) la expresión del ARN SFRP4 relativa se aumenta en las células OVCAR3 tratados con rSFRP4 (5 mg /ml) durante 48 horas. QRT-PCR se realizó por triplicado y se normalizaron a tres diferentes genes de limpieza (SDHA, HSPCB, YWHZA). Los resultados representan una media de 6 experimentos. Las barras representan la S.D. de la media. *
P Hotel & lt; 0,05. (E) la expresión relativa de los genes diana dependientes Wnt β-catenina se redujo en las células OVCAR3 tratados con rSFRP4 (5 mg /ml) durante 48 horas. QRT-PCR se realizó por triplicado y normalizado a tres genes de limpieza diferentes (SDHA, HSPCB, YWHZA) Expresión de AXIN2, MYC y CCND1 se redujeron en rSFP4 células tratadas, en comparación con el grupo control. Los resultados representan un promedio de 4 experimentos y las barras representan la S.D. de la media. *
P Hotel & lt; 0,05. (F) Expresión relativa de β-catenina genes diana independientes Wnt se mantuvo sin cambios en las células OVCAR3 tratados con rSFRP4 (5 mg /ml) durante 48 horas. QRT-PCR se realizó por triplicado y normalizado a tres genes de limpieza diferentes (SDHA, HSPCB, YWHZA) Expresión de JNK, RHOA, RAC1 y PRK2A se mantuvieron sin cambios en rSFP4 células tratadas en comparación con el grupo control. Los resultados representan un promedio de 3 experimentos y las barras representan la media de la media.
Cuarenta y ocho horas de tratamiento con rSFRP4 (5 mg /ml) conducen a un aumento de dos veces aproximado en SFRP4 ARNm y proteínas , como la adición de las proteínas Wnt recombinantes extracelulares aumenta la producción de proteína endógena. (Figura 1B-D). La expresión de tres genes diana Wnt aguas abajo CyclinD1 (CCND1), C-myc (MYC) y AXIN2 (AXIN2) disminuyeron después del tratamiento rSFRP4 (Figura 1E). Sin embargo, de estos 3 genes, única expresión AXIN2 se redujo significativamente (
P
= 0,03). En contraste con CCND1 y MYC, AXIN2 es bien aceptado como un gen diana específico Wnt, y hasta la fecha no se ha relacionado con otras vías de señalización [24] - [27]. El aumento de expresión de AXIN2 se informó en los pacientes con cáncer de ovario seroso en un estudio reciente [10], lo que indica que la señalización Wnt aberrante puede ser más generalizada en el cáncer de ovario epitelial que se pensaba. Tanto MYC y CCND1 se sabe que funcionan en otras vías de señalización cruciales implicados en la carcinogénesis de ovario [28] - [31] lo que puede explicar por qué se mostraron más débiles cambios de expresión que AXIN2 en respuesta al tratamiento SFRP4. Sin embargo, es de notar que la adición de SFRP4 en nuestro sistema era capaz de reducir la transcripción de tres genes aguas abajo de la vía de señalización de Wnt, pero no tuvo efecto sobre los objetivos de aguas abajo de la señalización de Wnt independiente β-catenina (Figura 1F), ni en un receptor de aguas arriba de la vía (FZD7) y tres receptores no relacionados (EGFR, ERBB3, AKT, datos no presentados).
combinados, estos experimentos iniciales demuestran que la adición de un único modulador vía Wnt puede modular gen la transcripción en una línea celular de cáncer de ovario seroso modelo. Basado en el ensayo indicador de TOP /FOP Wnt, transferencias Western y Wnt resultados de genes diana, nuestros datos también sugieren que en el caso de cáncer de ovario, SFRP4 en efecto, la función como un antagonista de la vía de señalización Wnt dependiente canónico o β-catenina. También parece que SFRP4 no actúa para inhibir la β-catenina de señalización Wnt independiente, como cuatro genes diana no se vieron afectados por el tratamiento con SFRP4. Esto es de interés, ya que es poco claro en el campo de la señalización Wnt exactamente qué ligandos Wnt son inhibidas por que los miembros específicos de la familia SFRP, y si en algunos casos SFRPs puede en realidad aumentar en lugar de inhibir la señalización [32] Wnt - [34 ].
tratamiento SFRP4 disminuyó la migración y el aumento de la adhesión de células de cáncer de ovario
tratamiento SFRP4 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular (Figura 2A), pero inhibe de manera significativa la capacidad de las células OVCAR3 a migrar a través de una herida infligida (Figura 2B). También se demostró que la adición de SFRP4 aumentó la capacidad de las células de cáncer de ovario a adherirse al colágeno y placas de cultivo de tejido recubiertos de fibronectina (Figura 2C). Estos datos sugieren que SFRP4 tiene la capacidad de inhibir el potencial metastásico de células de cáncer de ovario
in vitro
, que encaja con la presentación de informes nuestros datos clínicos previos que los pacientes que expresan SFRP4 tuvieron mejor supervivencia libre de progresión y global en comparación con aquellos que carecen de SFRP4 expresión [18]. Se suma a la creciente evidencia de que la vía de señalización Wnt puede jugar todo un papel en la metástasis del cáncer en lugar de la iniciación del cáncer.
(A) 24 horas rSFRP4 tratamiento (5 mg /ml) no tuvo ningún efecto sobre las células proliferación, tal como se mide mediante recuento celular azul de tripano usando el sistema condesa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los resultados representan la media de 3 experimentos y las barras representan la S.D. de la media. (B) SFRP4 inhibe la migración celular. OVCAR3 células fueron sembradas en ibidi Cultura: inserta y se trataron durante 24 horas con rSFRP4 (5 mg /ml). inserciones ibidi se retiraron y el cierre de la herida resultante se controló durante las próximas 24 horas. El experimento se repitió tres veces y los resultados representan la media del porcentaje de herida abierta y barras representan el s.d. **
P Hotel & lt; 0,01. (C) SFRP4 aumento de la adhesión al colágeno y fibronectina. Se permitió sFRP4 (5 g /ml, 48 horas) las células tratadas adherir durante 4 horas a 37 ° C o bien 10 ug /ml Tipo I colágeno o 5 ug /ml de fibronectina, a continuación se lavaron, se lisaron y la absorbancia medida a 595 nm usando la absorbancia lector de microplacas SpectraMax Plus384. Los resultados representan la media de 6 experimentos y las barras representan la S.D. de la media. *
P
. & Lt; 0,05
SFRP4 inhibe la EMT en las células de cáncer de ovario
Como los cambios en el comportamiento celular están vinculados a la EMT, que también investigó si haría SFRP4 afectar a la morfología celular y la expresión de los marcadores clave de EMT, e-cadherina (CDH1), vimentina (VIM), y TWIST1 (TWIST1). Mientras que no se observaron cambios obvios en la morfología celular 48 horas después del tratamiento SFRP4 (Figura 3A), el tratamiento con rSFRP4 aumentó la expresión de E-cadherina (Figura 3B-D), y reducción de la expresión de vimentina y Twist (Figura 3B-D) a tanto a nivel de transcripción y traducción, sugerente de inicio de MET.
(a) tratamiento SFRP4 (5 mg /ml, 48 horas) no causó ningún cambio obvio a la morfología de las células de la línea celular de cáncer de ovario seroso , OVCAR3 (aumento de 10x). (B) E-cadherina (CDH1) expresión se incrementó significativamente, y vimentina y la torcedura disminuyó en SFRP4 (5 mg /ml, 48 horas) las células tratadas OVCAR3. QRT-PCR se realizó por triplicado y se normalizaron a tres diferentes genes de limpieza (SDHA, HSPCB, YWHZA). Los resultados representan una media de 6 experimentos y las barras representan la S.D. de la media. **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,001. (C) inmunotransferencias representativo que muestra aumentaron CDH1, y la disminución de VIM y expresión de proteínas en células OVCAR3 TWIST1 después del tratamiento de 72 horas con rSFRP4 (5 mg /ml). la expresión de la parte superior del panel CDH1 (# 3195, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.), la expresión segundo panel VIM (# 5741, Cell Signaling Technology), la expresión TWIST1 tercer panel (# sc15393, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU. ), y el panel inferior α-tubulina expresión (α-tubulina#3873, señalización Cell Technology). (D) El análisis densitométrico de CDH1, VIM y TWIST1 expresión de la proteína en 3 experimentos separados. Las barras representan la S.D. de la media. **
P Hotel & lt; 0,01, *
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. & Lt; 0,05
EMT, al igual que la vía Wnt, está más fuertemente relacionada con el desarrollo, sin embargo, recientemente ha recibido un interés generalizado en su potencial como diana para la terapia del cáncer. generalizadas procesos que se producen en todas las células cancerosas son una vía atractiva para la terapia del cáncer, como tratamientos potenciales tendrán aplicabilidad generalizada. Además, la señalización de Wnt aberrante ha sido fuertemente relacionado con el cáncer de mal pronóstico [12], [35], por lo que una mayor aclaración sobre el papel de esta vía y sus guardianes naturales producirán importantes conocimientos sobre las enfermedades humanas. Se ha sabido durante muchos años que la señalización de Wnt puede afectar a la migración de células de cáncer y la adhesión, y este estudio proporciona evidencia de que estos efectos pueden ser dirigidas a través del proceso de EMT. Nuestros resultados apoyan un estudio reciente que une AXIN2 y EMT en el cáncer colorrectal [27]. Además, la hipótesis de que SFRP4 inhibe la capacidad de ligandos específicos de Wnt para unirse a receptores Frizzled. Sobre la base de dos estudios anteriores, lo que indica que uno Wnt7a se sobreexpresa en el cáncer de ovario [11], y uno que sugiere SFRP4 puede inhibir la unión a Wnt7a Fzd5 en el cáncer de endometrio [36], se especula que bajo condiciones normales se une sFRP4 y secuestra distancia Wnt7a. Sin embargo en el cáncer epitelial de ovario, SFRP4 es silenciada, permitiendo Wnt7a para unirse Fzd5 y activar la señalización de Wnt dependiente de β-catenina, y la unidad de TCF /LEF mediada por la transcripción de genes indicadores tales como Wnt AXIN2, MYC y CCND1.
La vía de señalización Wnt es una vía muy complejo e interconectado relacionado con muchas enfermedades humanas. A medida que la vía se centra principalmente en la embriogénesis y la reparación de tejidos adultos, no se espera que los fármacos dirigidos a esta vía para causar efectos secundarios significativos o toxicidad [37]. Sin embargo, los intentos de orientar la vía de señalización Wnt en cáncer han tenido muy poco éxito, sin fármacos clínicamente aprobados hasta la fecha. Esto puede ser debido a la selección de objetivos de fármacos que residen más aguas abajo en la vía de señalización Wnt (recientemente revisado en [38]). Numerosos estudios han informado de la inactivación de los componentes de nivel superior de la vía Wnt en cáncer, incluyendo miembros de la SFRP y familias DKK, lo que indica un papel clave para estas proteínas controladoras en la oncogénesis [14] - [17], [34], [39] . Estas proteínas extracelulares también tienen un gran potencial como dianas de fármacos debido a su posición aguas arriba de la vía. Este trabajo muestra el potencial de la modulación de la vía ascendente utilizando un único antagonista Wnt. Ya que hay al menos diez antagonistas extracelulares de la vía Wnt actualmente identificados, combinaciones de éstos pueden producir efectos aún más fuertes [40] y es digno de una exploración más profunda.