Extracto
Antecedentes
La metástasis ocurre en una serie de pasos discretos que implican invasión, la angiogénesis, la permeabilidad del espacio linfovascular y el establecimiento de tumores secundarios. el derrame pleural maligno (MPE), un tipo de metástasis tumoral, es generalmente un signo de mal pronóstico para los pacientes con adenocarcinoma pulmonar, aunque su mecanismo subyacente ha recibido menos atención que otros tipos de metástasis tener. El objetivo del presente estudio era confirmar si las células madre del cáncer (CSC) en MPE contribuyen a la "cascada metastásica" a través del epitelio -. Mesenquimal (EMT), anoikis, y la adaptación en el microambiente
Métodos
bloques de tejidos y células pulmonares de la correspondiente MPE muestras de 20 pacientes con adenocarcinoma primario se analizaron por tinción inmunohistoquímica con CSC-representante de marcadores (CD133, Nanog, y OCT-4) y marcadores asociados-EMT (e-cadherina y vimentina). Se analizaron las correlaciones entre estas variables y los parámetros clínico-patológicas. Se investigaron los cultivos primarios de ocho casos de error máximo permitido para caracterizar las propiedades de CSC, incluyendo la expresión del marcador, formación de esferas, y la diferenciación.
Resultados
Las expresiones de marcadores CSC-representativos de los 20 casos de MPE celular bloques eran bastante diversos y variables que van desde 15% a 90%. Más fuerte expresión de marcadores de CSC-representativas y la alteración de los marcadores asociados-EMT se encontraron en los frentes invasivos y en errores máximos permitidos en comparación con la expresión en los tejidos tumorales pulmonares primarios. La expresión de OCT-4 en errores máximos permitidos significativamente relacionados con metástasis a distancia y la etapa, así como inversamente correlacionada con la supervivencia del paciente. Los cultivos primarios confirmaron las propiedades de CSC en el error máximo permitido. Cinco de los ocho casos de MPE produjo racimos de células adecuadas, que también mostraron expresiones variables de marcadores CSC, además de la esfera, la formación y la capacidad para la diferenciación y la metástasis.
Conclusión
Este estudio piloto ofrece una mejor comprensión de la cascada metastásica. El establecimiento de un modelo de error máximo permitido se proporcionará más información sobre el papel de los CAC en la metástasis y puede explicar las altas tasas de fracaso terapéutico para los pacientes con MPE
Visto:. Chen SF, Lin YS, Jao SW, Chang YC, Liu CL, Lin YJ, et al. (2013) El adenocarcinoma pulmonar en el derrame pleural maligno cáncer es riqueza propiedades de células madre durante metastásico Cascade. PLoS ONE 8 (5): e54659. doi: 10.1371 /journal.pone.0054659
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 12 Junio, 2012; Aceptado: 17 de diciembre de 2012; Publicado: May 1, 2013
Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Consejo Nacional de Ciencia, República Popular de China, Grant núms. NSC100-2320-B-016-009 y por el hospital general Tri-Service, la subvención No. TSGH-C101-076. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la metástasis, la propagación de las células malignas de un tumor primario a órganos distantes, es la principal causa de fracaso del tratamiento y la muerte en pacientes con cáncer [1]. Por lo general, comprende una serie de pasos discretos y requiere el transporte de células malignas a través de los vasos sanguíneos y /o linfáticos. Además de los vasos sanguíneos y linfáticos, el líquido corporal también es un posible medio de transporte para la metástasis del cáncer [2]. La afectación de la membrana serosa del adenocarcinoma pulmonar primaria causar derrame pleural maligno inicial (MPE) por lo general indica una etapa tardía del cáncer. De acuerdo con las recientes directrices del AJCC [3], error máximo permitido es metastásico, puede causar molestias considerables, y refleja un mal pronóstico para el paciente. Los derrames pueden ofrecer una única en medio situ para establecer un "nicho premetastatic", y el estudio de este medio pueden ayudarnos a entender cómo las células cancerosas con propiedades similares a las células madre en los derrames contribuyen a la progresión de individuo a grupos de células enriquecidas de pulmón metástasis avanzada cáncer [4].
al reducir su célula-célula o célula-matriz interacciones, las células cancerosas entran en las cavidades serosas, donde se desprenden del tumor principal y se convierten en "sin hogar". Esto desencadena un fenómeno llamado "anoikis "[5]. Se cree que las células malignas que flotan en un estado de anoikis en los derrames de sucumbir a la apoptosis y desaparecer. Sin embargo, en la realidad, ocurre lo contrario, ya que estas células son las únicas capaces de proliferar progresivamente a pesar del microambiente presumiblemente desfavorable. Esto plantea la pregunta: "¿Cómo pueden estas células cancerosas sobrevivir y proliferar para superar la amenaza de anoikis?" Y "¿Qué mecanismo permite a estas células para adquirir señales de supervivencia y por lo tanto sobrevivir y proliferar en una población tumoral flotando en los derrames que carecen de la sólida normales -Fase andamios? "
La presencia de células madre del cáncer (CSC), sobre todo en los tumores sólidos, se ha propuesto recientemente. Células madre cancerosas también se denominan células iniciadoras del cáncer debido a su capacidad de auto-renovación, diferenciación multilinaje, y los niveles más altos de malignidad [6] - [9]. Los estudios han demostrado que células madre cancerosas son resistentes a la terapia y parecen ser responsables de la recurrencia del tumor y la metástasis [6], [10], [11]. aumento de la evidencia muestra que la transición epitelio - mesenquimal (EMT) está implicado en la progresión del cáncer y está estrechamente asociada con la "stemness" de las células del cáncer [12], [13]. MPE pueden servir como reservorio de células tumorales en la cavidad pleural, donde pueden progresar a través de la EMT, se convierten en invasoras de nuevo, y establecer más metástasis [14]. También hay un creciente cuerpo de evidencia que sugiere una relación entre la EMT, la aparición de células madre cancerosas, y la resistencia a los medicamentos [15]. MPE parece ser un modelo ideal y único para el estudio de la relación entre la EMT y las propiedades de CSC.
Varios estudios han sugerido que la supresión de anoikis y el EMT están vinculadas [16], [17]. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre la existencia de células madre cancerosas en los derrames. La mayoría de los estudios de la propagación del cáncer se han centrado en los mecanismos a través de metástasis linfática o rutas hematógenas subyacentes. Menos se sabe acerca de la asociación entre la existencia y propiedades de las células madre cancerosas, la EMT, la supresión anoikis, y el microambiente tumoral en MPE. El objetivo del presente estudio fue para confirmar el posible papel de las células madre cancerosas en los derrames y para explorar el mecanismo implicado en la propagación de los tumores y la relación entre la expresión de marcadores asociados a la EMT y los resultados del paciente. Establecimiento de un modelo de error máximo permitido puede proporcionar una mejor comprensión de la función de células madre cancerosas en la metástasis y las altas tasas de fracaso terapéutico en pacientes con MPE.
Resultados
Confirmación e identificación de adenocarcinoma en el pulmón y derrames pleurales
los tejidos de adenocarcinoma pulmonar primaria y los correspondientes MPE bloques de células de 20 pacientes fueron seleccionados como los grupos de estudio. Esos grupos de estudio emparejados fueron sometidos a la identificación histopatológico y citológico. La expresión inmunohistoquímica de CK-7 y TTF-1 /CEA fue examinado. CK-7 y TTF-1 se pueden detectar inmunohistoquímicamente en los adenocarcinomas pulmonares más [18]. CEA es de valor para confirmar la presencia de un adenocarcinoma y se considera una alternativa mejor para diferenciar entre efusiones malignas y no malignas invasoras [19]. No se detectó expresión de CK-7, tanto en los tumores de pulmón y nidos de células primarias en MPE bloques de celdas. Doble tinción para TTF-1 /CEA mostró que TTF-1, cuya tinción nuclear apareció como un color marrón, y CEA, cuya tinción citoplásmica aparecido como un color rojo, manchado de manera uniforme en los tumores primarios de pulmón, mientras que las células CEA positivas teñidas más fuerte que células TTF-1-positivas en bloques de celdas MPE hicieron (Figura 1A).
(A) la identificación inmunohistoquímica de células de adenocarcinoma mostraron resultados positivos de la CK-7 (flechas) en tanto tumor pulmonar primaria (200 × ampliación, ) y nidos de células en bloque de celdas de error máximo permitido en aumentos más bajos y más altos (a, b) (Ampliación, 40 × 400 × y); Doble tinción de TTF-1 /CEA reveló que TTF-1 (color marrón, puntas de flecha) y CEA (color rojo, flechas) fueron uniformemente positivo manchados en tumor pulmonar primaria (c) (Magnificación, 200 ×), mientras CEA (+) células (flechas) se tiñen más fuertes que los de TTF-1 (+) células (puntas de flecha) en el bloque de células de MPE a aumentos inferiores y superiores (d). (Ampliación, 40 × 400 × y). (B) doble tinción de cadherina E /vimentina mostró que la disminución de la E-cadherina (color marrón, flechas) y el aumento de la vimentina (color rojo, puntas de flecha) expresiones fueron encontrados en los frentes invasivos de tumor pulmonar primario y en el pabellón de MPE. (Ampliación, 200 ×) (C).
Expresiones de marcadores asociados-EMT en tumores primarios y derrames pleurales
Un estudio inmunohistoquímico utilizando los marcadores de EMT asociada a E-cadherina y vimentina, mostró una variedad de patrones de expresión en los 20 pares de muestras de tejido del tumor primario y MPE bloques de células. Los niveles de expresión estaban relacionados con la ubicación, tanto en los adenocarcinomas pulmonares primarios y los bloques de celdas MPE. Una mayor expresión de vimentina y una menor expresión de E-cadherina se encontraron en los nidos de células invasoras y MPE que en el centro de los tumores primarios, lo que indica que las alteraciones de los marcadores de EMT se asociaron con la invasión local y la participación maligno en la cavidad pleural (Figura 1B).
Caracterización y distribución de los marcadores de CSC-representativos relacionados con el microambiente
la mayoría de las muestras MPE mostró inmunoreactividad variable para CD133, Nanog, y OCT-4, y combinaciones de tinción suscitó diferentes intensidades y distribuciones. Una expresión relativamente débil de OCT-4, Nanog, y CD133 siempre se encuentra en el centro de los tumores pulmonares primarios. Se detectaron fuertes niveles de expresión de OCT-4, Nanog, y CD133 en el frente invasivo, que se encuentra en la interfaz entre los nidos de células tumorales y el tejido estromal en adenocarcinomas pulmonar primaria, y en los márgenes exteriores de los nidos de células tumorales en la célula MPE bloques (Figura 2A). Independientemente de intensidad expresada en cada caso, todos los 20 casos de MPE fueron inmunorreactivas más o menos para uno o dos o todos de tres marcadores CSC-representativas. En otras palabras, no había ni un solo caso de MPE negativos para todos los marcadores de CSC-representativos de tres. Debido OCT-4 fue considerado como el marcador de CSC-representante más importante, el porcentaje en relación con OCT-4 expresión presente en 20 casos de bloques de células MPE eran bastante diversa que van desde 10% a 90%. Debido a la heterogeneidad intratumoral, tres patrones de combinación diferentes de positivo OCT-4 combinan con Nanog positivo o negativo, y las expresiones CD133 se identificaron en el error máximo permitido (Figura 2B). Cuatro grupos se clasificaron incluyendo tres principales OCT-4 grupos positivos y negativos de un grupo OCT-4. Tres de 20 casos de MPE fueron positivos para los tres marcadores en el grupo A (3/20, 15%). Cinco de los 20 casos de MPE fueron positivos para OCT-4 y CD133, pero fueron negativos para Nanog en el grupo B (5/20, 25%). Diez de 20 casos de MPE fueron positivos para OCT-4 pero negativo para Nanog y CD133 en el grupo C (10/20, 50%). Los dos casos restantes clasificadas en el grupo 4 fueron negativos para OCT-4 y Nanog, pero positivo para CD133 (2/20, 10%). Los datos originales y análisis estadístico de los 20 casos de error máximo permitido se presentan en la Tabla S1, Tablas 1 y 2.
(A) los resultados inmunohistoquímicos mostraron inmunorreactividad de tres marcadores de CSC-representativos (OCT-4, Nanog, y CD133 ) en el centro del tumor primario (a, b & amp; c) (Ampliación, 200 ×). inmunoreactividad fuerte se presentó en los frentes invasivos (d, e & amp; f) (ampliación, 200 ×) y muchos grupos de células del cáncer (flechas) en MPE a un menor y mayores aumentos (G, H & amp; I). (Ampliación, 40 × 400 × y). (B) la caracterización inmunoquímica de las agrupaciones de células de cáncer en MPE mostró tres principales grupos de combinación (positivo OCT-4, combinado con Nanog positivo o negativo, y las expresiones CD133) se identificaron: Grupo A, positivo para los tres marcadores de CSC-representativos (a, b & amp; c); Grupo B, positivo para OCT-4 y CD133, pero negativo para Nanog (D, E & amp; f); Grupo C, positivo para OCT-4, pero negativo para Nanog y CD133 (g, h & amp; i) con aumentos inferiores y superiores. (Ampliación, 40 × 400 × y).
Correlación de inmunoexpresiones de marcadores CSC-representativos con los parámetros clínico-patológicas
Análisis comparativo entre el CSC-representante marcadores usando el sistema de cálculo del puntaje inmunorreactividad y los parámetros clínico-patológicos demostraron que hubo una significación estadística entre la expresión de octubre-4 y metástasis a distancia (
p = 0,0121
). También hubo una significación estadística entre la expresión de OCT-4 y la etapa (
p
& lt; 0,0001). Sin embargo, no hubo significación estadística entre la expresión de Octubre-4 y otros parámetros clínico-patológicas. No se encontró significación estadística entre la expresión de Nanog y CD133 y todos los parámetros clínico-patológicas. Tras el ajuste de los parámetros clínico-patológicas, OCT-4 también se encontró una correlación positiva con el aumento de probabilidades proporción relacionada con la metástasis (Tablas 3, 4 y 5). Usando el porcentaje de OCT-4 como un predictor de metástasis, tales medición fue muy sensible con alta especificidad (Figura 3). Un análisis más detallado de regresión lineal mostró que immunoexpressions de OCT-4 se correlacionaron positivamente con Ki67 (
r = 0,470
,
p = 0,036
), sin embargo, no hubo correlaciones de Nanog y CD133 con Ki67 ( Figura 4). Las expresiones de OCT-4 también fueron estadísticamente correlacionados e inversamente con la supervivencia del paciente después de un seguimiento mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de 60 meses (Figura 5).
Curva característica de funcionamiento del receptor (ROC) utilizando la porcentaje de OCT-4 como un predictor de metástasis demostró una sensibilidad relativamente alta (66,7%) y una especificidad absoluta (100%). El área bajo la curva ROC fue de 83,8%.
Análisis comparativo mediante la prueba de regresión lineal de CSC-representante de marcadores (Nanog, Oct-4, y CD133) con Ki67 mostró que sólo el OCT-4 se encontró positivamente correlacionado con Ki67. Sin embargo, no hubo correlaciones en absoluto entre las expresiones de Nanog y CD133 y Ki67.
El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier después de un 60 meses de seguimiento mostró que el riesgo estimado de caso de interés que tiene lugar en OCT-4 grupo positivo fue 256% más alto que en OCT-4 grupo negativo (razón de riesgo = 3,56, IC del 95% = 1.06~11.95).
diferente presentación con la caracterización de los grupos de células enriquecidas de error máximo permitido utilizar ambos sistemas de cultivo convencionales y no adhesivas
Ocho casos de MPE fueron recogidos de forma prospectiva para el cultivo primario y sus datos clínico-patológicas se muestra en la Tabla 6. la primaria células de cultivo de error máximo permitido usar sistemas de cultivo no adhesivo se describe en nuestro informe anterior [20] muestran (3-D) racimos tridimensionales con una morfología en forma de uva (Figura S1). La duración tiempo de duplicación de cultivo celular, y la morfología observadas variaron considerablemente entre muestras. Sin embargo, el cultivo primario de sistema de cultivo convencional usando medio libre de suero suplementado con dosis crecientes de bFGF y EGF da a conocer una alteración morfológica gradual. Las células cancerosas cultivadas se adhirieron inicialmente a la placa, entonces disociarse y separarse de la placa, y finalmente transformados en pequeños y movibles, clusters esferoides (esferoides) exhibición de un 3-D y /o en forma de uva morfología (Figura 6A).
(a) fotomicrografías de contraste de fases de cultivo primario de MPE de pacientes con adenocarcinoma pulmonar primaria usando medio libre de suero suplementado con dosis crecientes de bFGF y EGF mostraron una alteración morfológica gradual de células de adenocarcinoma de la adhesión a la placa de giro en pequeños grupos móviles y, finalmente, convertirse en las formas esferoidales. (De izquierda a derecha del panel, ampliación, 200 ×). inducción (B) Diferenciación de los dos casos representativos demostró una alteración inversa, morfológica girando el esferoide de error máximo permitido en una arquitectura glandular original con canales luminales. (C) Un análisis de RT-PCR de esferoides en tres casos representativos (caso Nº 8, 3 y 7) de la MPE mostró la expresión de la OCT-4 y Nanog y los genes CD133 se reguló de forma variable en casos representativos allí en pacientes con MPE. (D) En correspondencia datos cuantitativos demostró las comparaciones entre la expresión de la OCT-4 y Nanog y CD133. (E) El análisis de inmunofluorescencia de marcadores CSC-representativas de esferoides demostró expresiones positivas de OCT-4, Nanog, y CD133, tal como indican las flechas (ampliación, 200 ×).
Caracterización de esferoides de propiedades CSC, incluyendo formación de esferas, y la diferenciación en MPE cultivos celulares primarios
Las muestras de cinco de ocho (62,5%) pacientes que utilizan MPE sistema de cultivo no adhesivo produjo formación de esferas enriquecido después del cultivo durante 7 días (Tabla 7) . Estamos posteriormente volvieron a cultivar estos esferoides en placas de cultivo de adhesivo convencionales para la inducción de la diferenciación. Los esferoides que constan de células madre cancerosas putativas exhibió la capacidad de diferenciación invirtiendo el proceso anterior girando los grupos de células 3-D en las estructuras de dos dimensiones con una morfología glandular (Figura 6B). El análisis de inmunofluorescencia con identificación morfológica de los marcadores de CSC-representativas de esferoides demostró la presencia de expresiones de OCT-4, Nanog, y CD133 y posterior análisis RT-PCR mostró que la regulación positiva variable del OCT-4 y Nanog y CD133 expresión génica en tres representante casos. Se observaron tres patrones diferentes de la expresión de OCT-4, Nanog, y CD133 (figuras 6C, D y E). Siete de ocho (87,5%) grupos de células de cultivo primario de MPE fueron positivas para los marcadores de CSC-representativas, y sólo uno (12.5%) fue negativo para los tres marcadores CSC-representativas. No se encontraron expresiones más fuertes de OCT-4 cuantitativamente que las de Nanog y CD133 en los tres casos representativos. Estos datos coincidieron con los obtenidos a partir de los bloques de celdas.
Discusión
La metástasis ocurre generalmente en una serie de pasos discretos que se puede modelar en una cascada metastásica [21]. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la implicación del tumor en la cascada metastásica, lo que resulta en el derrame maligno en cavidades serosas, ha recibido poca atención y por lo tanto atraído el interés de la investigación. En este estudio, se reconfirmó la presentaciones de inmunohistoquímica e inmunocitoquímicos característicos de cada grupo emparejado de muestras del mismo paciente, que muestra las intensidades variables y distribuciones de CK-7 y TTF-1 de expresión /CEA en tejidos de adenocarcinoma de pulmón primario y nidos de células de cáncer en bloques de celdas de la efusión. Algunas de las muestras fueron fuertemente inmunorreactivas para los marcadores de identificación y algo de inmunorreactividad irregular presentada. Esto puede indicar la heterogeneidad intratumoral y puede explicar la resistencia potencial terapéutico, así como la capacidad de invasión y metástasis temprana a la cavidad pleural. Después se iniciaron los primeros eventos de la EMT, incluyendo la pérdida de adherencia y anclaje, el aumento de la movilidad, y la transformación morfológica, las células de cáncer de pulmón primario entraron en la cavidad pleural, lo que lleva a la MPE [22]. Nuestro estudio también demostró discrepancias cualitativas en los niveles de expresión de marcadores asociados-EMT entre los sitios primarios y las lesiones metastásicas. La inmunorreactividad de los marcadores de EMT asociado representativas, E-cadherina y vimentina, variados entre los tejidos de tumores de pulmón primarios y los nidos de células cancerosas en los derrames, indicando la presencia del fenómeno de EMT en los tumores de pulmón y errores máximos permitidos primaria durante la progresión del tumor. Además, la expresión de vimentina tendía a ser más fuerte y la expresión de E-cadherina más débil en la parte delantera invasiva, la interfaz entre los tejidos tumorales y estroma, que en el centro del tumor apropiado.
Durante la invasión, y poco después de las células tumorales pierden el contacto con la membrana basal, se encuentran con otro obstáculo a la metástasis, anoikis [5], [23]. Las células tumorales desprendidas, individualmente o en pequeños grupos, son las únicas capaces de proliferar y crecer, a pesar de su entorno local, presumiblemente desfavorable [24]. Los derrames ofrecen un nicho premetastatic, que funciona como un depósito dinámico que puede suministrar el tejido de cáncer a través de interacciones autocrina y /o paracrina con factores de crecimiento. Tales factores de crecimiento incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento de fibroblastos básico, y factor de crecimiento transformante β y otros estímulos, tales como quimioquinas y citoquinas (interleucinas), producida principalmente por los componentes celulares, incluyendo las células mesoteliales, algunas células estromales, y las células inflamatorias [ ,,,0],25] - [28]. A medida que los derrames se acumulan, el microambiente parece ser crucial para permitir que las células de cáncer para interactuar suficientemente con su entorno, a través de perfusión en lugar de a través de la arquitectura anatómica del flujo de sangre [29]. Cuando las células cancerosas que participen en estas microdominios distintas, que pronto se orquestan las células del estroma circundante y alteran sus fenotipos para facilitar la progresión del cáncer. Por lo tanto, el microambiente de los derrames puede acelerar potencial agresivo del tumor mediante la activación de forma dinámica las propiedades de células madre cancerosas
in situ
. Los factores o citocinas en la efusión que están implicados en la señalización o la interacción con las células tumorales y la forma en que la diafonía entre sí a fin de provocar el potencial de las células madre cancerosas en el error máximo permitido son dignos de mayor investigación.
a pesar de la "semilla y el suelo hipótesis" durante mucho tiempo ha sido cuestionada, se explica cómo derrames proporcionan un microambiente único que puede ser considerado como el "suelo" fértil, en estado líquido, en espera de ser "sembrado" con las células tumorales [30 ], [31]. Como se ha visto en estudios nuestros y otros, los derrames son microambientes únicas que no sólo mantienen vivas las células cancerosas, pero también aún más su invasión y promueven su crecimiento. El crecimiento de células tumorales y la metástasis rápida que se producen en los derrames pueden ser atribuibles a la presencia de una pequeña subpoblación de células cancerosas, el CSC, que muestran muchas de las propiedades de EMT [31], [32]. La evidencia creciente sugiere que existe una relación entre células madre cancerosas y la EMT. Si es así, ciertos oncogenes deben participar en la troncalidad de las células tumorales con capacidad invasiva y su potencial de auto-renovación [12], [13], [33]. La capacidad de sobrevivir y proliferar requiere un nicho apropiado, tal como un derrame, que es crucial para las células tumorales diseminadas a establecerse y se extendió como una metástasis. Hasta donde sabemos, sólo unos pocos estudios han informado de la existencia de células madre cancerosas en los derrames. Todavía no es un marcador específico y simple para las propiedades de las células madre cancerosas en los derrames. Nuestros datos demuestran claramente que las tasas de inmunorreactividad para los tres marcadores de CSC-representativos (CD133, Nanog, Oct-4 y variados), con una tasa relativamente alta de OCT-4 inmunoreactividad. Estos tres marcadores relacionados con el CSC se eligieron debido a su representante de pruebas. Superficie CD133, también conocido como prominin-1, es una glicoproteína transmembrana de la superficie celular que se ha utilizado en la identificación de células madre cancerosas putativas en varios tumores malignos, debido a que han demostrado una mayor potencial tumorigénico en el trasplante de estudios
in vitro
y
in vivo
[34] - [36], así como una asociación con peor pronóstico y metástasis a distancia [37], [38]. Sin embargo, la función exacta de CD133 aún no ha sido establecida y requiere una aclaración. OCT-4 y Nanog son los dos factores de transcripción esenciales para el desarrollo de células pluripotentes normal. Nanog es el principal responsable de la diferenciación durante la embriogénesis [39], mientras que OCT-4 puede tener influencias a largo plazo tanto en la proliferación y diferenciación de tejidos [40]. OCT-4 se expresa especialmente en las células madre embrionarias y las células germinales, y se ha detectado en tipos específicos de tumores de células germinales testiculares [40], [41]. OCT-4 también se expresa preferentemente en los CES no diferenciadas humanas, islotes pancreáticos, y de tipo difuso cáncer gástrico [42]. Por lo tanto, se ha sugerido que OCT-4 contribuye a mantener propiedades de células madre. Sin embargo, varios informes recientes han sugerido que tanto como el 25% de las células de cáncer dentro de ciertos tumores tienen las propiedades de células madre cancerosas [43]. Sobre la base de nuestros datos, hemos estimado que las tasas de inmunorreactividad de estos tres marcadores CSC-representativos (CD133, Nanog, y OCT-4) van de 15% a 90%, y las variaciones en y también se observaron combinaciones de su expresión. Estas tasas superan la aparición promedio de células madre cancerosas (25%) dentro de ciertos tumores, especialmente tumores sólidos. Nuestros resultados demuestran que un montón de células madre cancerosas putativas satisfactorios se puede aislar de errores máximos permitidos con métodos eficaces. Por lo tanto, errores máximos permitidos se pueden utilizar como un mejor modelo de estudio para la investigación de células madre de muestras de tejido de ciertos tipos de cáncer. La expresión variable de marcadores-CSC específica también podría ser modulada por diferentes microambientes, y la expresión inmunológicamente detectable más fuerte de estos marcadores tres CSC-representativos fue encontrado en los frentes invasivos, como se ha visto para los marcadores asociados a la EMT. Nuestro estudio mediante análisis de regresión lineal se ha demostrado que sólo la expresión de Octubre-4 se correlacionó positivamente con Ki67 (
r = 0,470
,
p = 0,036
), un excelente marcador para determinar la fracción de crecimiento de una población celular dada y a menudo en correlación con el valor pronóstico para la supervivencia y la recurrencia del tumor (Figura 5) [44], [45]. Por otra parte, la expresión de Octubre-4 también se relacionó significativamente con la metástasis a distancia (
p = 0,0121
) y la etapa (
p Hotel & lt; 0,0001). El análisis de Kaplan-Meier demostró la expresión de Octubre-4 se asoció inversamente con la supervivencia en pacientes con MPE después de un largo plazo de seguimiento.
En términos de estos marcadores tres CSC-representativas, células madre cancerosas que expresan OCT- 4 en lugar de CD133 o Nanog parecieron desempeñar un papel crucial en su comportamiento de error máximo permitido. Los análisis comparativos también revelaron discrepancias en la inmunorreactividad de estos tres marcadores CSC-representativos entre los tumores pulmonares primarios y nidos de células de cáncer de los bloques de celdas en los derrames. Una explicación razonable es que las células madre cancerosas en ambos tumores pulmonares primarios y los derrames pueden ser latentes o inmóvil durante un periodo de tiempo antes de que se hagan invasivos avanzado o metastásico. De hecho, la expresión de las propiedades de células madre varió con el microambiente (el "nicho de células madre") en el que ocurrieron [46], [47]. Hasta ahora, la relación entre células madre cancerosas y la metástasis se ha basado en una correlación conjeturada, porque no parece una coincidencia que un número relativamente menor número de células que forman metástasis correspondían a un menor número igual de células madre cancerosas. Estas células tienen el potencial de formar un tumor secundario en toda regla, con una arquitectura histológica y la heterogeneidad similares a las del tumor primario [48]. tumores pulmonares primarios son en su mayoría compuestas de células madre cancerosas estacionarias, que por lo general permanecen en un estado de letargo o inactividad. Sin embargo, cuando el tumor se extiende a la cavidad pleural en un apropiado nicho productoras de MPE, estos más inmunorreactiva o funcionamiento "CSC migratorio" o "células madre cancerosas metastásico", presentando ya sea grupos como pequeños o como grupos más grandes independientes de las células en los frentes invasoras, no sólo sobrevivir sino también auto-proliferar en cierta medida. A continuación, pueden invadir los tejidos y vasos adyacentes, y se preparan para migrar a los órganos distales, donde van a desarrollar como otro metástasis [32], [49], lo que resulta en un estado canceroso más avanzada e incontrolable figura S2).
Además de la influencia de la heterogeneidad intratumoral del tumor adecuada y los componentes de material compuesto de los factores humorales y celulares en el MPE, algunas otras dificultades y limitaciones se encuentran cuando el aislamiento de células cancerosas de la MPE. Sin embargo, se lograron aislar esferoides tumorales /racimos utilizando ambos sistemas de cultivo convencionales y no adhesivas. Estas estructuras similares a esferas 3D extraídos de los pacientes se obtuvieron con cierta dificultad, pero estaban bien conservados en cultivo primario, como se ha informado en otros estudios [50], [51]. Los análisis adicionales de inmunofluorescencia demostró que estos esferoides /agrupaciones expresaron las propiedades de células madre cancerosas, la tinción positiva para los tres marcadores CSC-representativos (Figura 6E), similar a los resultados para los bloques de celdas. Las muestras de cinco de las ocho (62,5%) pacientes con MPE produjeron formación de esferas enriquecido después del cultivo en un sistema de cultivo no adhesivo (Figuras S1 y 6A). Sin embargo, no hay esferas podrían generarse a partir de las muestras de tres pacientes, lo que probablemente refleja las diferencias individuales y el complejo de la interferencia de los microambientes de derrames, además de paciente específicos de factores, tales como el estado genético de EGFR, lo que puede afectar a la elección de tratamientos quimioterapéuticos.
en conclusión, el presente estudio apoya nuestra perspectiva en la cascada metastásica. La plataforma de los derrames pleurales puede proporcionar un nicho premetastatic para los tumores pulmonares primarios antes de afectación maligna. Los errores máximos permitidos están llenos de células tumorales que tienen las propiedades de las células madre cancerosas después de que sus interacciones con el microambiente. Por lo que sabemos, tenemos por primera vez estableció un modelo del error máximo permitido, desde el que puede proporcionar una visión de los roles de los CAC en la metástasis y en altas tasas de fracaso terapéutico. Esto también puede ofrecer una nueva dirección para el desarrollo preclínico de la terapéutica racional.
Materiales y Métodos
Las muestras clínicas colección
Se recogieron muestras de tejido de 56 pacientes con adenocarcinoma pulmonar con MPE y recuperado de los archivos del Departamento de Patología, hospital general Tri-Service, Taipei, Taiwán desde 2004 hasta 2009. los 17 casos fueron ya sea perdido para el seguimiento o tenía los datos clínico-patológicos suficientes para el análisis y por lo tanto fueron excluidos. Entre 39 bloques de parafina con MPE, hubo 20 casos en pares que contienen el suficiente líquido preparado para frotis satisfactorios y bloques de celdas que fueron elegidos para ser el principal material de estudio. Los casos de especimenes biopsiados pleurales no se incluyeron cuando la citología pleural fue no diagnóstica para un error máximo permitido sospecha.