Extracto
Antecedentes
tráfico mejorada lisosomal se asocia con el cáncer metastásico. En un intento por descubrir el cáncer relevante proteínas motoras lisosomal, se compararon los proteomas lisosomales de los padres células MCF-7 de cáncer de mama con los de células MCF-7 altamente invasivos que expresan una forma activa de la ErbB2 (Delta N-ErbB2).
Metodología /Principales conclusiones
análisis de espectrometría de masas identificado kinesin cadena pesada de la proteína KIF5B como el único motor de microtúbulos asociados con los lisosomas en células MCF-7, y ectópico Delta N-ErbB2 mejoró su asociación lisosomal. KIF5B asociada con lisosomas también en células de carcinoma de cuello uterino HeLa como se analizó mediante fraccionamiento subcelular. El agotamiento de KIF5B activa agregaciones periféricas de los lisosomas, seguido de desestabilización lisosomal, y la muerte celular en células HeLa. exocitosis lisosomal en respuesta a daño de la membrana de plasma, así como la endocitosis en fase fluida funcionaban, sin embargo, normalmente en estas células. Tanto las células HeLa y MCF-7 parecían expresar niveles similares de la isoforma KIF5B pero el fenotipo de la muerte fue más débil en las células MCF-7 KIF5B-agotado. Sorprendentemente, el agotamiento KIF5B inhibió la acumulación rapamicina inducida de autofagosomas en células MCF-7. En las células KIF5B-agotado los autofagosomas forman y se acumulan en la proximidad cercana al aparato de Golgi, mientras que en las células de control aparecían uniformemente distribuidos en el citoplasma.
Conclusiones /Importancia
Nuestros datos identifican KIF5B como un motor de proteínas lisosomal relevante cáncer con funciones adicionales en la formación autofagosoma
Visto:. Cardoso CMP, Groth-Pedersen L, Høyer Hansen-M, T Kirkegaard, Corcelle E, Andersen JS, et al. (2009) El agotamiento de Kinesin 5B afecta lisosomal Distribución y Estabilidad e induce Peri-Nuclear acumulación de autofagosomas en las células cancerosas. PLoS ONE 4 (2): e4424. doi: 10.1371 /journal.pone.0004424
Editor: Andreas Bergmann, UT MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Noviembre 2008; Aceptado: 18 de diciembre de 2008; Publicado: 10 Febrero 2009
Derechos de Autor © 2009 Cardoso et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. CMP Cardoso era un recipiente de una beca de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (SFRH /TLP /14448/2003). Este trabajo fue apoyado por becas de la Sociedad Danesa del Cáncer (MJ), la Fundación de Investigación Nacional Danesa (MJ), el Consejo Danés de Investigación Médica (JN y MJ), la Fundación Meyer (MJ), el M. L. JÃ? ¸rgensen y Gunnar Hansen Foundation (MJ), la Fundación Novo (MJ y MHH), la Fundación Pedersen Vilhelm (JN y MJ), la Fundación para la Investigación del Cáncer Danés (MJ) y el consorcio Comisión Europea 7PM APO-SYS (MJ y JSA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los lisosomas son orgánulos dinámicos unidas a la membrana que representan el destino final de endocítica, secretora y las vías autofágicos [1]. La importancia fisiológica de los lisosomas se destaca por un número de enfermedades que resultan de defectos en la biogénesis lisosomal y la función [2]. Por el contrario, la síntesis mejorada, el tráfico y la liberación extracelular de proteasas lisosomales (catepsinas), son características importantes de malignidad y la asociada con la capacidad invasiva y metastásica de las células del cáncer [3], [4]. Curiosamente, los cambios lisosomales asociados con la inmortalización y transformación de las células cancerosas también sensibilizar a las células cancerosas a las vías de muerte celular programada que implican permeabilización de la membrana lisosomal [5], [6]. Una vez activado, los resultados de permeabilización de la membrana lisosomal en la liberación de las catepsinas y otras hidrolasas lisosomales al citosol, donde pueden desencadenar la permeabilización de la membrana mitocondrial externa seguida de apoptosis mediada por caspasa [7], [8] o mediar en la muerte celular programada independiente de caspasas [9]. Por lo tanto, la inhibición de la lisosomal tráfico /exocitosis aparece como un objetivo prometedor para la terapia del cáncer. No sólo inhibiría la invasión catepsina mediada sino también obstruir el tráfico general y posiblemente como resultado la acumulación de los lisosomas destinadas para la secreción y por lo tanto más sensibilizar a las células cancerosas a lisosomales vías de muerte celular. Esta hipótesis está apoyada por los datos que muestran que la vincristina, un microtúbulos desestabilización de medicamento contra el cáncer, no sólo inhibe el tráfico de lisosoma sino que también induce un rápido aumento en el volumen del compartimento lisosomal seguido de fuga lisosomal y la muerte celular catepsina dependiente de [10] .
Dado que los medicamentos que alteran el espectáculo red de microtúbulos alta toxicidad general, se especuló que una intervención más específica con el tráfico de lisosoma podría dar lugar a estrategias contra el cáncer con menos efectos secundarios. De acuerdo con ello, queríamos identificar y caracterizar proteínas motoras importantes para el transporte de lisosomas en las células cancerosas. proteínas de motor que utilizan el citoesqueleto como sustrato para el movimiento se dividen en motores de miosina que se mueven a lo largo de microfilamentos de actina y motores kinesin /dineína que utilizan los microtúbulos a través de la interacción con la tubulina para su movimiento [11]. proteínas motoras son alimentados por la hidrólisis de ATP y convierten la energía química en trabajo mecánico que les permite moverse de carga (vesículas, proteínas y lípidos) a través de largas distancias. Los motores de microtúbulos específicos consisten en dos tipos básicos de motores de microtúbulos:. motores plus de fin y motores de menos de gama, dependiendo de la dirección en que se mueven a lo largo de los filamentos dentro de la célula [12]
La forma truncada de el receptor de ErbB2 se encuentra frecuentemente sobreexpresado en el cáncer de mama y su expresión y la actividad se correlaciona con el aumento de la invasividad, la motilidad y mal pronóstico [13]. En consecuencia, la expresión ectópica de Delta N-ErbB2 en células MCF-7 de cáncer de mama hace altamente móvil e invasivo [14] (Nuestra observación no publicada). Impulsada por el hallazgo de que el fenotipo invasivo inducido por Delta N-ErbB2 se asocia con el tráfico lisosomal alterado y un aumento de varias veces en la expresión y la actividad de las proteasas lisosomales, se optó por este modelo de sistema para buscar cáncer relevante proteínas motoras lisosomal. Se aplicó un análisis proteómico cuantitativo en los lisosomas purificada a partir de células MCF-7 y de control de las células Delta N-ErbB2 que muestran que algunos niveles de proteínas motoras fueron significativamente reguladas hasta después de la inducción-Delta N-ErbB2. Curiosamente, encontramos que Delta N-ErbB2 aumentó la expresión de kinesin 5B (KIF5B), una proteína implicada en motor lisosomal y el transporte mitocondrial [15], [16]. En línea con esto, KIF5B ARNm se ha informado de que hasta reguladas en varios tipos de tejidos de cáncer, incluyendo cáncer de vejiga (expediente GDS1479), cáncer gástrico avanzado (GDS1210 registro), el carcinoma de células escamosas (GDS2200 registro), esporádica de mama de tipo basal el cáncer de mama BRCA1 y el cáncer-asociado (expediente GDS2250) (datos obtenidos a partir de NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez; Expresión génica Omnibus). KIF5B es un N-kinesin (Plus-extremo del motor) que pertenece a la superfamilia de quinesina-1 proteínas motoras moleculares que junto con dineína citoplásmica es responsable del transporte de los microtúbulos dependiente de la carga en las células eucarióticas [17]. Para dilucidar el papel de KIF5B en las células cancerosas se examinó su función en las diversas vías lisosomales incluyendo la vía de la muerte celular lisosomal, la respuesta resellado después de daño de la membrana plasmática (exocitosis) y macroautofagia.
Materiales y Métodos
cultivo de células y tratamientos
MCF-7, HeLa y células U2OS se originan a partir de carcinoma de mama humano, carcinoma de cuello uterino y el osteosarcoma, respectivly. línea de células MCF-7-eGFP-LC3 es un solo clon de células de MCF-7 células que expresan una proteína de fusión que consiste en proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) y LC3 rata [18]. líneas celulares-PTRE MCF-7 MCF-7-ΔNErbB2 y son clones de células individuales de células MCF-7 que expresan el transactivador de tetraciclina transfectadas con pTRE-ΔNErbB2 y pTRE, respectivamente [14]. células HeLa-LIMP1-EGFP son células HeLa que expresan integral de membrana lisosoma eGFP de etiquetado proteína-1 (LIMP-1) [19] (amablemente proporcionado por el Dr. J. P. Luzio, Universidad de Cambridge). Las células de cáncer y sus variantes transfectadas se propagaron en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con suero inactivado por calor 6% de ternera fetal (FCS; Biological Industries) y penicilina-estreptomicina. El medio de las células MCF-7-ΔNErbB2 y MCF-7-pTRE se complementa además con 5 mg /ml de tetraciclina. Para inducir la expresión Delta N-ErbB2, tetraciclina (5 mg /ml) se eliminó y las células se lavaron 5 veces en PBS antes de la siembra. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera de aire humidificado con un 5% de CO
2.
Análisis de las proteínas asociadas a los lisosomas por espectrometría de masas utilizando el etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC)
MCF-7-ΔNErbB2 y MCF-7-pTRE se cultivaron en medio RPMI 1640 a medida sintetizado, ya sea con la lisina normales 12C614N2 (Lys0) o marcado con un isótopo 13C615N2 L-lisina (Lys8) (Sigma-Isotec, St . Louis, MO) suplementado con suero de ternera fetal dializado al 10% (Invitrogen) durante al menos 5 divisiones celulares para incorporar plenamente los aminoácidos marcados. Los lisosomas se purificaron por hierro-dextrano (FedEx) de fraccionamiento de acuerdo con un protocolo publicado anteriormente [20]. Brevemente, las células (80 a 90 × 10
6 en total) preincubadas con Fedex (8 h) se lisaron mecánicamente en un homogeneizador Dounce y la fracción de membrana de luz se cargó en una columna de MiniMachs unido a un imán (sistema de separación MACS, Miltenyi Biotec). Los lisosomas atrapadas en la columna se eluyeron en tampón de extracción de sacarosa (sacarosa 250 mM, Hepes 20 mM, KCl 10, MgCl 1,5 mM
2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, y Pefabloc 1 mM, pH 7,5) mediante la eliminación de la columna del imán y ahuyentar a los lisosomas por un émbolo. Los lisosomas se disolvieron y las proteínas se separaron por electroforesis en NuPAGE Bis-Tris al 4-12% geles de gradiente (Invitrogen) y se tiñeron con Comassie azul. cortes de gel se cortaron en trozos pequeños y se incubaron con 12,5 ng /l de tripsina a 37 ° C durante la noche. Los péptidos resultantes se analizaron mediante cromatografía líquida (Agilent HP1100) combinada con espectrometría de masas tándem (LC MS /MS) usando una transformada de Fourier-ion-ciclotrón espectrómetro lineal-trampa de iones de masas de resonancia (LTQ-FT-ICR, Thermo-Finnigan). Lista de los picos se extrae utilizando un filtro en casa guiones desarrollados (DTA-Supercharge), combinados para cada portaobjetos de gel, y se utiliza para las búsquedas de bases de datos de proteínas. Se requieren criterios estrictos para la identificación de proteínas en la base de datos internacional Índice de proteína utilizando el programa Mascot (Matrix Science): al menos dos péptidos que emparejan por proteínas, una precisión en masa a menos de 3 ppm, una puntuación de la mascota para los péptidos individuales de mejor que 20, y una el marcador delta del mejor que 5. MS-Quant (http://msquant.sourceforge.net/), se utilizó un programa de software de desarrollo propio para el cálculo de razón de abundancia péptido y para evaluar la certeza en la identificación de péptidos.
siRNAs y transfecciones
Tres siRNAs fueron diseñados para apuntar KIF5B mRNA: 5'-CCAUCAUCAUACAAUGAGUCUGAAA-3 '(KIF5B-1), 5'-CGGCGACAAGUACAUCGCCAAGUUU-3' (KIF5B-2), y 5 ' CAUCUACCAGAAGGGAUCAAGACAA-3 '(KIF5B-3). Todos los siRNAs se adquirieron de Invitrogen. En todos los siRNA experimentar una muestra de control tratada con el agente de transfección solo y /o una falta de coincidencia oligo KIF5B, 5'-CGGAACACAUGGCUAAACCGGCUUU-3 '(MM), fueron incluidos. células MCF-7 y HeLa fueron transfectadas con 25 nM de ARNsi aplicar oligofectamine (Invitrogen) como el agente de transfección.
Medición de la viabilidad celular y análisis microscópico
Las células viables se mide por su capacidad para reducir la sal de tetrazolio 3- (4,5-dimetiltiazol-2-y) -2,5-diphenyltetrasodiumbromide (MTT; Sigma) a un colorante de formazano detectable mediante análisis espectrofotométrico en un lector de microplacas VersaMax (Molecular Devices Ltd., Wokingham, Reino Unido) como se describe anteriormente [9]. Fase imágenes de contraste de líneas celulares fueron tomadas con una Olympus IX-70 microscopio invertido conectado a una cámara digital Olympus DP70. La microscopía lapso de tiempo se realizó con un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Axiovert 200M utilizando el software MetaMorph.
Análisis de la translocación de GFP-LC3
La autofagia se indujo mediante la incubación de las células MCF-7-LC3-EGFP con 2,5 rapamicina M (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) durante 24 h. El porcentaje de células con translocación eGFP-LC3 en puntos (un mínimo de 100 células /muestra) se contó en eGFP-LC3 células fijadas en formaldehído al 3,7% y 0,19% de ácido pícrico (vol /vol) la aplicación de láser Zeiss Axiovert 100 M confocal expresando Microscopio de barrido. Las células con ≥5 vesículas citosólicas verdes fueron considerados positivos.
Medición de la actividad de las enzimas
La caspasa-3-como (DEVD-AFC, Enxzyme productos del sistema), la catepsina cisteína (ZFR-AFC, Enzyme Los productos del sistema), la fosfatasa ácida y ß
N-acetil
glucosaminidasa (NAG) se determinaron las actividades esencialmente como se describe anteriormente [6], [9]. Brevemente, la fracción citoplásmica se extrajo con 20 a 35 mg /ml de digitonina y la fracción celular total con 200 mg /ml de digitonina y la tasa de la hidrólisis del sustrato apropiado V
max se midió durante 20 min a 30 ° C en una fluorómetro Spectramax Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Lactato deshidrogenasa (LDH) la actividad de la citosol determinado por un kit de detección de citotoxicidad (Roche) se utilizó como estándar interno.
El análisis por inmunotransferencia e inmunocitoquímica
Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y se transfiere a membranas de nitrocelulosa. Los anticuerpos primarios dirigidos contra KIF5B (SUK4 de Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma (DSHB), Universidad de Iowa) y ab5629 (de Abcam), membrana de la proteína 2 lisosoma-asociado (LAMP-2; H4B4 clon de DSHB), GRP75 (SPA825 de Stressgene ,), catepsina B (Ab1 de Oncogene), p70 S6 quinasa 1 (p70
S6K1;#9202) y phospo-p70
S6K1 (# 9206) (de Cell Signalling Technology), y la gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH, Biogénesis, Poole, Reino Unido), seguido de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa adecuadas de Dako a /S (Glostrup, Dinamarca)
.
para la inmunocitoquímica, las células en cubreobjetos se fijaron usando metanol enfriado con hielo durante 10 minutos o 3,7% de formaldehído durante 30 minutos a 25 ° C. Las células se tiñeron con los anticuerpos primarios indicados incluyendo KIF5B ratón anti erizo de mar (1:20; SUK4), ratón anti-humano citocromo
c gratis (clon 556 432 a 1: 350, BD PharMingen, San Diego, CA) , cabra anti-humana γ-tubulina (SC-7396, Santa Cruz Biotechnology) y el ratón anti-humano LAMP-2 (1:100). Después del lavado, las muestras se incubaron con el apropiado Alexa Fluor-488- y Alexa- Fluor-546 anticuerpos secundarios /594 acoplados (Molecular Probes). Confocal imágenes fueron tomadas usando un microscopio Zeiss Axiovert 100 M microscopio de escaneo láser confocal LSM 510 equipado con el sistema (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).
La extracción de RNA, síntesis de cDNA y PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
el ARN se extrae de cultivo celular con columnas RNeasy (QIAGEN) y síntesis de ADNc se realizó con el kit TaqMan RT (Roche) utilizando oligo (dT)
16 cebadores. Las reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con las condiciones estándar con los siguientes cebadores:
KIF1A-forw: GACACGCTGGTCTGAGATGA. KIF1A-rev: TGGCTTAGGCACTCCTCACT; KIF3A-forw: GACTATGCTGAGGCTGCAA. KIF3A-rev: TGTCTTTGGCCTTGCTTTC; KIF5A-forw: CAGCTTGACGACAAGGATGA. KIF5A-rev: GGTGTCCACTGACCTCCTGT; KIF5B-forw: GATGGATCGGAAGTGAGCAT. KIF5B-rev: ATCACGACCGTGTCTTCTCC; KIF5C-forw:. GCAACTGGAACAGGAGAAGC
KIF5C-rev: ACCTCACCCAAACACTCCAG. PBGD-forw: CATGTCTGGTAACGGCAATG; PBGD-rev: AGGGCATGTTCAAGCTCCTT. Porfobilinógeno desaminasa (PBGD; PubMed entrada BC000520) se utilizó como control interno, junto con el gen de interés. Productos de PCR fueron separados en un gel de tamaño -agarosa 1,5% que contenía bromuro de etidio, se visualizaron bajo luz UV, fotografiada con película Polaroid.
fraccionamiento subcelular
Para las células de fraccionamiento de gradiente de densidad se agruparon en tampón de homogeneización enfriado en hielo (sacarosa 250 mM, Hepes 20 mM y EDTA 1 mM, pH 7,4) y se lisaron en un homogeneizador Dounce en hielo. Los homogeneizados se centrifugaron y el sobrenadante centrifugaron a 3000 g durante 10 min a 4 ° C y se desechó el sedimento. El sobrenadante se centrifugó a 17.000 g durante 20 min a 4 ° C. gradientes de iodixanol se formaron por adición secuencial de 4, 10, 16 y 24% en las soluciones de tampón de homogeneización a 25 ° C durante 1 hora, dando como resultado la formación de un gradiente continuo. El sedimento final se resuspendió en tampón de homogeneización y se cargó en un gradiente de iodixanol continua 4-24% y se centrifugó a 20.000
g
en un rotor SW41Ti (Beckman) durante 17 h a 4 ° C. Los gradientes se separaron en un total de veinte 500 fracciones l, recogidos de la parte inferior. La densidad de cada fracción se determinó midiendo la DO a 244 nm. Catepsinas B /L,
N
-acetylglucosaminidase (NAG) y la actividad de las fosfatasas ácidas se midieron para cada fracción después de la adición de digitonina.
Análisis de la actividad de la exocitosis en la membrana plasmática hiriendo
heridas de membrana por electroporación se realizó tal como se describe anteriormente [21]. Brevemente, las células se suspendieron en madejas solución salina equilibrada (HBSS) (Gibco, Invitrogen), se sometió a electroporación a 200 V con niveles variables de capacitancia en un 0,2-cm gen electrodo generador de impulsos cubeta (Bio-Rad), y se incubaron durante 1 min a 37 ° C. Las células fueron incubadas con anticuerpos anti-LAMP-1 (sc-20011, Santa Cruz Biotechnology) de anticuerpos en hielo durante 30 min, se lavaron, se fijaron, y se tiñeron con Alexa Fluor 488 anticuerpos secundarios (Molecular Probes). La citometría de flujo en 10000 células por muestra se realizó con un FACS (Becton Dickinson) y los datos se analizaron mediante el programa informático CellQuest (Becton Dickinson). Para medir la actividad células exocitosis ionomicina inducidos se incubaron en HBSS que contiene 10 mM de ionomicina (Sigma). Una sonda específica de la catepsina B, ZFR-AMC (VWR International) se añadió a cada pocillo a una concentración final de 100 mM en el tiempo 0 y 10 min. La tasa de hidrólisis del sustrato, tal como se mide por la liberación de AMC (longitud de onda de excitación, 400 nm; longitud de onda de emisión, 489 nm). A 30 ° C en un fluorómetro Spectramax Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.)
resultados
ΔNErbB2 aumenta el nivel de KIF5B en los lisosomas
células de carcinoma de mama MCF-7 que expresan forma constitutivamente activa amino-terminal truncado de la tirosina quinasa del receptor ErbB2 (ΔNErbB2) presentan un fenotipo muy móviles caracterizado por extensa ruffling membrana, las proyecciones de la membrana plasmática y la dispersión de las células (Fig. 1A). Además, la expresión ΔNErbB2 induce la localización de los lisosomas a la filopodios (Fig. 1A) y una veces 3-4 regulación de la actividad lisosomal catepsina cisteína [6] lo que sugiere que Delta N-ErbB2 cambia el tráfico lisosomal y contenido. Con el fin de identificar las proteínas motoras involucradas en el tráfico de los lisosomas en las células cancerosas, se compararon los proteomas de los lisosomas aisladas de control de las células MCF-7-ΔNErbB2 MCF-7 y por medio del etiquetado de isótopos estables de aminoácidos (Lys0 /Lys8) en cultivo celular ( SILAC) seguido por análisis de espectrometría de masas [22]. Seis motores de miosina y kinesin motor específico de uno de los microtúbulos podrían ser detectados por este enfoque como proteínas motoras asociadas a los lisosomas (Tabla 1 y del conjunto de datos S1). La asociación lisosomal de tres de las proteínas motoras identificados (miosina Ib, Ic y miosina de cadena pesada kinesin KIF5B) es regulada hasta en más del 25% tras la expresión Delta N-ErbB2 ectópico en las células MCF-7. Para caracterizar la importancia funcional de estos tres motores con respecto al crecimiento, la supervivencia y la distribución lisosomal les empobrecido en células de carcinoma de cuello uterino MCF-7 y HeLa por interferencia de ARN. Sólo los siRNAs específicos para KIF5B afectados estos parámetros (Fig. 2 y datos no mostrados). Por lo tanto, optamos por estudiar el papel de KIF5B sobre la función lisosomal con más detalle.
(A) La inmunotinción con lisosoma específica LAMP-1 anticuerpos en células de control Delta N-ErbB2 y. (B) Análisis de RT-PCR que muestra los niveles de expresión de ARNm de diversos N-kinesins incluyendo KIF5A (349 pb), KIF5B (337 pb), KIF5C (320 pb), KIF3A (393 pb) y KIF1A (364 pb) en H: HeLa, M: MCF-7 y U: células U2OS. bandas de amplificación KIF se indican con flechas. El PBDG gen de mantenimiento de la casa (257 pb) se utilizó como control interno. (C) las fracciones de membrana de luz de las células HeLa se separaron por ultracentrifugación en gradiente de iodixanol y los niveles de expresión de proteínas de KIF5B, LAMP-2 (lisosomas) y GRP75 (mitocondrias) se visualizaron mediante inmunotransferencia. Los niveles de actividad enzimática de la catepsina B /L, fosfatasa ácida y NAG se midió en todas las fracciones y sirvieron como marcadores lisosomales; la linealidad del perfil de gradiente de iodixanol se determinó midiendo la DO a 244 nm (gráfico inferior).
(A) Los niveles de proteína de KIF5B, 48 horas después de la depleción con concentraciones variables siRNA (KIF5B-1 siRNA ) para HeLa y MCF-7; β-tubulina sirvió como control interno. Oligof: control de las células tratadas con oligofectamine solo. (B) de fase de contraste Representante imágenes de HeLa, MCF-7 y las células, 72 h después del tratamiento con siRNAs indicados-Delta N-ErbB2 MCF-7. se agotaron las células (C) HeLa para KIF5B o tratados con control de MM siRNA y la actividad metabólica determinada por un ensayo de MTT y la muerte estimada por ensayo de liberación de LDH (D). Los valores MTT y LDH se presenta como porcentaje de las células no tratadas. (E) de la caspasa-3 como la actividad y la actividad (F) citosólica de catepsina en células HeLa después de la depleción KIF5B (72 horas) medida por DEVDasa y ensayos enzimáticos zFRase respectivamente. Los valores representan las medias de mediciones por triplicado ± SD. Todos los experimentos se repitieron tres veces con esencialmente los mismos resultados.
KIF5B es altamente expresado en varias células cancerosas
En primer lugar, se examinaron los niveles de expresión de mRNA de cada tres KIF5B líneas celulares de cáncer (MCF-7, HeLa y U2OS osteosarcoma) y nos pareció que estaba altamente expresado en las tres líneas celulares en comparación con otros N-kinesins incluyendo KIF5A /KIF5C (Kinesin 1), KIF3A (Kinesin 2) y KIF1A (Kinesin 3) (Fig. 1B). Se detectaron bajos niveles de KIF3A mientras que tanto KIF5A y KIF5C ARNm fueron no detectables en las tres líneas celulares, de acuerdo con las conclusiones anteriores que sugieren que su expresión se limita a las neuronas [23] (Fig. 1B). Con el fin de impugnar la localización lisosomal de KIF5B detectado mediante análisis proteómico de células MCF-7, sometimos la fracción de membrana de las células HeLa luz a un fraccionamiento en gradiente de densidad y se analizaron las diferentes fracciones mediante mediciones de la actividad enzimática lisosomal y de inmunotransferencia. Como se muestra en la Figura 1C, KIF5B era exclusivamente presentes en fracciones que contienen altos niveles de proteína lisosómica LAMP-2 y lisosomales marcadores de actividad enzimática (catepsinas de cisteína, la fosfatasa ácida y ß-
N-acetil-glucosaminidasa
). Debe, sin embargo, se observó que las fracciones que contienen proteína marcadora GRP75 mitocondrial se solapa parcialmente con las fracciones lisosomales y KIF5B.
El agotamiento de KIF5B induce la fuga lisosomal y la muerte celular en las células HeLa
Para dilucidar la papel de KIF5B en el crecimiento celular y la supervivencia, HeLa y las células MCF-7 se agotaron para KIF5B por interferencia de ARN (Fig. 2A). Curiosamente, las células HeLa KIF5B-agotado adquirieron un fenotipo celular alargado seguido de la inhibición del crecimiento significativo y la muerte celular (Fig. 2B-D). KIF5B agotamiento inducido similar, pero los efectos citotóxicos citostáticos /claramente más débiles en células MCF-7 y un poco más en las células MCF-7-Delta N-ErbB2 como analizados por microscopía de luz (Fig. 2B). A pesar de la inducción de la muerte celular significativa, sólo es muy baja la caspasa-3 como la actividad se detectó en las células HeLa KIF5B-agotado (Fig. 2E). En lugar de ello, las células KIF5B empobrecido muestran un aumento significativo en la actividad de la catepsina cisteína citosólica indicativo de permeabilización de la membrana lisosomal (Fig. 2F).
El agotamiento de KIF5B en células HeLa induce agregaciones periféricas de los lisosomas en las células HeLa
Desde KIF5B células de ratón deficiente en extraembryonic muestran agrupación perinuclear de las mitocondrias y la disminución de la trata con ácido de los lisosomas desencadenado hacia la periferia de la célula [16], el próximo estudió la distribución de estos orgánulos después de la depleción KIF5B. Con el fin de investigar la distribución lisosomal, nos aprovechamos de las células HeLa que expresan un eGFP-LIMP1 como un marcador lisosomal [19]. En las células HeLa-eGFP-LIMP1 KIF5B empobrecido en la distribución de los lisosomas eGFP-LIMP1-postive se alteró dramáticamente de un patrón perinuclear difusa a los agregados periféricos de gran tamaño (Fig. 3A). Estos lisosomas aparecieron en grupos y fueron transportados activamente hacia y desde los agregados que se observan por el vídeo de lapso de tiempo de microscopía (Video S1 y S2). Contrariamente a los lisosomas, la distribución mitocondrial no se vio afectada por el agotamiento KIF5B en células HeLa (Fig. 3A).
(A) confocales imágenes representativas de cualquiera de las células HeLa o HeLa que expresan establemente LIMP-1-EGFP transfectadas con KIF5B o MM siRNA, y se tiñeron con anticuerpos indicados. (B) células HeLa sembradas en cubreobjetos (80% de confluencia) se membrana herido con un escalpelo e inmediatamente después de manchado para la superficie de LAMP-1; Las células se fijaron y se tiñeron posteriormente para KIF5B. células (C) HeLa transfectadas con siRNAs fueron indicados (después de 48 h) estimuladas para exocitosis con ionomicina 10 mM. la secreción extracelular de las catepsinas lisosomales se midió mediante un ensayo y los valores de enzima ZFR-AMC (medios de mediciones por triplicado ± SD) se expresaron como porcentaje del contenido total de LDH celular. (D) La cuantificación de la superficie de LAMP-1 en células HeLa electroporadas por citometría de flujo. El rojo y el verde indica células en dos puertas diferentes. El porcentaje de células en la puerta roja se utilizó para estimar la cantidad de superficie expuesta LAMP-1 +/- electroporación. FL1-H: intensidad de fluorescencia. FSC-H:. Adelante dispersión lateral
Dado que las funciones KIF5B como un
más
-end del motor, es decir, un motor que transporta carga desde el centrosoma a la periferia de la célula [24], la acumulación de los lisosomas a la periferia de la célula en las células KIF5B empobrecido podría ser debido a una localización periférica del centrosoma o un fracaso de los lisosomas para fusionarse con la membrana plasmática. Con el fin de probar la primera posibilidad, teñidas células HeLa-eGFP-LIMP1 con un anticuerpo contra γ-tubulina para marcar los centrosomas. Sin embargo, los racimos lisosomales no se acumulan alrededor de los centrosomas (Fig. 3A). Para examinar si KIF5B es esencial para la exocitosis lisosomal, se aplicó tres métodos diferentes (rascado mecánico, electroporación e ionomicina) para inducir lesiones de la membrana de plasma que desencadenan Ca
2 + afluencia y la inducción de la respuesta de resellado que consiste en la exocitosis de lisosomas [25 ]. Un bisturí se utilizó para los arañazos sobre una capa de semi-confluente de células HeLa para inducir mecánicamente daño de la membrana de plasma, y la exocitosis lisosomal se ensayó inmediatamente usando un anticuerpo de detección un epítopo luminal de lisosomal LAMP-1 en la superficie celular. La fluorescencia de superficie de LAMP-1 fue significativamente mayor en el sitio de daño indicativo de resellado de la membrana lisosomal, y se observó una co-localización y acumulación de KIF5B adicional en el sitio de daño que sugiere que KIF5B está implicado en esta respuesta (Fig. 3B). Dado que este método no es adecuado para estudios cuantitativos, se utilizó la electroporación para inducir pequeños poros hidrofílicos en la membrana plasmática para investigar si KIF5B era esencial en el proceso de transporte de los lisosomas a los sitios de daño. El método es ampliamente usado para introducir las proteínas y ADN en las células y depende de la capacidad de las células para volver a sellar su membrana plasmática después de la electroporación [26]. células HeLa se sometieron a electroporación con el aumento de la capacitancia e inmediatamente después de que se tiñeron para la superficie de LAMP-1 (Fig. 3D). La cuantificación de LAMP-1 expuesta en la membrana plasmática por citometría de flujo reveló un nivel detectable de LAMP-1 en 3,3% de las células no tratadas. En contraste, cuando se sometieron a electroporación las células a 125 y 250 mF, se detectó LAMP-1 en la superficie en 11,4 y 21% de las células, respectivamente. Células agotadas para KIF5B y expuestas a 125 mF no mostraron ningún cambio significativo en la superficie LAMP-1 en comparación con las células tratadas de control expuestas a 125 mF (Fig. 3D). Del mismo modo, la exocitosis lisosomal ionomicina inducida por proteasas luminales no se vio afectada por el agotamiento KIF5B (figura 3C). Estos datos demuestran que KIF5B no es crucial para la exocitosis lisosomal y resellado de la membrana plasmática. Además, la absorción de Alexa Flour 488-dextrano (10 kDa) no se vio afectada por el agotamiento KIF5B que indica que KIF5B no se requiere para la endocitosis en fase fluida (datos no mostrados).
El agotamiento de KIF5B induce la acumulación de peri-nucleares de autofagosomas
a continuación, examinó si KIF5B juega un papel en la autofagia, la principal vía de degradación lisosomal. Para este propósito, se trataron las células MCF-7 que expresan de forma estable la proteína LC3 autophagosome asociada fusionado a la proteína de fluorescencia verde potenciada (MCF-7-LC3-eGFP), ya sea con rapamicina que induce la autofagia mediante la inactivación de la diana de mamífero de complejo rapamicina 1 ( mTORC1) o concanamycin a que inhibe la actividad ATPasa vacuolar V-en lisosomas que resulta de la rotación reducida de autofagosomas, así como la inducción de la formación de autophagosome través de la inhibición de mTORC1 [27]. Curiosamente, el agotamiento de KIF5B por tres que no se solapan siRNAs disminuyó significativamente la capacidad de la rapamicina para activar la formación de vesículas autofágicas LC3-positiva (Fig. 4A). Este efecto no fue provocada por los cambios en la capacidad de la rapamicina para inhibir mTORC1 ya que el agotamiento de KIF5B no tiene ninguna influencia sobre la actividad mTORC1 como analizados por el estado de fosforilación de p70 S6 quinasa 1 (p70
S6K1) (fig. 4B). Para explorar el fenómeno aún más, hemos seguido la formación autofagosoma en células MCF-7-LC3-eGFP tratados con rapamicina (no se muestra) o concanamycin Un mediante microscopía de vídeo de lapso de tiempo de 45 min. Sorprendentemente, la distribución de autofagosomas se alteró dramáticamente por agotamiento KIF5B. En las células KIF5B agotado los autofagosomas aparecieron y se acumulan principalmente en el núcleo (Fig 4C-E;. Vídeo S3) mientras que en las células tratadas con ARNsi de control que se distribuyeron de forma difusa por todo el citoplasma (Fig 4C;. Vídeo S4). Los autofagosomas perinuclear en células KIF5B agotados se encuentran en las proximidades al aparato de Golgi como se visualizó por tinción con un anticuerpo contra un
trans
red -Golgi proteína de membrana golgin-97 (Fig. 4F y Vídeo S5).