Extracto
Antecedentes
linfocitos T reguladoras clínicos (Treg) infiltrarse en glioblastoma humano (GBM); están implicados en la progresión del tumor y se correlaciona con el grado del tumor. eliminación transitoria de células T reguladoras CD25 utilizando anticuerpos ozono (PC61) se ha encontrado para mediar la regresión GBM en modelos preclínicos de tumores cerebrales. Los ensayos clínicos que combinan el agotamiento de Treg con la vacunación del tumor están en marcha para determinar si el agotamiento transitoria Treg puede mejorar las respuestas inmunológicas contra los tumores y mejorar la supervivencia a largo plazo en pacientes con cáncer.
Los resultados
El uso de un intracrabial singénico glioblastoma (GBM) modelo de ratón se muestra que el agotamiento sistémica de Tregs 15 días después de la implantación del tumor utilizando PC61 resultó en una disminución de células T reguladoras presentes en los tumores, ganglios linfáticos de drenaje y el bazo y la mejora de la supervivencia a largo plazo (50% de los ratones sobrevivió a & gt; 150 días). No se observó ninguna mejora en la supervivencia cuando se agotaron Tregs 24 días después de la implantación del tumor, lo que sugiere que la carga tumoral es un factor importante para determinar la eficacia del agotamiento de Treg en ensayos clínicos. En un modelo dependiente de células T de la regresión del tumor cerebral provocada por la entrega intratumoral de vectores adenovirales (Ad) que expresa Fms tirosina quinasa 3 ligando (Flt3L) y Herpes Simple Tipo 1-timidina-quinasa (TK) con ganciclovir (GCV), demostramos que la administración de PC61 24 días después de la implantación del tumor (7 días después del tratamiento) inhibe las células T regresión tumoral dependiente y la supervivencia a largo plazo. Además, el agotamiento con la expansión clonal PC61 inhibió completamente de los linfocitos T específicos de antígeno de tumor en respuesta al tratamiento.
Conclusiones
Nuestros datos demuestran por primera vez, que si bien Treg agotamiento inhibe la progresión /elimina los tumores GBM, su eficacia depende de la carga tumoral. Llegamos a la conclusión de que este enfoque será útil en un entorno de enfermedad mínima residual. Además, también demuestran que Treg agotamiento, utilizando PC61 en combinación con inmunoterapia, inhibe la expansión clonal de células T específicas de antígeno de tumores, lo que sugiere que los nuevos objetivos más específicos para bloquear Tregs serán necesarios cuando se utiliza en combinación con las terapias que activan anti- inmunidad tumoral
Visto:. Curtin JF, Candolfi M, Fakhouri TM, Liu C, Alden A, Edwards M, et al. (2008) Treg agotamiento inhibe la eficacia de la inmunoterapia del cáncer: Implicaciones para los ensayos clínicos. PLoS ONE 3 (4): e1983. doi: 10.1371 /journal.pone.0001983
Editor: Karen S. Aboody, Ciudad del Centro Médico de la Esperanza y el Instituto de Investigación Beckman, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Enero, 2008; Aceptado: March 10, 2008; Publicado: 23 Abril 2008
Derechos de Autor © 2008 Curtin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyada por los Institutos nacionales de Salud /Instituto Nacional de Trastornos neurológicos & amp; Accidente cerebrovascular (NIH /NINDS) de Grant 1R01 NS44556.01, Suplemento de la minoría NS445561.01; 1R21-NSO54143.01; 1UO1 NS052465.01, 1 SR3 TW006273-01 a M.G.C .; NIH /NINDS Subvenciones 1 SR1 NS 054.193,01; SR1 NS 42.893,01, U54 y NS045309-01 1R21 NS047298-01 a P.R.L. El Bram y Elaine Goldsmith y el Grupo medallones Cátedras en Gene Terapéutica a PRL y el MGC, respectivamente, la Linda Tallen & amp; David Paul Kane Beca de la Fundación Anual y la Junta de Gobernadores en CSMC. MC está apoyado por el NIH /NINDS 1F32 NS058156.01
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El glioblastoma multiforme (GBM) es un tumor cerebral primario mortal que es altamente invasiva con células tumorales que infiltran el tejido cerebral sano circundante [1]. La mediana de supervivencia de los pacientes diagnosticados con GBM es de un año (4-6 meses después de la recurrencia), con menos de 5% de los pacientes restantes vivos 5 años después del diagnóstico [2]. Las mejoras en la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia no se han traducido en la mejora significativamente el pronóstico para los pacientes con GBM; la supervivencia a largo plazo (5 años después del diagnóstico) no ha mejorado desde 1950 [3]. La recidiva del tumor casi siempre se produce incluso si la cirugía elimina con éxito la mayoría de la masa del tumor primario. Se necesitan urgentemente nuevas terapias para prevenir o tratar la recurrencia del tumor para el tratamiento de pacientes con diagnóstico de GBM.
La inmunoterapia se ha propuesto como un enfoque poderoso para evitar la recurrencia del tumor mediante la eliminación de las células tumorales sin afectar normal circundante células sanas [4], [5]. Varios ensayos clínicos están en marcha para probar si la inmunoterapia es seguro y eficaz para el tratamiento de GBM [6], [7]. GBM más antígenos tumorales expresan como MAGE, Her2 /neu, tirosinasa, Trp-1, 2-Trp, gp100, IL13Rα2, survivina (revisado en [8]) y EphA2 [9]. El sistema inmune esculpe ordinariamente tumores resultantes de la pérdida de la expresión de antígenos del tumor [10], [11], sin embargo, la ubicación de GBM en el cerebro, un sitio de privilegio inmune [12], [13], o la presencia de una muy ambiente inmunosupresor en los tumores cerebrales [14], [15] puede haber razones por las GBM comúnmente sobre los antígenos tumorales expresan en los pacientes. Las células dendríticas (DC) autólogas cargadas con péptidos tumorales GBM [16] o lisado tumoral autólogo [17] se han utilizado para vacunar a los pacientes en dos recientes ensayos clínicos fase I. No se observó ningún aumento significativo de la supervivencia utilizando lisados tumorales autólogas [17]. Sin embargo, la mediana de tiempo hasta la progresión y la supervivencia media de los pacientes tratados con vacunas basadas en péptidos aumentó en comparación con los pacientes que fueron tratados durante el mismo período de tiempo con las terapias convencionales [16]. Curiosamente, una subpoblación de pacientes que respondieron al tratamiento se identificaron mediante la expresión de bajas concentraciones de TGF en el cerebro. la expresión intratumoral de TGF puede suprimir la respuesta inmune adaptativa contra el antígeno [4], [5] y fue predictivo de los resultados clínicos después de la vacunación [16]. Además, el antígeno de tumor circulantes específicos CD8
+ linfocitos T se han identificado en pacientes con GBM [18], pero el entorno inmunosupresor en el tumor impide la eliminación de GBM de estos pacientes.
respuestas de células T contra antígeno tumoral medida por ELISPOT tetrámeros y no siempre se correlaciona con la regresión del tumor en los ensayos clínicos de prueba para inmunoterapias GBM humana [19]. Esto sugiere que la supresión de las respuestas inmunes eficaces contra antígenos tumorales puede interferir con la regresión del tumor dependiente inmune. Recientemente, los investigadores han investigado si el agotamiento de un subconjunto de linfocitos T llamados linfocitos T reguladores (Treg) puede potenciar inmunoterapias contra el cáncer. Tregs son una subpoblación de CD4
+ linfocitos T que expresan constitutivamente el factor de transcripción Foxp3, la alta afinidad del receptor de IL2 CD25 y el ligando B7 CTLA4 [20]. Se requieren células T reguladoras para el mantenimiento de la tolerancia durante toda la vida del organismo [21] y las mutaciones en Foxp3 se sabe que causan trastornos autoinmunes agudas en los seres humanos [22]. Foxp3
+ células T reguladoras se acumulan dentro de los gliomas humanos durante la progresión tumoral [23] y se ha encontrado que se correlaciona con el grado del tumor [24]. La supervivencia se mejora cuando Tregs se agotaron de ratones portadores de tumor GL261 utilizando anticuerpos CD25 administrados 7 días después de la implantación del tumor y tres veces por semana durante 3 semanas a partir de entonces [25]. Además, la administración de anticuerpos CD25 agotan también se demostró mejorar la supervivencia cuando se administra en combinación con DC transfectadas con ARNm tumoral en un modelo GBM [26].
Recientemente hemos desarrollado un enfoque de terapia génica combinada dirigida a la ingeniería microambiente del tumor para inducir la migración en la masa tumoral de las APC y susciten la muerte de células tumorales [27]. Nuestro enfoque consiste en expresar Fms tirosina quinasa 3 ligando (Flt3L) que induce la infiltración de células dendríticas (DC) en el parénquima cerebral [28] en combinación con el gen condicional citotóxico de la timidina quinasa (TK) [27], [29], que en presencia de GCV induce la muerte de células tumorales. Este enfoque combinado induce células T dependiente de la regresión del tumor [27]. Hemos querido evaluar los efectos provocados por el agotamiento de las células T reguladoras; en la progresión tumoral en ratones portadores de GBM no tratados y en la regresión del tumor cerebral dependiente de células T provocada por Ad-Flt3L y tratamiento con Ad-TK. Nuestros datos demuestran que el agotamiento de las células T reguladoras con el CD25 específico PC61 hibridoma regresión tumoral inducida y la supervivencia a largo plazo cuando se administra 15 días después de la implantación del tumor, independiente de linfocitos T específicos de antígeno tumoral. En combinación con la entrega intratumoral de Ad-Flt3L y Ad-TK, sin embargo, hemos encontrado que la administración PC61 24 días después de la implantación del tumor (7 días después del tratamiento) la respuesta inmune adaptativa completamente suprimidas contra antígenos tumorales GL26. Además de células T reguladoras, CD25 también se expresa en la superficie celular de precursor B y los linfocitos T y una subpoblación madura de DC [30], y también está regulada positivamente en la superficie celular de los linfocitos T activados y linfocitos B [31]. En nuestro modelo, la administración de CD25-anticuerpos también eliminó activa, CD25
+ linfocitos T e impidió la expansión clonal de las células T específicas de antígeno tumoral. Nuestros datos sugieren que el uso de PC61 con el objetivo de agotamiento Treg podría reducir la eficacia de los regímenes inmunoterapéuticos por la supresión de la activación y expansión clonal de linfocitos T específicos de antígeno tumoral.
Resultados
tumores intracraneales GBM singénicos son densamente infiltrado con células inmunes, incluyendo células t reguladoras
la acumulación de Foxp3
+ células t reguladoras en los gliomas humanos se correlaciona con el grado del tumor y la supervivencia de los pacientes [24]. La acumulación de Foxp3
+ Tregs en gliomas de ratón singénicas También se ha descrito y el agotamiento de células T reguladoras con inmunoglobulinas-CD25 específico puede inducir la regresión del tumor y mejorar la supervivencia en estos modelos preclínicos [25], [32], [33]. Con el fin de investigar si el agotamiento de Treg podría mejorar el resultado terapéutico en combinación con la terapia de la inmunoterapia /gen, que primero establecido si Tregs infiltrado en el glioma singénico de ratón derivada de la implantación intracraneal de células GL26 en el cuerpo estriado del cerebro. La implantación de células GL26 singénicos reproducible condujo al crecimiento lineal de los tumores (R
2 & gt; 0,99) con un volumen medio del tumor de aproximadamente 0,5 mm
3 a día 15 y 30 veces más grandes (15 mm
3) en día 24 (Fig. 1A). Estos tumores presentan infiltración profusa de CD45
+ y F4 /80
+ células, que son evidentes a lo largo de la masa tumoral y también en las fronteras (Figura 1B). infiltración de células inmunes en los tumores también se evaluó por citometría de flujo de 24 días después de la implantación del tumor (Fig. 1 C). Detectamos tumor infiltrante MDC (CD11c
+ CD45
+ IA
b +, Fig. 1CI) y MΦ (CD11b
+ CD45
+ IA
b +, Fig. 1Cii) que representado 3,5% y 19% del número total de células inmunes CD45 + presentes en el tumor, respectivamente. Los linfocitos también se identificaron y constituían ~ 80% del número total de células inmunes que infiltran los tumores (Fig. 1 C iii-vi) CD45 +. Entre ellos CD4
+ células T (CD3ε
+ CD4
+ CD8a
-, 26%), CD8a
+ células T (CD3ε
+ CD4
- CD8a
+, 18%), Foxp3
+ células T reguladoras (CD3ε
+ CD4
+ Foxp3
+, 8,4%), las células NK (CD3ε
- NK1.1
+ CD45
+, 18%), las células NK-T (CD3ε
+ NK1.1
+ CD45
+, 7%) y las células B (CD3ε
- CD19
+ CD45
+, 5%). La presencia de CD4
+, CD8a
+, CD19
+ linfocitos, así como CD205 MDC también se observó por inmunofluorescencia (Fig. 1 D). Además, se observaron grandes números de linfocitos que eran inmunorreactivas para CD25 dentro del tumor usando microscopía confocal (Fig. 1 D) y citometría de flujo (CD3ε
+ CD25
+ CD45
+) (Fig. 1 E, F). Por otra parte, el porcentaje de CD3ε
+ células T que expresa células CD25 superficie fue ~ 40% del número total de tumor infiltración de células T y se elevó en gran medida en el nodo de drenaje (cervical) linfático (DLN) (p & lt; 0,05) y tumor (p & lt; 0,01) (Fig. 1 e). cuando se compara con el bazo de ratones portadores de tumores
(A) GL26 volumen del tumor 7, 14 y 21 días después de implantion en el cuerpo estriado del cerebro de ratones C57BL /se determinó 6 ratones. Reactivo de tinción astrocitos (GFAP +) se utilizó para definir el borde del tumor con el tejido cerebral no maligno. secciones representativas de cerebros de ratones portadores de tumores implantados 7, 14 y 21 días con anterioridad y teñidas con GFAP se muestran a la izquierda. cinética de crecimiento del tumor eran esencialmente exponencial durante el período de tiempo analizado con un tiempo de duplicación de aproximadamente 1,8 días. se utilizaron 5 ratones para determinar el volumen del tumor en cada punto de tiempo. (B) La infiltración de células inmunes en tumores intracraneales GL26. Las secciones del cerebro de los ratones portadores de tumores se tiñeron con anticuerpos contra CD45 (leucocitos) o F4 /80 (macrófagos /microglia activada). Confocal de imágenes representativas muestran células inmunes (verde) dentro de la masa tumoral y en los límites del tumor. DAPI (azul) se usa para teñir los núcleos. Las flechas amarillas indican las células inmunorreactivas. T: tumor. (C) la infiltración de células inmunitarias del tumor se aislaron a partir de tumores 24 días después de la implantación del tumor y se analizaron usando citometría de flujo. (I) gráfico de puntos de CD11c contra I-Ab que fue cerrada por primera vez para los leucocitos CD45 + en vivo. DC (CD11c + CD45 + I-Ab +) se muestran en el cuadro rojo. (Ii) Los macrófagos (MΦ) se evaluaron por gating leucocitos en vivo con CD45, CD11b y luego trazando contra I-Ab. El cuadro rojo esboza la población de macrófagos infiltrantes de tumor (CD11b + CD45 + I-Ab +). (Iii) las células T se tiñeron con CD3ε-PE, CD4-PerCP y CD8a-FITC. La trama muestra CD4 contra CD8a cuando las células fueron cerrada en primer lugar para los leucocitos vivos CD3ε +. células T CD4 + y células T + CD8a se muestran en cajas de color rojo. (Iv) las células T reguladoras tumor infiltrante se observaron mediante tinción con CD3ε-PE, CD4-PerCP y Foxp3-FITC. leucocitos vivos CD3ε + fueron cerrada y gráficos de puntos muestran Foxp3 contra las manchas de CD4. La población de células T reguladoras (CD4 + Foxp3 + CD3ε +) se muestran en el cuadro rojo. (V) las células NK y NK-T se visualizaron por gating CD45 + en vivo leucocitos, a continuación, se presentan NK1.1 contra CD3ε. La población de infiltrantes de tumor células NK (CD45 + CD3ε- NK1.1 +) y células NK-T (CD3ε + CD45 + NK1.1 +) se muestran en cajas de color rojo. (Vi) El tumor infiltrante linfocitos B se visualizó por gating de leucocitos en vivo, entonces el trazado de CD45 contra CD19. La población de células B (CD19 + CD45 +) se muestra en un cuadro rojo. Los porcentajes de cada población de células inmunes infiltrantes del tumor con respecto al número total de CD45 + células del tumor se indica en gráficos de puntos representativos. tinción (D) Nissl se utiliza para visualizar tumores en el cerebro. Los tumores son densos en sustancia de Nissl, por lo mancha más oscuro que el tejido cerebral normal. Representante imágenes confocal muestran tumor infiltrante linfocitos T CD4 +, células T CD8 +, CD205 + mDCs, células B CD19 +, CD25 + y células inmunes (visto en verde) y DAPI (azul) se utiliza para visualizar los núcleos. Las flechas amarillas indican las células inmunorreactivas. (E) Análisis de citometría de flujo del porcentaje de células T que expresan CD25 en los bazos, DLN y tumores en ratones portadores de tumores intracraneales cerebro GL26 24 días después de la implantación del tumor. (F) gráficos de puntos representativos de CD25 vs CD3ε en células inmunes aisladas del bazo, LN y tumor. Los porcentajes de población de células CD25 + con respecto al número total de células CD3ε + en el tumor, ganglios linfáticos de drenaje o del bazo se indican en gráficos de puntos representativos.
El agotamiento de células T reguladoras utilizando PC61 induce la regresión del tumor cerebral sino que también reduce las células T en el tumor y DLN
Teniendo en cuenta que detectamos extensa infiltración de regs T dentro de los tumores intracraneales GL26, que tuvo como objetivo agotar esta población celular inmune con el fin de determinar su efecto sobre la progresión de células tumorales y en anti-tumor respuesta inmune inducida por un enfoque inmunoterapéutico dependiente de células T, es decir, Ad-Flt3L /TK. Se encontró que el hibridoma PC61 IgG1 de rata para unirse con el ratón de alta afinidad de IL-2 receptor (CD25) [34] y
in vivo
administración de PC61 a ratones provoca el agotamiento de células T reguladoras por más de una semana [33] , [35]. Por lo tanto, se utilizó este anticuerpo para inducir el agotamiento T reg
in vivo
en un modelo de glioma intracraneal del ratón singénico. En primer lugar, determinar si PC61 afectaría a la viabilidad de las células tumorales y el crecimiento
in vitro
y
in vivo
. La incubación de células PC61 con GL26 no afectó la viabilidad celular GL26 (Fig. 2A) o la proliferación
in vitro
(Fig. 2B). entonces Administramos PC61 o control de isotipo IgG de ratones portadores de tumores atímicos nu /nu, que han demostrado ser deficientes en T regs [26], [36]. Un recuento con otros informes [26], se encontró que el crecimiento del tumor en T reg deficiente
nu /nu
ratones con deficiencia inmune no fue afectada por PC61; tanto el control de isotipo o ratones PC61-inyectado sucumbieron debido a la carga tumoral 18-22 días después de la implantación del tumor.
Se incubaron las células (A) GL26 para 48 h con 100 g /PC61 ml o 100 mg /ml de IgG1 de rata control de isotipo. Las células se recogieron a continuación y se tiñeron con Anexina V-FITC y yoduro de propidio para identificar las células apoptóticas. No hay un aumento significativo en la apoptosis se observó cuando las células fueron incubadas con PC61 o control de isotipo de las inmunoglobulinas se compara con los controles no tratados (p & gt; 0,05). Se observó un gran aumento de la apoptosis cuando se incubaron células durante 4 h con H2O2 (p & lt; 0,001). Las barras de error representan el error estándar de 3 repeticiones y el ensayo se repitió 3 veces. Una forma ANOVA con post test de Tukey se utilizó para calcular diferencias significativas (*** p & lt; 0,001). (B) La proliferación de células GL26 se midió mediante la detección de la incorporación de BrdU en el ADN. cuando las células se incubaron con PC61 (rata IgG1αCD25) en comparación con controles de isotipo (IgG1 de rata), o las células no tratadas (*** p & lt; No se observó ninguna diferencia significativa en la proliferación (0,05 p & gt); 0,001 en comparación con el negativo (control sin células), ns = no significativo). (C) atímicos nu /nu ratones (Balb /c de fondo) fueron desafiados con una sola inyección intracraneal de células GL26 y se trató 15 d después con 1 mg o bien PC61 o control de isotipo de las inmunoglobulinas inyectaron i.p. Se controló la supervivencia y los ratones fueron sacrificados por encontrarse moribundos. No se observaron diferencias significativas en la supervivencia mediante una prueba de log rank (p & gt; 0,05) (n = 5)
Después de descartar cualquier efecto directo del PC61 sobre el crecimiento de células tumorales se estudió el efecto de la T. el agotamiento de reg tipo salvaje ratones C57 /B6 que llevan glioma intracraneal GL26. El paradigma experimental utilizado se representa en la Fig. 3A. El agotamiento de células T reguladoras 15 días después de la implantación de células tumorales aumentó significativamente el número de supervivientes a largo plazo con 40% de los ratones todavía estaban vivos 150 días más tarde (p & lt; 0,05, Fig 3B.). Esto fue más de 5 veces más que la supervivencia media de los ratones portadores de tumores control (Fig. 3B). No se observó ningún aumento significativo en la supervivencia a largo plazo cuando Tregs se agotaron en los tumores más grandes (24 días) (p & gt; 0,05) y sólo 10% de los ratones sobrevivieron a largo plazo de este grupo (Fig 3B.). Curiosamente, no observamos ninguna respuesta DTH cuando inyectamos células irradiadas GL26 en la pata de supervivientes a largo plazo de Treg agotado ratones (Fig. 3C). Con el fin de evaluar los efectos del tratamiento con PC61
in vivo
, se analizó la presencia de Foxp3
+ CD4
+ células T reguladoras infiltrarse en los medios de GBM, así como en los ganglios linfáticos de drenaje y el bazo después de la inyección intraperitoneal de PC61 (días 15 y 24) o el control de isotipo IgG1 de rata (día 15 días) en ratones portadores de tumores. inyección PC61 en día 15 condujo a una reducción 9 veces (p & lt; 0,001) en el número de tumor infiltrante Tregs cuando se mide usando citometría de flujo 12 días más tarde (día 27), y la inyección de PC61 en día 24 condujo a la disminución casi completa de Tregs (p & lt; 0,001) en el tumor 3 días más tarde (día 27) (Fig. 3D). Como se esperaba, las poblaciones periféricas Treg en los ganglios linfáticos de drenaje (Fig. 3E) y el bazo (Fig. 3F) se redujeron también significativamente en comparación con los controles tratados con isotipo (p & lt; 0,001). Curiosamente, se observó una disminución de 3 veces en el porcentaje absoluto de CD4
+ células T (Fig. 4A) y CD8a
+ células T (Fig. 4B) la infiltración en el tumor después de la administración de la PC61. poblaciones Además, PC61 agota significativamente de CD4 + células T
(p & lt; 0,05, Fig 4C). Las células y CD8
+ T (p. & lt; 0,01, Fig 4D) en los ganglios linfáticos tumor de drenaje. No hubo ningún cambio observado en los porcentajes de células CD4
+ T y CD8a
+ células T en el bazo (p & gt;. 0.05, Fig 4E-F) y MΦ y DC se mantuvo sin cambios en los tumores y ganglios linfáticos de drenaje aunque aumentado ligeramente en el bazo (Fig. 5).
(a) Diagrama que representa los diferentes tratamientos administrados a 4 cohortes de ratones portadores de tumores. células GL26 se implantaron en el cerebro de todos los ratones en el día 0 y se trataron por el suministro intratumoral de solución salina en días 17 con el agotamiento de CD25
+ células utilizando PC61 en día 15 (verde) o en días 24 (rojo). Los grupos de control de ratones portadores de tumores recibieron rata de control de isotipo IgG1 en día 15 (azul), o no la administración sistémica de inmunoglobulinas (Negro) como se indica. Los ratones se utilizaron ya sea para estudios de supervivencia, o sometidos a eutanasia en el día 27 post-implantación del tumor para el análisis de poblaciones de células inmunes por citometría de flujo. curva (B) Kaplan-Meier que muestra la supervivencia de los 4 grupos de ratones descritos en (A). Diez ratones fueron utilizados en cada grupo y se utilizó una prueba de log-rank para calcular la significación entre el grupo no tratado con los grupos tratados con PC61. * P & lt; 0,05 en comparación con los ratones no tratados y ratones tratados de control de isotipo. Se llevó a cabo (C) Prueba de DTH en ratones sobreviviente a largo plazo de 100 días después de la implantación del tumor. Los ratones originalmente había sido tratado con PC61 en el día 15 (líneas verdes). Las células irradiadas GL26 en PBS en la almohadilla de la pata trasera derecha (caja llena) o control de PBS en la almohadilla de la pata trasera izquierda (caja abierta) de los ratones. El espesor de la almohadilla de la pata se determinó 0 h, 4 h, 24 h y 48 h después de la inyección de células irradiadas o PBS. De dos vías ANOVA con post test de Tukey se utilizó para calcular diferencias significativas. (D-F) células T reguladoras (CD3ε
+ CD4
+ Foxp3
+) tumores infiltrantes (D), ganglios linfáticos de drenaje (E) o bazos (F) se cuantificaron en ratones administrados de rata de control de isotipo IgG1 ( iso) o PC61 en el día 15 (15) o el día 24 (24) como se indica en los gráficos (izquierda). Las gráficas de puntos (derecha) muestran datos representativos a partir de 5 ratones por grupo. Los porcentajes de regs T con respecto al número total de células CD45 + en los tumores, ganglios linfáticos de drenaje (DLN) o bazo se indican en gráficos de puntos representativos. Una forma ANOVA con post test de Tukey se utilizó para determinar las diferencias significativas (*** p & lt; 0,001).
C57BL /6 ratones fueron retados con células tumorales en el día 0, y se tratan en el día 17 de entrega intratumoral de solución salina. Tregs se agotaron en cualquiera de los días 15 y 24 de día mediante inyección ip de PC61. Se aislaron las células inmunes del bazo, el LN cervical y el tumor intracraneal en día 27 post-implantación del tumor para determinar el porcentaje de células T CD4 + y células T + CD8a en cada tejido. El porcentaje de tumor infiltración de células inmunes que eran células T CD4 + (CD3ε + CD4 + CD8a-) (A) y células T (CD8a CD3ε + CD4- CD8a +) (b); el porcentaje de células inmunes en los nódulos linfáticos de drenaje que eran células T CD4 + (CD3ε + CD4 + CD8a-) (C) y las células T + CD8a (CD3ε + CD4- CD8a +) (d); y el porcentaje de células inmunes en el bazo que eran células T CD4 + (CD3ε + CD4 + CD8a-) (E) y células T CD8a (CD3ε + CD4- CD8a +) (F) se muestran en los gráficos (izquierda). gráficos de puntos representativos de cada grupo de tratamiento se muestran a la derecha (cerrada para los leucocitos en vivo con FSC frente a SSC y los linfocitos T CD3ε). Los porcentajes de cada población de células inmunes con respecto al número total de células CD45 + en los tumores, ganglios linfáticos de drenaje (DLN) o bazo se indican en gráficos de puntos representativos. Una forma ANOVA con post test de Tukey se utilizaron para calcular diferencias significativas. (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01).
GL26 células fueron implantadas en el cuerpo estriado del cerebro de ratones C57BL /6. inmunoglobulinas de rata de control de isotipo IgG1 (-) se administraron en los días 15 y PC61 se administró en el día 15 o día 24 como se indica. El porcentaje de macrófagos infiltrantes de tumor (MΦ; CD11b + CD45 + I-Ab +) (A, C, E) y células dendríticas mieloides (MDC; CD11c + CD45 + I-Ab +) (B, D, F) se cuantificaron en día 27 post-tumor implantación mediante citometría de flujo en el tumor (a, B) DLN (C, D) y el bazo (e, F). Los porcentajes de cada población de células inmunes con respecto al número total de células CD45 + en los tumores, ganglios linfáticos de drenaje (DLN) o bazo se indican en gráficos de puntos representativos. 5 y 10 ratones se analizaron por grupo. Una forma ANOVA con post test de Tukey se utilizó para determinar la significación estadística.
El tratamiento con PC61 impide la activación de la respuesta inmune anti-tumor de adaptación e inhibe la regresión del tumor cuando se usa en combinación con Ad-Flt3L y Ad- los conocimientos tradicionales
también como objetivo investigar los efectos del agotamiento de las células T reguladoras usando una inmunoglobulina anti-CD25 sobre la eficacia de la inmunoterapia celular dependiente de T mediada por la entrega intratumoral de Ad-Flt3L y Ad-TK [27], [37]. Activado CD4
+ y CD8
+ linfocitos T upregulate CD25 de la superficie celular después de la unión inicial de la TCR con el antígeno que se muestra en MHC [30], [31] y esto podría explicar la aparente disminución en las células T que se observó en tumores (Fig. 4A-B) y DLN (Fig. 4C-D) después de la administración de PC61. Para investigar más a fondo, y determinar si la eliminación de células T reguladoras utilizando PC61 podría afectar negativamente a la inmunoterapia dependiente de células T de GBM, que implanta los tumores en el cuerpo estriado en el día 0 y los ratones fueron tratados con Ad-Flt3L y Ad-TK 17 días más tarde, mientras PC61 o inmunoglobulinas de control de isotipo se administraron a los grupos en el día 15 o el día 24 (Fig. 6A). Cuando se inyectó Ad-Flt3L y Ad-TK en el tumor en el día 17 (cuando el tumor era de 1 mm
3 en tamaño (Fig. 1A) se observó un fuerte incremento en la supervivencia con el 50% de los ratones vivos 150 días más tarde ( p & lt; 0,01, Fig 6B) que no fue afectada de manera adversa por la administración de rata de control de isotipo IgG1 (p & gt;.. 0.05) PC61 administrado 2 días antes de la inyección de Ad-Flt3L y Ad-TK redujo la supervivencia a 30%, aunque esto no fue estadísticamente diferentes de los controles tratados isotipo (p & gt;. 0.05, la figura 6B). Sin embargo, cuando tratamos a los ratones con Ad-Flt3L y Ad-TK en el día 17 y agotadas las células t reguladoras en el día 24, se encontró que la supervivencia a largo plazo se redujo significativamente en comparación con los ratones que no recibieron PC61. (p & lt;. 0.05, Fig 6B) Sólo 10% de los ratones portadores de tumores sobrevivido 150 días más tarde, lo que sugiere que la administración de PC6 17 d después del parto intratumoral de Ad-Flt3L y Ad-TK afecta negativamente T se observó dependiente de la regresión del tumor cerebral celular en los supervivientes a largo plazo después del tratamiento con Ad-Flt3L y Ad-TK, una respuesta DTH a las células GL26 irradiados en la almohadilla de la pata cuando los ratones se había administrado ya sea PC61 (p & lt; 0,01). o controles de isotipo (p & lt ; 0,001) (Fig. 6C). Además, el tratamiento de ratones portadores con Ad-Flt3L y Ad-TK tumor indujo un aumento robusto en el número total de células T de respuesta de tumor que secreta IFN cuando se incubaron-co con BMDC cargado con extractos de células GL26 (p & lt;. 0,001, Fig 6D ). Curiosamente no se observó ningún aumento de IFN secretoras de linfocitos T en respuesta a BMDC cargado con extractos de células GL26 cuando PC61 se inyectó ya sea antes (15 días) o posterior (24 días) de tratamiento utilizando Ad-Flt3L y Ad-TK (p & gt; 0,05, Fig. 6D). El número de tumor infiltrante Tregs se redujo después de la administración sistémica de PC61 (p & lt;. 0,001, Fig 6E) y el porcentaje de células T reguladoras también se redujo significativamente en DLN y el bazo, (p & lt;. 0,001, Fig 6F-G) con independencia de si los ratones fueron tratados con solución salina o con Ad-Flt3L y Ad-TK.
ratones C57BL /6 (a) se expusieron a las células tumorales en el día 0, y se tratan en el día 17 por la entrega intratumoral de Ad-Flt3L y Ad-TK o solución salina como se indica. Tregs se agotaron en ambos días 15 (verde) o día 24 (rojo) por inyección ip de PC61 o en día 15 con el control de isotipo (azul). Las células inmunes se aislaron a partir del bazo, el LN cervical y el tumor. Los ratones se utilizaron ya sea para estudios de supervivencia o sometidos a eutanasia en el día 27 para el análisis de poblaciones de células inmunes por citometría de flujo y ELISPOT. (B) Curva de Kaplan-Meier se presentan los datos de supervivencia de 10 ratones por grupo. diferencias estadísticamente significativas a Ad-Flt3L y Ad-TK ratones tratados solamente (línea de color negro, sin el agotamiento PC61) se calcularon utilizando la prueba de log-rank (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01). La administración de PC61 a los ratones 24 días después de la implantación del tumor (7 días después del tratamiento con Ad-Flt3L y Ad-TK) redujo significativamente la supervivencia a largo plazo. (C) los ratones portadores de tumores fueron tratados con Ad-Flt3L y Ad-TK solo (líneas negras) o con Ad-Flt3L y Ad-TK con el agotamiento PC61 en el día 15 (líneas verdes). Se evaluaron los supervivientes a largo plazo (60 días después de la implantación del tumor) para una respuesta DTH a las células irradiadas GL26 inyectados en la almohadilla de la pata derecha (en comparación con PBS solo en la almohadilla de la pata izquierda). De dos vías ANOVA con post test de Tukey se utilizó para calcular diferencias significativas entre los grupos (*** p & lt; 0,001 ratones tratados con Ad-Flt3L y Ad-TK sin agotamiento, p & lt; 0,01 Ad-Flt3L y Ad-TK ratones tratados empobrecido con PC61 en el día 15). (D) IFN ELISPOT mostrando el número total de IFN que producen los linfocitos T que fueron estimuladas con DC cargadas con extractos tumorales GL26. Los linfocitos T se purificaron a partir de ratones 10 d después del tratamiento con Ad-Flt3L y Ad-TK (+) o solución salina (-) como se indica. Las barras negras son los linfocitos T de ratones que no recibieron CD25 ozono inmunoglobulinas. Las barras verdes son los linfocitos T purificadas de ratones empobrecido con PC61 2 días antes del tratamiento con Ad-Flt3L y Ad-TK (día 15 después de la implantación del tumor) y barras rojas son linfocitos T purificadas de ratones empobrecido con PC61 7 días después del tratamiento con Ad-Flt3L y Ad-TK (día 24 después de la implantación del tumor). (E-G) células T reguladoras (CD3ε
+ CD4
+ Foxp3
+) tumores infiltrantes (E), ganglios linfáticos de drenaje (F) o bazos (G) se cuantificaron en ratones administrados de control de ratas isotipo IgG1 ( Iso) o PC61 en el día 15 (15) o el día 24 (24) como se indica en los gráficos (izquierda). La administración de PC61 a ratones dio como resultado el agotamiento a largo plazo de células T reguladoras en los sitios periféricos (bazo y nódulos linfáticos) y en el tumor. Las gráficas de puntos (derecha) representante de medios de visualización ± SEM de Foxp3
+ células T reguladoras cuantificado a partir de 5 ratones por grupo. El número total de regs T en los tumores (E) y los porcentajes de regs T con respecto al número total de células CD45 + en los ganglios linfáticos de drenaje (DLN) o bazo (F y G) están indicados en diagramas de puntos representativos. De dos vías ANOVA con post test de Tukey se utilizó para determinar las diferencias significativas (*** p & lt; 0,001).
El tratamiento con PC61 impide aumentos en tumores que infiltran las células T y los DC MΦ pero no después del tratamiento con Ad En la Fig.