Extracto
pérdida de peso involuntaria en pacientes con cáncer es el sello de la caquexia por cáncer. La etiología de la caquexia es multifactorial que implica pérdida de músculo esquelético y tejido adiposo asociado con altos niveles sistémicos de proteínas de fase aguda y citocinas inflamatorias. Mientras que el desgaste muscular impactos abiertamente sobre la calidad del paciente con cáncer de la vida, la pérdida de los depósitos de lípidos representa un desequilibrio energético sostenido. En este estudio de eliminación de grasa fue examinado en Colon-26 modelo de caquexia por cáncer, que es un modelo de roedor ampliamente utilizado de este síndrome. Hemos investigado la expresión diurna de los reguladores del ritmo circadiano, así como mediadores clave del metabolismo de la energía y la señalización de citoquinas. Los ratones que llevan el tumor C26 exhibieron reducción de la masa adiposa, la lipólisis del tejido adiposo elevada y un aumento de 5 veces en los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres. Estos cambios se asociaron con activado IL-6 de señalización en WAT a través de un aumento de 3 veces en STAT3 fosforilados y alta SOCS3 niveles de expresión génica. En adición de las perturbaciones en la regulación circadiana del metabolismo de los lípidos, también se observaron. catabolismo de los lípidos no pareció estar influenciada por la vía clásica PKA la activación de la HSL lipasa. los niveles de proteína ATGL se elevaron 2 veces en ratones caquécticos mientras aumento de 4 veces ACC fosforilados y una disminución de 2 veces en 4EBP1 fosforilada se observó que indica que el metabolismo de lípidos es modulada por la ATGL & amp; vías AMPK /mTOR. Este estudio proporciona evidencia de la activación de la señalización de citoquinas y alteraciones concomitantes en el ritmo circadiano y los reguladores del metabolismo de los lípidos en el TAB de animales caquécticos
Visto:. Tsoli M, M Schweiger, Vanniasinghe AS, Pintor A, R Zechner, Clarke S, et al. (2014) El agotamiento de tejido adiposo blanco en Cáncer caquexia síndrome se asocia con la señalización inflamatoria y el Reglamento circadiano interrumpido. PLoS ONE 9 (3): e92966. doi: 10.1371 /journal.pone.0092966
Editor: Harpal Singh Randeva, Universidad de Warwick - Escuela de Medicina, Reino Unido
Recibido: 29 de octubre de 2013; Aceptado: 27 Febrero 2014; Publicado: 25 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Tsoli et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca del programa traslacional del cáncer Instituto NSW para el cáncer colorrectal. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Colon caquectizante 26 células fueron amablemente proporcionados por Amgen. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
síndrome de caquexia Cáncer (CCS) es frecuentemente experimentado por los pacientes con cáncer avanzado es la más prevalente en páncreas, tracto gastrointestinal superior y de pulmón y representa casi el 20% de la morbilidad relacionada con el cáncer [1], [2]. Actualmente no existen tratamientos eficaces o pruebas de pronóstico para indicar a los pacientes en riesgo de desarrollar la caquexia. CCS es un trastorno metabólico complejo caracterizado por la pérdida involuntaria de peso, el tejido adiposo y el agotamiento del músculo esquelético, anorexia y fatiga. La caquexia es a menudo asociada con la inflamación sistémica indicado por CRP plasma elevado y la reducción de los niveles de albúmina [3]. Además los pacientes caquécticos con cáncer a menudo experimentan aumento de la toxicidad durante la quimioterapia /radioterapia que conduce a una reducción de la calidad de vida y la supervivencia de los pobres posterior [4], [5]. Aunque el mecanismo exacto aún no se ha aclarado completamente, es ampliamente aceptado que el aumento de los niveles de citoquinas como la interleuquina-6 (IL-6), el factor de necrosis tumoral (TNF) y otros factores tales como el zinc-alfa 2-glicoproteína (ZAG) desencadenar los eventos catabólicos que promueven el agotamiento de lípidos de los depósitos de grasa y la astenia [6], [7], [8]. En particular, IL-6 se ha implicado en el desarrollo de la caquexia en modelos de roedores portadores de tumor y la pérdida de tejido adiposo en pacientes con cáncer [9], [10], así como directamente estimular la lipólisis en adultos [11]. El-26 Colon (C26) carcinoma es un modelo murino bien establecido de la caquexia del cáncer resulta en altos niveles sistémicos de IL-6. La administración de agentes que inhiben la IL-6 de señalización prevenir la atrofia y otras características de la caquexia en varios modelos animales de la caquexia como el de colon 26 [12], [13], [14].
Además de actuar como un aislante y el depósito de lípidos durante los períodos de demanda metabólica, el papel del tejido adiposo blanco (WAT) se extiende a neuroendocrinos de control de la homeostasis energética, el apetito y respuestas inmunes /inflamatorias. Mientras que la movilización de los lípidos de los adipocitos para suministrar energía a otros órganos durante el ayuno /restricción calórica es la función principal de WAT, también está implicado en la secreción de adipoquinas y citoquinas, con muchos adipoquinas que presentan variaciones diurnas en el plasma que pueden influir en el apetito, la energía el gasto y la reproducción [15]. Por el contrario órganos distales controlan lipolítica vs vías lipogénesis en WAT a través de las hormonas y citocinas para regular las rutas metabólicas de lípidos y de ese modo lograr el equilibrio energético de todo el cuerpo. Por lo tanto la pérdida de masa WAT durante el desarrollo de la caquexia impactaría en múltiples órganos y sistemas más allá de la provisión alteración de los lípidos ricos en energía
.
La secreción y actividad de los reguladores del metabolismo diurnas están vinculados a propio reloj endógeno del cuerpo para que coincida con nutrientes de suministro con los ciclos de actividad y las señales del medio ambiente [16]. El control central del ritmo circadiano está mediada por el núcleo supraquiasmático en el que un mecanismo de retroalimentación molecular auto-regulado que involucra los reguladores Bmal /CLOCK y proteínas diana Per /Cry opera para ejercer la regulación neural en funciones de reloj en los órganos periféricos. Un bucle de retroalimentación adicional implica el receptor nuclear Rev-erbα, que también juega un papel esencial en la adipogénesis. Análisis molecular de WAT encontró que ~ 20% del transcriptoma adiposo exhibe un patrón de expresión diurna rítmica [17]. De hecho muchos factores de transcripción nuclear tales como los receptores de proliferador de peroxisoma activados (PPARs), así como la clave de energía regulador homeostático AMPK (AMPK) y enzimas metabólicas (lipasa-LPL lipoproteínas) presentan perfiles oscilatorios que indica interacciones complejas entre circadiano reloj, el balance de energía y señales del medio ambiente [18]. desregulación circadiana se asocia con un mayor riesgo de síndrome metabólico que comprende la obesidad, resistencia a la insulina y las enfermedades cardiovasculares [19], [20]. Los modelos de ratón de los componentes del reloj circadiano genéticamente manipulados Bmal o características de visualización de reloj de fenotipos o delgadez del tipo del síndrome metabólico, respectivamente [21], [22]. Por otra parte, los estudios clínicos han demostrado un mayor riesgo de obesidad y sus comorbilidades en turno de noche y trabajadores jet-lag [20], [23].
Estudios anteriores encontraron que el tejido adiposo blanco es uno de los primeros órganos en verse afectados durante la caquexia del cáncer con el agotamiento WAT a menudo evidente en ausencia de pérdida de masa corporal magra abierta [9]. La pérdida de tejido adiposo está mediado predominantemente por el aumento de la lipólisis asociado con un estado hipermetabólico y en cierta medida reducida deposición de grasa [24], [25], [26]. La movilización de las reservas de lípidos en el tejido adiposo durante la caquexia está mediada por la lipasa de triglicéridos del tejido adiposo (ATGL) y la lipasa sensible a hormonas (HSL) [24]. El papel fundamental que desempeña la ATGL en la caquexia por cáncer se destacó no sólo por la preservación de la masa grasa, pero también la falta de pérdida de músculo esquelético, en ratones deficientes ATGL con carcinomas de pulmón de Lewis caquexia o melanomas B16 [24]. Si bien estos estudios se extienden nuestra comprensión de la contribución de estas lipasas hacen a la integridad del tejido adiposo en el cáncer, así como otros estados metabólicos [27], el mecanismo de señalización que inicia el agotamiento de la grasa en la caquexia sigue siendo poco entendido [28], [29]. Varias preguntas siguen sin respuesta en lo que respecta a las características de hipermetabolismo - especialmente aumento de la lipólisis - aparentes en la caquexia por cáncer. ¿Cuáles son los vínculos entre una mayor lipólisis y la inflamación sistémica asociada con la caquexia por cáncer? Se incrementa operativa durante el agotamiento de señalización de citoquinas tejido adiposo? ¿Cómo es la expresión diurna de reguladores maestros del ritmo circadiano y el metabolismo de los lípidos afectada durante la caquexia por cáncer? Son los niveles diurnos normales de sensores y mediadores del estado nutricional y el metabolismo lipídico alterado en el TAB clave?
En este estudio se investigó el impacto de la caquexia de colon-26 de carcinoma en los adipocitos blancos ritmicidad y la función diurna. Este modelo murino de la caquexia del cáncer se ha utilizado ampliamente para estudiar la caquexia, ya que exhibe deficiencias funcionales y metabólicas similares a la condición clínica [30]. Nos caracteriza específicamente la expresión diurna de genes importantes para el control del ritmo circadiano y el metabolismo lipídico, así como el estado de activación de los principales reguladores de la homeostasis energética en dos momentos opuestos en el ciclo diurno. Mostramos evidencia de la señalización de citoquinas a través de componentes de la IL-6 cascada de señalización - STAT3 y SOCS3. Además, nos informan de que la estimulación de la cascada lipolítica de los ratones caquéctico se asocia con un aumento de ATGL y perilipina en lugar de a través de la PKA /HSL. Nuestros datos identifica potencial de interferencia entre la AMPK, mTOR y 4EBP1 como mediadores importantes del metabolismo lipídico alterado en la caquexia por cáncer.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y estudios en animales
las 26 células que inducen caquexia Colón (C26) es un adenocarcinoma de colon murino y fueron amablemente proporcionados gratuitamente por AMGEN (EE.UU.) [31]. células C26 se cultivaron y mantuvieron en medio RPMI (Invitrogen) que contiene 10% de suero bovino fetal (Invitrogen) y 100 g /ml de penicilina /estreptomicina (Invitrogen) en un CO 5%
2 medio ambiente. Libres de patógenos, de 10-12 semanas de edad, macho BALB /c * DBA2 ratones (F1 híbrido) fueron adquiridos de ARC, Perth (Australia), y se mantuvieron a una temperatura ambiente de 22 ° C bajo un ciclo de 12 horas de luz (luces encendidas las 6:00 am a 6:00 pm). Colon 26 células se inocularon por vía subcutánea en 1 × 10
6 células /100 l en el flanco derecho de los ratones. Los ratones de control fueron inyectados con 100 l de RPMI que contenía medio antibióticos. Durante un período de 14 días después de la inoculación, el peso corporal, la ingesta de alimentos y tumorales dimensiones se registraron diariamente. Portadores de tumores y de los ratones de control sin Fed había
ad libitum
acceso a los alimentos. Un grupo de ratones de control fue alimentado par para que coincida con la ingesta diaria de alimentos del grupo C26-cojinete caquéctico. Pair-alimentación se logra dando no tumoral que lleva los ratones de control de la ingesta de alimentos de los correspondientes C26-tumor teniendo animales. Los ratones fueron euthanazed por dislocación cervical antes de la cosecha tejidos adiposos del epidídimo que se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. La experimentación con animales se realizó de acuerdo con el Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines científicos en el marco del Reglamento de Experimentación Animal (2005), de Nueva Gales del Sur. El impacto del crecimiento tumoral y el desarrollo de la caquexia en el bienestar animal se considera, con las medidas adecuadas para controlar y aliviar el sufrimiento en marcha, bajo el protocolo#2007/006 aprobado por el Comité de Protección de los Animales de Sydney del Sur-Oeste Área de Servicio de Salud.
Evaluación de la caquexia y Análisis bioquímico
Catorce días después de la inoculación de células tumorales, los ratones se anestesiaron con ketamina /xilazina y euthanazed después de la recogida de sangre por punción cardiaca. Se midió el peso neto de las canales. se recogió la grasa del epidídimo, se pesó y después se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Las alícuotas de plasma obtenidas de la sangre de cada ratón se mantuvieron congeladas hasta el análisis adicional. El contenido no esterificados de ácidos grasos en el plasma de los animales caquécticos se determinó enzimáticamente usando el kit NEFA C (Wako Pure Chemicals /Novachem, Collingwood, VIC, Australia). El contenido de triglicéridos en el plasma de la caquexia inducción de animales portadores de C26 se determinó utilizando el analizador de Automater clínico (Roche Modular E170) siguiendo las instrucciones del fabricante (Roche).
adiposo Histología Tejido y microscopía
muestras WAT fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra solución (Sigma-Aldrich), se embebieron en cera de parafina, y 5 micras secciones cortadas y montadas en portaobjetos de vidrio. Después de la deshidratación, las secciones fueron teñidas con hematoxilina-eosina (H /E) para el examen histológico mediante microscopía óptica y software de rejilla CAST (Olympus Corp., Albertslund, Dinamarca). El análisis morfológico se realizó el tejido obtenido a partir de 4 animales por grupo (control, ratones y par alimentado C26-cojinete). superficie y el perímetro se estimaron a partir de aproximadamente 5-8 diferentes condiciones de visibilidad por imagen que da un total de 250 por dando es decir animales adipocitos 1000 por grupo experimental.
lipólisis del aislado WAT cultivos de órganos
almohadillas de grasa gonadales se eliminaron quirúrgicamente y se lavaron varias veces con PBS. piezas de tejido (~ 15 mg) se pre-incubaron durante 2 h en DMEM en presencia o en ausencia de 25 mM Hi-76-0079 (Novo Nordisk) en C37 ° C, 5% de CO
2, 95% atmósfera humidificada. A partir de entonces, el medio se sustituye por DMEM que contiene 2% de BSA (libre de ácido graso), ya sea en presencia o en ausencia de 10 mM de forskolina y 25 mM Hi-76-0079 y se incubaron durante otros 60 min a 37 ° C. Las alícuotas del medio se eliminaron y se analizaron para FFA y contenido de glicerol usando kits comerciales (HR Series NEFA-hr (2), WAKO Diagnostics). Para las determinaciones de proteína, almohadillas de grasa se lavaron extensamente con PBS y se lisaron en 0,3 N NaOH /0,1% SDS. mediciones de proteínas se realizaron utilizando el reactivo BCA (Pierce).
Análisis Cuantitativo PCR en tiempo real
El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Primera línea de cDNA se sintetizó a partir del ARN total utilizando superíndices III con cebadores aleatorios (Invitrogen) y oligo (dT) 12-14 (Invitrogen). Todas las secuencias de los cebadores fueron destruidas en contra de la base de datos de secuencia genómica NCBI ratón para asegurar la especificidad para el gen correspondiente. Primer secuencias se proporcionan en la Tabla S1. qPCR reacciones contenían 1,25 ng cDNA, 300 nm cebadores específicos del gen y 12 l SybrGreen (Invitrogen). Todas las reacciones se realizaron utilizando el Corbett Rotor Gene 6000 (Corbett Life Science). relativa niveles de mRNA se calcularon por el método comparativa ciclo umbral mediante el uso de
36B4
,
TFRC
y
bancos de leche materna
genes como los controles de limpieza.
Western Blot
extractos de células enteras a partir de tejidos adiposos se obtuvieron utilizando tampón de lisis RIPA suplementado con inhibidores de fosfatasa y proteasa (Roche) usando un homogeneizador de vidrio y se concentró con unidades de filtración centrífuga de acuerdo con los protocolos del fabricante (Tecnologías de señalización Celular, Millipore) y se cuantificaron posteriormente por kit de ensayo de proteína de ácido BCA (Pierce). Las proteínas (20 g) se resolvieron en 10% geles de Tris-HCl (Bio-Rad), y se transfirieron (iBlot, Invitrogen) como se describe por los fabricantes. Los lisados celulares se analizaron con los siguientes anticuerpos primarios: conejo anti-fosfo-p44 /42-activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) -Thr202 /Tyr204, conejo anti-p44 /42 MAPK, conejo anti-fosfo-p38 MAPK-Thr180 /Tyr182, MAPK conejo anti-p38, transductor de señal de anti-conejo y activador de la transcripción 3 (STAT3), de conejo anti-fosfo-STAT3-Ser727, conejo de conejo anti-ATGL anti-hormona-sensitive- lipasa (HSL), anti conejo -phospho-HSL-Ser563, conejo anti-acetil-CoA carboxilasa (ACC), de conejo anti-perilipina, conejo activados con anti-α-AMP proteína quinasa (AMPKα), de conejo anti-fosfo-AMPKα-Thr172, conejo anti-raptor , el objetivo de conejo anti-rapamicina en mamíferos (mTOR), de conejo anti-fosfo-mTOR-Ser2481, conejo anti-eucariótica factor de iniciación de la traducción 4E-proteína de unión 1 (4EBP1), de conejo anti-fosfo-4EBP1-Thr37 /46, anti-conejo -phospho-4EBP1-Thr70, conejo anti-fosfo-Ser65-4EBP1, conejo anti-3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (EHHADH /PBE) y de conejo anti-beta actina. se diluyeron Todos los anticuerpos primarios anti-fosfo 1:500 mientras que los anticuerpos restantes se diluyeron 1:1000. Las proteínas se visualizaron utilizando la cabra anti-conejo-HRP anticuerpo secundario (1:2000) y el kit-oeste femto (Pierce). Aparte de EHHADH (Abcam) el resto de los anticuerpos se obtuvieron de Cell Signaling Technology.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± E.E.M. Los análisis estadísticos se realizaron con las pruebas t de Student para datos independientes. Análisis entre los 3 grupos (control, de colon-26 y par alimentado) se ha realizado mediante la prueba de una vía ANOVA post hoc Turquía. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P & lt;. 0.05
Resultados
Impacto de C26 Carcinoma en epidydimal blanco tejido adiposo
El carcinoma de Colon26 es un modelo bien establecido de la caquexia por cáncer en ratones que exhiben una pérdida significativa de peso, pérdida de masa muscular, el agotamiento de la grasa y la disminución gradual de la ingesta de alimentos 14 días después de la implantación del tumor. De acuerdo con los informes anteriores, la masa de WAT del epidídimo se redujo considerablemente en comparación con los controles libres alimentados y alimentados por parejas (Figura 1A). Hemos examinado si esta dramática reducción en la masa de tejido adiposo fue evidente a nivel microscópico. Hematoxilina /Eosina mostró alteraciones morfológicas significativas. adipocitos blancos de los ratones de control muestran vacuolas lipídicas individuales de forma hexagonal que eran más pequeños en los animales alimentados por parejas y aparecieron más esférica en ratones caquéctico (Figura 1B-D). El análisis morfométrico mostró además una disminución significativa en el área de la sección y el perímetro de los adipocitos blancos de los ratones C26 caquécticos en comparación con
ad lib Opiniones y que no portaban tumores de ratones de control alimentado (Figura 1E-1F). La reducción en el peso WAT fue acompañado por un aumento de los ácidos grasos no esterificados en plasma (NEFA) en ratones caquéctico (Figura 1G) y una disminución de los niveles de triglicéridos en plasma (Figura 1H). Para examinar la contribución de las lipasas a la movilización de los triglicéridos del tejido adiposo, se determinó la actividad de movilización de lípidos de los explantes de WAT. La velocidad de liberación de ácidos grasos libres (FFA) fue 5 veces mayor en WAT de los ratones caquécticos C26 en comparación con los ratones de control que llevan no tumorales (Figura 1I) con un aumento correspondiente en la liberación de glicerol (Figura 1J). La adición del inhibidor-HSL específica (Hi 76 a 0079) sólo redujo marginalmente liberación de FFA que indica que ATGL es la lipasa predominante responsable de la lipólisis del tejido adiposo (Figura 1I). Para evaluar el impacto de la caquexia en la capacidad de hidrólisis de lípidos totales después de la estimulación hormonal, el tejido WAT fue tratado con forskolina. Un nuevo aumento de la liberación de AGL fue evidente tanto para los ratones de control y caquécticos C26, con los ratones caquécticos que alcanzan una velocidad máxima de producción de ácidos grasos libres de /hr * proteína de 250 nmol mg en comparación con 100 nmol /hr * mg en ratones de control (Fig. 1K) . la liberación de glicerol también mostró una tasa máxima más alta en comparación con los ratones de control C26 después de la estimulación de los explantes de WAT con forskolina (Figura 1 l) que indica una capacidad lipolítica más alto de explantes de WAT de los ratones C26 caquécticos.
pesos tejido adiposo (A) del epidídimo de animales caquécticos en día 14 después de la inoculación del tumor (
*** P & lt; 0,001,
¥¥¥ P & lt; 0,001 vs alimenta par-); (C-E) con hematoxilina y eosina y (B-F) cuantificación de tamaño de los adipocitos de ratones caquécticos y alimentados por parejas. (G) Los niveles circulantes de ácidos grasos no esterificados libre en el plasma de los animales caquécticos (* P & lt; 0,05; vs control); (H, I) ácidos grasos libres (FFA) y la liberación de glicerol a partir de explantes de WAT obtenidos a partir de ratones portadores de tumores de control y C26 en condiciones basales en presencia y en ausencia del inhibidor de la HSL Hola 76-0079; (J, K) de ácido graso libre (FFA) y la liberación de glicerol a partir de explantes de WAT bajo estimulada por la forskolina condiciones en presencia o en ausencia de Hi-76-0079. Para A, los valores se presentan como media ± s.e.m. durante 8-10 animales por grupo. Para B, C y D Se muestran imágenes representativas de H & amp; E imágenes tomadas de 4 animales por grupo. Para los valores de E y F se presentan como media ± s.e.m. como para 4 animales por grupo. Aproximadamente 250 adipocitos se contaron por dar animal en el total de 1000 adipocitos de cada grupo. valores de G y H se presentan como media ± s.e.m. para 4 animales por grupo. Para los valores de I-K se presentan como media ± s.e.m. para 5 animales por grupo.
La activación de IL-6 en la vía de señalización C26 caquexia
Las citoquinas como la IL-6 parecen ser factores clave del proceso de pérdida de masa en esta caquexia por cáncer modelo [12]. Para determinar si la señalización de citoquinas activo está presente en los adipocitos de ratones caquéctico se determinó la expresión de ARNm diurna de SOCS3, y la fosforilación de STAT3 (Figura 2). los niveles de transcripción de ARNm SOCS3 se incrementaron significativamente en todos los momentos en los ratones caquécticos. También se mejoró la fosforilación de la proteína STAT3 (Ser727) en la presencia del tumor C26. Estos datos demuestran activo de señalización aguas abajo del receptor de IL-6 en WAT de los ratones caquéctico que pueden influir en las rutas metabólicas de lípidos en ratones caquécticos.
expresión mRNA diurno de SOCS3 mRNA en tejido adiposo blanco de ratones de control (círculo blanco) y los ratones caquécticos (cuadrado negro) (
* P & lt; 0,05,
** P & lt; 0,01,
*** P & lt; 0,001 vs control). 6 am valores se duplican en el gráfico para ilustrar la ritmicidad diurna. los valores de expresión de ARNm son la media ± s.e.m. respecto a los controles de 4-6 animales por grupo. Western blot y análisis densitométrico de la proteína STAT3 y fosfo-STAT3 (Ser727), en el tejido adiposo blanco de caquécticos y control de los animales.
Efecto de cáncer caquexia en el patrón de expresión diurno de la lipogénesis Camino
Para examinar el impacto de la caquexia por cáncer en
de novo síntesis de ácidos grasos en el TAB se investigó el perfil de expresión de genes metabólicos diurna y factores de transcripción nucleares involucrados en la lipogénesis. La lipoproteína lipasa (LPL) es una enzima clave involucrada en la hidrólisis de TG de las lipoproteínas para liberar ácidos grasos para la absorción en las células. En los ratones de control de sus niveles de transcripción no exhibieron ritmo diurno, mientras que en los ratones caquécticos niveles de expresión se amortiguan de manera significativa en la mayoría de los puntos de tiempo (Figura 3). Junto con
Lpl
, la expresión de
Ap2
se redujo, mientras que
Cd36
no afectó a los ratones en el TAB de caquéctico que indica un cierto grado de represión en la captación intracelular o la manipulación de ácidos grasos ácidos (Figura S1). PPAR es el factor de transcripción nuclear predominante la regulación del metabolismo de lípidos en los adipocitos. En los ratones de control,
PPAR
y de destino asociado genes
Fas
y
DGAT2
alcanzó su punto máximo durante el ciclo de luz, mientras que en la ritmicidad animales caquécticos portadores de tumores se perdió y los niveles de mRNA eran marcadamente disminuido en la mayoría de los puntos de tiempo. Del mismo modo
SCD1
ha exhibido la expresión del ARNm reducida en ratones caquécticos. C /EBP es importante para la adipogénesis y la función de los adipocitos normal. En el control de ratones
C /EBP
no mostraron un patrón de expresión diurna mientras que en los ratones caquéctico los niveles de transcripción se redujeron significativamente a lo largo del día. Es interesante que las comparaciones directas en los niveles de expresión génica para
Fas
y
C /EBP
entre los ratones alimentados por parejas y ratones caquéctico indicó diferencias significativas a las 2 AM punto de tiempo que indica la síntesis de lípidos que pueden verse afectados principalmente durante la caquexia y no tanto durante la restricción calórica.
análisis de ARNm de
PPAR
,
C /EBP
,
Lpl
,
Fas
,
SCD1
,
DGAT2
, aislado de WAT de control (círculo blanco), y los ratones portadores de C26 (cuadrados negro); Los valores son la media ± s.e.m. presentan como porcentajes en relación con los controles de 4-5 animales por grupo (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001 C26 vs control). 6 am valores se duplican en cada gráfico para ilustrar un completo ciclo de 24 h.
inducida por PKA Camino lipolítica no se mejora en la caquexia del cáncer
La estimulación de la liberación de AGL de triglicéridos era piensa que es mediado principalmente a través de la proteína quinasa a (PKA), que fosforila directamente la lipasa sensible perilipina y la hormona (HSL) y también influye adiposo triglicéridos lipasa (ATGL), aunque de manera indirecta. Sin embargo, estudios recientes han identificado la fosforilación de AMPK mediada de ATGL y las interacciones con CGI-58 como fundamental para la actividad ATGL hidrolasa máxima [27]. Se evaluó si la lipólisis es mediada a través de la vía PKA durante el agotamiento de WAT en la caquexia por cáncer. Como se muestra en la figura 4A, se observó una ligera disminución de la PKA fosforila y los niveles totales de PKA a las 2 de la mañana, mientras que a las 2 pm no se observaron cambios aparentes entre el control y los animales caquécticos (Figura S2). los niveles de expresión de ARNm parecían reducirse, mientras que los niveles de proteína total y fosfo-HSL se mantuvieron sin cambios, ya sea en punto de tiempo durante la caquexia por cáncer. Es interesante a nivel de la expresión génica se observaron cambios significativos entre el control y los ratones alimentados por parejas (Figura S3), mientras que a nivel de proteínas, se observó el aumento de la fosforilación en ambos PKA y HSL a las 2 am (Figura S3). Perilipina es una proteína de recubrimiento lípido esencial para la formación de gotitas de grasa y es influenciado directamente por PKA. Investigamos si la caquexia por cáncer influyó en los niveles de ARNm y de proteína de perilipin y no encontró ritmo diurno aparente en los niveles de transcripción de perilipin en los ratones de control, mientras que la expresión se redujo en los animales caquécticos (Figura 4B). Sin embargo el análisis de Western mostró niveles de proteína perilipina aumentó en ambos puntos de tiempo (Figura 4C, la figura S2). ATGL es la lipasa crítico que inicia la primera etapa en la degradación de triglicéridos. No se observó ritmo circadiano en la expresión de este gen y no había ningún impacto en ATGL ARNm durante la caquexia por cáncer. Sin embargo, el análisis de Western indicó incremento de nivel de proteína ATGL para ambos puntos de tiempo en el TAB de C26 animales portadores de tumor (Figura 4, Figura S2). Similar a la discordancia aparente en proteínas perilipin y los niveles de ARNm, parece que ATGL está regulada principalmente a nivel post-transcripcional en la caquexia. Estos datos indican que durante la caquexia etapa tardía, la movilización de la grasa de WAT de los ratones C26 no es inducida por la PKA vía para estimular la lipólisis mediada por HSL, pero se asocia con aumento de la proteína ATGL.
(A) Análisis de ARNm
Hsl
la expresión génica y el análisis de transferencia Western de fosfo-PKA (Thr197), el total de la PKA, fosfo-HSL y HSL proteínas totales a las 2 am y las 2 de la tarde; (B) Análisis de ARNm de
ATGL
y
Perilipin
la expresión génica de WAT de control (círculo blanco), y los ratones portadores de tumores C26 (cuadrados negro); Los valores son la media ± s.e.m. presentan como porcentajes en relación con los controles de 4-5 animales por grupo (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001, C26 vs control). 6 am valores se duplican en cada gráfico para ilustrar un completo ciclo de 24 h;
Perturbado expresión diurna de la ruta de utilización de ácidos grasos en ratones caquécticos.
Una función importante de WAT (C) Western blot de las proteínas y ATGL Perilipin a las 2 pm y las 2 am. es el consumo de lípidos a través de la activación de la β-oxidación de ácidos grasos en la mitocondria y peroxisomas. Para entender el papel de WAT en la generación de ácidos grasos libres como fuente de combustible durante la caquexia por cáncer, se determinó la expresión diurna de factores de transcripción implicados en la regulación del catabolismo de ácidos grasos y de los genes diana correspondiente (Figura 5A). De acuerdo con los informes anteriores,
PPAR
exhibieron oscilación circadiana mientras que
PPARd
no mostraron ritmicidad en los ratones control. No hubo cambios significativos evidentes para cualquiera de
PPAR
o
PPARd
entre el control y los ratones caquécticos. Del mismo modo
Pgc1α
tenían un patrón diurno distintivo de expresión, pero no fue modificado en el TAB de los ratones caquécticos.
NRF1
, un regulador clave de genes metabólicos implicados en la respiración mitocondrial, no mostró oscilación circadiana, sin embargo, fue significativamente superior en determinados momentos durante el período de 24 horas. Tfam es un regulador maestro de la biogénesis mitocondrial. Sus niveles de transcripción no mostraron cambios significativos ritmicidad y no fueron evidentes durante la caquexia por cáncer. De manera similar a
Tfam
, la expresión de la carnitina palmitoil transferasa 1α (
Cpt1α): perfil requerido para la absorción de los ácidos grasos de cadena larga a las mitocondrias se mantuvo en los animales portadores de tumores C26. El objetivo de genes PPAR, enzima bifuncional peroxisomal (
Pbe
) que participan en ácidos grasos β-oxidación peroxisomal, exhibe un pico diurna a las 10 horas, en el ciclo de oscuridad en ratones sanos. WAT de los ratones caquéctico mostró una mayor abundancia de
Pbe
ARNm en la mayoría de las veces, así como un significativo avance de fase de 12 horas, alcanzando un máximo a las 10 horas (Figura 6A). Además se observaron cambios significativos entre los ratones caquécticos y ratones alimentados por parejas a 14:00 (figura S4). Otra prueba de la β-oxidación peroxisomal mejorado es el más alto nivel de proteína de la PBE en los animales caquécticos tanto a las 2 am y las 2 pm (Figura 5B, figura S4). Sin embargo, parece que otros componentes de la utilización de ácidos grasos tales como AOX, HADHA y HADHB son inalterada (Figura S5).
(A) análisis de ARNm de
PPAR, Pgc1α, PPAR
,
NRF1, Tfam, Cpt1α
y
Pbe En venta WAT de control (círculo blanco) y C26 ratones llevando los tumores (cuadrados negro); Los valores son la media ± s.e.m. presentan como porcentajes en relación con los controles de 4-5 animales por grupo (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; C26 vs control). 6 am valores se duplican en cada gráfico para ilustrar un completo ciclo de 24 h; (B) Análisis de transferencia Western de proteínas PBE a las 2 pm y las 2 am los puntos de tiempo.
(A) Análisis de ARNm de
Ampkα1, Ampkα2
y
Acc
desde WAT de control (círculo blanco), y los ratones (cuadrado negro) C26-cojinete; (B) Análisis de transferencia Western de fosfo-AMPK (Thr192) y AMPK totales a las 2 pm y las 2 am; El análisis por inmunotransferencia de fosfo-ACC y ACC total de muestras WAT 2 pm. (C) Análisis de ARNm de
mTor
y
4EBP1;
de WAT de control (círculo blanco), y los ratones (cuadrado negro) C26-cojinete; (D) Western blot de fosfo-mTOR (Ser2448) mTOR total fosfo-4EBP1 (Ser65), fosfo-4EBP1 (Thr37 /46) y el total de 4EBP1 a las 2 pm y las 2 am. Los valores son la media ± s.e.m. presentan como porcentajes en relación con los controles de 4-5 animales por grupo (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; C26 vs control). 6 am valores se duplican en cada gráfico para ilustrar un completo ciclo de 24 h.
La activación de AMPK Camino en C26-cojinete Animales
AMP-activated proteína quinasa (AMPK) es un importante regulador de la homeostasis de la energía, en respuesta a un aumento de AMP: relaciones de ATP mediante la estimulación de la oxidación de ácidos grasos y el aumento de la captación de glucosa [32]. Una de las funciones primarias de la AMPK es la fosforilación y la consiguiente inhibición de la acetil CoA carboxilasa (ACC), la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de ácidos grasos.