Extracto
El creciente interés en la cuantificación de la base molecular de la activación de la proteína quinasa y la regulación alostérica por mutaciones del cáncer ha alimentado estudios computacionales de señalización alostérica en proteínas quinasas. En el presente estudio, hemos combinado simulaciones por ordenador y el análisis del paisaje de la energía de las proteínas quinasas para caracterizar la interacción entre las mutaciones oncogénicas y sitios localmente frustrados como catalizadores importantes de la activación de la quinasa allostetric. Mientras núcleo quinasa estructuralmente rígido constituye un cubo mínimamente frustrado del dominio catalítico, frustrado localmente racimos de residuos, cuyas redes de interacción no están optimizados con energía, son propensos a la modulación dinámica y podría permitir transiciones conformacionales alostéricos. Los resultados de este estudio han demostrado que el efecto paisaje energía de mutaciones oncogénicas puede ser alostéricos que suscitan cambios globales en la distribución espacial de residuos altamente frustrados. Hemos encontrado que la señalización alostérica mutación inducida puede implicar un acoplamiento dinámico entre estructuralmente rígido (mínimamente frustrada) y plástico grupos (localmente frustrados) de residuos. El estudio presentado ha demostrado que las mutaciones de cáncer de activación pueden afectar el equilibrio termodinámico entre los estados de la quinasa mediante la alteración alostérica de la distribución de los sitios localmente frustrados y el aumento de la frustración local en la forma inactiva, mientras que la eliminación de sitios localmente frustrados y la restauración de la rigidez estructural de la forma activa. El análisis Landsape la energía de las proteínas quinasas y la función propuesta de los sitios localmente frustrados en los mecanismos de activación pueden tener implicaciones útiles para el cribado basado en la bioinformática y la detección de sitios funcionales críticos para la regulación alostérica en sistemas biomoleculares complejos
Visto:. Dixit a, Verkhivker GM (2011) El análisis del paisaje de Energía de cáncer Las mutaciones en quinasas de proteínas. PLoS ONE 6 (10): e26071. doi: 10.1371 /journal.pone.0026071
Editor: Jie Zheng, Universidad de Akron, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de junio de 2011; Aceptado: 19 de septiembre de 2011; Publicado: 6 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Dixit, Verkhivker. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por la financiación de la Universidad de Kansas. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
rápida y eficiente la comunicación de los cambios conformacionales de largo alcance en las proteínas juega un papel vital en la regulación alostérica de los sistemas biológicos [1], [2]. Recientes revisiones seminales de allostery proteínas han hecho hincapié en la función central de cooperatividad y la noción de que la catálisis y allostery pueden surgir a través de las vías de comunicación comunes [3], [4]. Modelado de las transiciones alostéricas en las moléculas biológicas se ha avanzado significativamente en el desarrollo de modelos de redes elásticas y enfoques normales de análisis de modo [5] - [22]. modelos de redes elásticas de la dinámica de proteínas y la teoría de la propagación de señales han permitido un análisis cuantitativo de largo alcance interacciones de proteínas alostéricas [13] - [16]. análisis basado en la secuencia evolutiva [23], [24] y los enfoques basados en la estructura [19], [20], [25] - [27] han demostrado que las vías alostéricos en proteínas pueden formarse a través de interacciones de evolutiva conservada y escasamente conectados racimos de residuos que están acopladas con energía para mediar en la comunicación de largo alcance. Un análisis exhaustivo de los mecanismos alostéricos ha dado lugar a una visión unificada de la regulación alostérica que implica la existencia de estados preexistentes conformacionales y múltiples vías de comunicación en el paisaje conformacional [28] - [32]. teorías del paisaje de energía y modelos simplificados de energía han proporcionado un marco teórico sólido para dilucidar los aspectos fundamentales de la estructura de la proteína, la dinámica y la regulación alostérica [33] - [43]. De acuerdo con la teoría del paisaje energía moderna, secuencias aleatorias tienen paisajes agrestes con muchos mínimos locales debido a las interacciones conflictivas graves (un fenómeno denominado "frustración") y, como resultado, la prevalencia de conformaciones similares estructuralmente todavía con energía alternativas. Los modelos de paisaje de energía también han sugerido que las secuencias similares a proteínas pueden haber evolucionado para eliminar parcialmente frustrados interacciones entre los aminoácidos y han suavizado ( "embudo") como paisajes para asegurar rápido plegado a sus estructuras nativas termodinámicamente estables. Esto se conoce como el "principio de frustración mínima" [44], [45]. La canalizado-como la naturaleza de los paisajes de energía para las proteínas naturales implica que las conformaciones que son estructuralmente similares al estado nativo también son bajos en energía, y las interacciones estado nativo se sienten frustrados mínimamente [33] - [45]. Una vista generalizada de regulación alostérica basado en la teoría del paisaje de energía (a menudo denominado como un "modelo de selección conformacional") sugiere que una proteína puede funcionar en un equilibrio dinámico de estructuralmente diferentes estados conformacionales, por lo que el efecto de la unión o mutación se puede propagar a través de largas distancias por desplazamiento cooperativamente el equilibrio hacia una conformación funcionalmente relevante [46] - [52]. La vista "viejo" (inducida mecanismo de ajuste) y la vista "nueva" (mecanismo de selección conformacional) de allostery proteína de manifiesto que no se excluyen entre sí, sino más bien complementarias en la racionalización de los mecanismos alostéricos a nivel molecular [53] - [56]. enfoques basados en la física de simulación han proporcionado una evidencia convincente de acoplamiento entre los movimientos colectivos y los cambios estructurales locales como un importante principio subyacente de la comunicación alostérico en biomoléculas [53] - [60]. enfoques basados en la termodinámica han vinculado más perturbaciones estructurales globales y locales con los cambios de energía libre de acoplamiento alostérico en mecanismos de conmutación conformacional [61] - [64]. Por otra parte, los modelos de paisaje de la energía han sugerido que a largo plazo la cooperatividad de las interacciones proteína-proteína durante las transiciones alostéricas puede favorecer una combinación de la población en desplazamiento y los mecanismos de ajuste inducido, mientras que a corto rango, la unión alostérica de proteínas con inhibidores de frecuencia podría proceder a través del mecanismo de desplazamiento de la población [65] - [72]
Ferreiro y Wolynes [69] recientemente han avanzado la energía teoría del paisaje mediante la combinación de modelos biofísicos y bioinformática estructural análisis de las interacciones proteína locales que son fundamentales para el plegado. , la regulación y la unión alostérica. De acuerdo con este modelo, paisajes mínimamente frustrados de las redes de proteínas pueden haber evolucionado para adquirir la capacidad para la regulación a través de cambios alostéricos de cooperación. El método propuesto ha cuantificado el grado de frustración locales espacial en proteínas usando una versión local de la formulación criterio brecha global del principio mínimo frustración [33] - [45]. Este modelo introduce una frustración local de métrica denominado "índice de frustración configuracional" como una medida de la estabilización local para un par nativo individuo con respecto a un conjunto de señuelos estructurales generada por perturbar tanto las identidades y localización de los aminoácidos que interactúan [69], [ ,,,0],70]. De acuerdo con este criterio, si la energía de interacción de un par nativa de los residuos es suficientemente estabilización en comparación con el conjunto de señuelos estructurales, este par de residuos se designa como "mínimamente frustrado '', de lo contrario las interacciones pueden ser clasificadas como" neutral " o "frustrado a nivel local". Vale la pena señalar que el principio de la frustración mínimo no requiere una eliminación completa de las estructuras alternativas localmente estables. Un cierto grado de frustración local está siempre presente en una estructura de la proteína de otro modo en gran medida unfrustrated y puede haber surgido de requerimientos evolutivos de adaptación dinámica de las proteínas para funciones específicas [43].
El análisis de proteínas regiones localmente frustrados con un no conjunto -redundant de 314 dominios de la proteína monomérica y un conjunto curada de complejos diméricos no redundantes ha demostrado que los sitios localmente frustrados corresponden a las regiones implicadas en la unión con otras macromoléculas y ligandos y, a menudo podrían colocar con los grupos funcionales propensos a grandes cambios estructurales [69 ], [70]. Wolynes y colaboradores han estudiado recientemente una base de datos curada de proteínas alostéricas con estructuras cristalinas inactivo y activo conocido y han demostrado que los dominios de proteínas alostéricas están conectados por una red de interacciones mínimamente frustrados, mientras que los residuos altamente frustrados podrían ser preferentemente agrupados cerca de la superficie de la proteína [71 ], [72]. De acuerdo con este estudio, las regiones mínimamente frustrados en las proteínas alostéricas dominios constituyen casi el 40% de los contactos en total, con aproximadamente el 10% de las interacciones totales considerados como "altamente frustrados", y el resto de las interacciones atribuido a la categoría de "neutral" .
proteína quinasas son interruptores con un dominio catalítico conservado que fosforilan sustratos de proteína y juegan un papel crítico en la señalización de las vías de señalización celular [73] - [82]. genes de la proteína quinasa constituyen ~ 2% de todos los genes en el genoma humano y de esta familia de proteínas se compone de más de 500 miembros diversos. Las estructuras cristalinas de las proteínas quinasas humanos incluyen 167 dominios únicos humanos de la proteína quinasa y 170 quinasas, considerando orthologues estrechamente relacionados (http://www.sgc.ox.ac.uk/research/kinases/). Estudios estructurales de estructuras de dominio catalítico de la proteína quinasa y complejos de proteínas reguladoras han revelado escenarios distintos por los cuales las quinasas puede controlar un equilibrio dinámico entre los estados quinasa inactivos activos y altamente específicos estructuralmente similares - una característica estructural del dominio quinasa crítica para su función normal [83] - [89]. regulación alostérica puede lograrse a través de diferentes mecanismos que incluyen la estabilización de la conformación inactiva específica inducida por los inhibidores de ABL [90] - [95], BRAF [96], KIT [97], PDGFR, P38 [98], quinasas PI3K [99] y la unión al bolsillo de unión alostérico miristoılo-ABL en [100] - [103]. activación de la proteína quinasa también puede ser regulado a través de la formación de estructuralmente diversos complejos reguladores más notablemente ejemplificados por ABL [104], [105] y EGFR quinasas [106] - [109], sin embargo, un mecanismo estructural unificador marco de los Acuerdos de la tirosina quinasa asimétricos en regulatoria complejos podrían ser la base del mecanismo de activación de la totalidad de la familia de proteínas de EGF [110] - [113]. Un progreso constante en la comprensión de los mecanismos de la proteína quinasa ha generado un considerable esfuerzo para descubrir e inhibidores competitivos con ATP y alostéricos selectivos de diseño de orientación formas específicas de cáncer, cáncer de mutantes quinasa y vías específicas asociadas [114] - [116].
la activación anormal de la regulación de las proteínas quinasas es una fuente dominante de mutaciones somáticas asociadas al tumor. investigaciones estructurales y de mutagénesis de ABL [93] - [95] y EGFR quinasas [117] - [119] han puesto de manifiesto la divergencia estructural de las quinasas en respuesta a la activación de mutaciones. Los estudios de la bioinformática en todo el kinome han contribuido a la identificación de las conservadas motivos de secuencia que albergan mutaciones asociadas a la enfermedad y cáncer, lo que sugiere que un número significativo de mutaciones del cáncer oncogénicas podría formar puntos calientes de mutación estructuralmente conservados dentro de la quinasa núcleo catalítico [120] - [123]. estudios de simulación por ordenador han investigado los mecanismos moleculares de la activación de la proteína quinasa c-Src [124] - [127], la adenilato quinasa [128], ABL [129], CDK5 [130], KIT [131], RET, MET [132] y EGFR quinasa [133] - [135]. estudios de simulación multiescala de transiciones conformacionales en las formas normales y oncogénicas de ABL y EGFR quinasas han indicado que el impacto de los mutantes oncogénicos puede extenderse más allá del lugar inmediato de la mutación que conduce a cambios alostéricos globales [134]. Más recientemente, el modelado computacional de la regulación alostérica ha revelado la organización de los principios de la activación inducida por mutación en el ABL y EGFR quinasas, que puede ser determinado por un acoplamiento dinámico entre estructuralmente rígida αF-hélice y la conformación de adaptación αI-hélice y αC-hélices [136] . Estos elementos estructurales forman una red dinámica de interactuar de manera eficiente las regiones funcionales que pueden controlar universalmente en las comunicaciones entre a largo plazo y la activación alostérica de las proteínas quinasas. Los estudios de paisaje energía previamente han sugerido que la frustración localizada puede estar conectado con los cambios conformacionales alostéricos en proteínas [69] - [72].
conjunto, los estudios computacionales han sugerido que los mecanismos moleculares de la regulación alostérica de quinasas de proteínas se pueden se describe el uso de modelos de modulación inducida por mutación del paisaje conformacional y los principios de selección de conformación de los estados termodinámicamente pertinentes. En este trabajo, se emplearon análisis de la bioinformática estructural basada en kinome y modelos biofísicos de las estructuras de la proteína quinasa para caracterizar y cuantificar la interacción entre las mutaciones de la cinasa oncogénico y sitios localmente frustrados como catalizadores potenciales y los mediadores de la activación de la quinasa. Los resultados de este estudio sugieren que el efecto panorama energético de mutaciones oncogénicas puede ser alostérico en la naturaleza, provocando cambios globales en la distribución espacial de los residuos altamente frustrados. Se demuestra que las mutaciones de cáncer podrían actuar perturbando simultáneamente la red de interacciones mínimamente frustrados en el estado quinasa inactiva, mientras que la reducción de la frustración local y la restauración de las interacciones alostéricas en forma quinasa activa. Por lo tanto, los sitios localmente frustrados en el núcleo catalítico pueden servir un importante papel funcional al permitir transiciones conformacionales inducidas a la mutación hacia la conformación quinasa constitutivamente activa.
Resultados
Los paisajes de energía y frustración local en proteínas quinasas
En el presente estudio, se combina simulaciones de dinámica molecular (MD) de las proteínas quinasas con el análisis del paisaje de energía para caracterizar el papel de la frustración local como un factor importante asociado con la activación de la quinasa allostetric. Desde la perspectiva de paisaje de energía, las características mecánicas de las transiciones de activación deben ser determinados por la topología estructural del dominio quinasa veces y por lo tanto podría capturar aspectos sobresalientes del mecanismo de activación. Para investigar el papel de la frustración local en las transiciones conformacionales entre estructuralmente diferentes estados funcionales, encuestamos a los perfiles de frustración locales en las estructuras de la proteína quinasa y caracterizaron la red de interacciones mínimamente frustrados responsables de la estabilidad estructural del núcleo catalítico de quinasa. También localizamos y grupos de sitios localmente frustrados donde podría violarse el principio de mínima frustración caracterizamos. El cambio en el índice de frustración configuracional sobre mutación puede proporcionar una medida cuantitativa de una tendencia a provocar un cambio conformacional en la proteína. El efecto de las mutaciones cancerosas quinasa en los perfiles de frustración locales nos permitió cuantificar cómo la redistribución inducida por mutación de los residuos a nivel local frustrados puede promover transiciones alostéricas entre estados funcionales estructuralmente distintas. El índice de frustración configuración podría medir la estabilidad relativa de un contacto nativo particular, en relación con el conjunto de todos los contactos posibles en esa ubicación, lo que permite clasificar los contactos nativas individuales en la estructura de proteína de acuerdo con su nivel de frustración. Un examen de todo el kinome del índice de frustración configuracional calculado para un gran número de estructuras cristalinas de la proteína quinasa (Tabla S1 en File S1) reveló que los valores típicos pueden oscilar entre -4 a +4. La distribución global basada en residuos de un índice de frustración para las quinasas de tipo salvaje (WT) fue sesgada hacia los residuos mínimamente frustrados con los valores positivos del índice de frustración (Figura 1A). La distribución también muestra un pico más pequeño superficial correspondiente a los residuos localmente frustrados con el índice de frustración en el intervalo de -0,6 a -0,7 unidades. El impacto de las mutaciones resultó en un cambio sutil pero notable en la distribución local de frustración en el núcleo catalítico, revelando un segundo pico igualmente importante alrededor de -1,0 valor. Por lo tanto, la distribución general se dividió casi por igual entre los residuos mínimamente frustrados y frustrados, dejando menos residuos en el estado neutro (Figura 1B).
(A) quinasas de tipo salvaje y (B) quinasas mutantes.
enfoca entonces en el análisis realizado por la frustración local de un subconjunto de los genes de la proteína quinasa (ABL, EGFR, BTK, KIT, BRAF, MET, y RET) que dan cuenta de la gran mayoría de las mutaciones oncogénicas altamente en el dominio catalítico (Tabla S2 en File S1). Estos genes de la proteína quinasa fueron elegidos para un análisis más detallado debido a la gran cantidad de información estructural y funcional que proporciona datos experimentales complementarios para la validación de nuestros modelos. Más importante, sin embargo, un repertorio diverso de activación y de drogas mutaciones resistentes en estas quinasas representan genes culpables cáncer críticas que con frecuencia podrían contribuir a un estado de dependencia oncogén en una variedad de tipos de cáncer. La distribución de frustración local en estos genes de quinasa, tal como se mide por el índice de frustración configuracional, reveló un patrón distinto donde los picos fueron notablemente desplazado hacia los residuos más frustrado, tanto para el WT y quinasas mutantes (Figura 2). El porcentaje de las interacciones mínimamente frustrados en el núcleo catalítico representaba más del 40% de los contactos en total, con alrededor de 15 a 20% de las interacciones considerarse como frustrado y el resto neutral. Este análisis general estuvo de acuerdo con la distribución informado de las regiones frustrados y partición de mínimamente y residuos altamente frustrados en las proteínas [69], [70]. Sin embargo, la fracción media de residuos a nivel local frustrados fue más alta en proteínas quinasas que el reportado para las pequeñas proteínas monoméricas. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que los paisajes conformacionales de los oncogenes quinasa pueden caracterizarse por un aumento del nivel de frustración local y la movilidad de proteínas.
(A) quinasas de tipo salvaje y (B) quinasas mutantes. Un conjunto de oncogenes quinasa empleadas incluye ABL, EGFR, BTK, KIT, MET, BRAF y RET quinasas. El análisis incluyó mutantes de estos genes de quinasa de alto potencial oncogénico de acuerdo a los perfiles de frecuencia en las muestras mutacionales (& gt; 5). Obtenido desde el repositorio COSMIC [153]
Sobre la base de este análisis, se propone que la distribución espacial de la frustración local en proteínas quinasas puede ser regulada y cambia fácilmente por mutaciones oncogénicas. De acuerdo con nuestra conjetura, la activación de mutaciones de la cinasa podría amplificar la frustración local en el estado inactivo, mientras que la eliminación (o en parte la eliminación) sitios localmente frustrados en el estado activo. Como resultado, la redistribución mutación inducida de frustración local en las estructuras de la proteína quinasa puede contribuir a los mecanismos moleculares que controlan la actividad de la quinasa mediante la alteración del equilibrio dinámico entre las formas quinasa funcionales. Para comprobar esta hipótesis, se analizaron los cambios en los perfiles de frustración locales para un conjunto representativo de ABL altamente oncogénico (Figura 3) y mutantes de quinasa del EGFR (Figura 4) en ambos estados inactivos y activos. Hemos observado que las mutaciones altamente oncogénicas de hecho pueden causar un aumento en la frustración local de los residuos mutados en el estado autoinhibitory inactiva de ABL (PDB ID 1IEP) [90] y EGFR (PDB ID 1XKK) [117] (Figuras 3, 4). Por lo tanto, mutaciones de la cinasa con un alto potencial oncogénico pueden desestabilizar la forma autoinhibited quinasa. Es importante destacar que, mutaciones oncogénicas pueden aliviar en parte la frustración local en el estado quinasa activa (figuras 3, 4). Una red más extensa de las interacciones mínimamente frustrado rigidiza la forma activa del dominio catalítico de ABL (AP ID 1m52) [91], [92] y EGFR (AP ID 2J6M) [118]. Aunque las estructuras de cristal empleadas en nuestro estudio (Tabla S1 en el archivo S1) se resolvieron en su mayoría en forma no unida, había algunas estructuras en el conjunto estudiado (particularmente quinasas ABL y EGFR) que fueron cristalizados originalmente en complejos con ATP o inhibidores de molécula pequeña . Desde la unión de ATP potencialmente podría aumentar la rigidez estructural del dominio catalítico, el análisis frustración local que incluye las estructuras con un ATP eliminado pueden producir cambios artificiales en el índice de frustración para los residuos de sitio de unión. Se evaluó la distribución estadística general del índice frustración configuracionalmente usando las estructuras de cristal con las moléculas atadas. Se encontró que el efecto a ser bastante insignificante y la distribución resultante era prácticamente indistinguible del que se muestra en la Figura 1. En efecto, una fracción significativa de los residuos de la proteína quinasa involucrados en las interacciones del sitio de unión pertenece a la región bisagra estructuralmente rígido que es una mínimamente frustrado elemento del núcleo catalítico y, como tal sólido a las perturbaciones de menor importancia de las interacciones. Sin embargo, hemos encontrado algunas pequeñas variaciones interesantes en los perfiles de frustración locales de ABL (Figura S1) y quinasas de EGFR (Figura S2), que se observaron en busca de mutaciones oncogénicas en la P-bucle rico en glicina (ABL-G250E, ABL-Q252H, ABL-E255K, G719S-EGFR, EGFR-G719A, EGFR-G719C). Se sabe que la P-loop en ABL quinasa puede ser estabilizado en la estructura inactiva Imatinib de ruedas, lo que puede explicar el aumento de la frustración local tras mutaciones P-bucle en el estado inactivo (Figuras S1, S2). Curiosamente, se sabe que estas mutaciones puntuales a poner en peligro la unión de imatinib (Gleevec) para ABL desplazando el equilibrio termodinámico hacia la forma activa incompatible con el inhibidor de unión a [114] - [116]. Nuestros datos sugieren que la mutación inducida por la frustración local en el estado inactivo inhibidor de quinasa unida puede contribuir en parte a iniciar un cambio de la población entre las formas funcionales. También se analizó la distribución y partición estructural de las regiones mínimamente frustrados y localmente frustrados en el ABL quinasa (Figura S3). Una densa red de residuos mínimamente frustrados se encontró en el núcleo estructuralmente rígida del dominio catalítico (conectados por líneas verdes). Esta web mínimamente frustrado fue formado por conservado estructuralmente αF-hélice-hélice y αE. En contraste, los racimos de residuos localmente frustrados (conectados por líneas rojas) montados en la periferia de proteínas, incluyendo el αC-hélice, bucle de activación, la P + 1 bucle en el lóbulo C-terminal. Como las interacciones autoinhibiting liberados en forma activa, las proteínas quinasas podrían ser más flexible con un considerable grado de frustración locales residual. Esto se reflejó en el aumento de la presencia de residuos a nivel local frustrados conectados por líneas rojas en la αC-hélice, y el lóbulo C-terminal de la ABL activa (Figura S3 B).
Los valores del índice de frustración son basados en residuos se muestra para un conjunto de mutantes oncogénicos quinasa ABL en la inactiva (a) y formas activas (B). Los valores del índice de frustración se muestran en las barras amarillas rellenas para la forma quinasa de tipo salvaje y en barras de color rojo lleno de las formas mutantes. El análisis se realizó en el formulario independiente de las estructuras cristalinas de ABL en la forma inactiva (AP ID 1IEP) [90] y de forma activa (AP ID 1m52) [91], [92].
los valores del índice de frustración a base de residuos se muestran para un conjunto de mutantes de EGFR quinasa oncogénica en la inactiva (a) y formas activas (B). Los valores del índice de frustración se muestran en las barras amarillas rellenas para la forma quinasa de tipo salvaje y en barras de color rojo lleno de las formas mutantes. El análisis se realizó en el formulario independiente de las estructuras cristalinas de EGFR en la forma inactiva (AP ID 1XKK) [117] y de forma activa (AP ID 2J6M) [118].
La frustración y local la flexibilidad de proteínas
también investigó la relación entre la frustración local y la flexibilidad de las estructuras de proteínas quinasas. En nuestros estudios anteriores, hemos caracterizado los paisajes conformacionales de ABL, EGFR, RET y quinasas MET, así como diversos mutantes cáncer utilizando simulaciones MD de la quinasa Apo y complejos con ATP y los inhibidores de moléculas pequeñas [132], [134], [ ,,,0],136]. A continuación, se compararon los resultados del análisis de la frustración local con los perfiles quinasa de flexibilidad, que se infiere a partir de simulaciones MD y evaluada con la raíz media de las fluctuaciones cuadrados (FMR) de los residuos del dominio catalítico. En particular, los estudios MD de quinasas ABL y EGFR en los estados normales y oncogénicos muestran una alta flexibilidad local en la parte inferior del bucle de activación [134], [136]. Del mismo modo, el haz de alfa-hélices en el C-terminal, lo que representa la agrupación densa de mínimamente frustrados residuos (Figuras S4, S5), también demostró la más pequeña variación en los valores rmsf - una característica de núcleo de proteína estructuralmente rígido [134] . Los perfiles de frustración locales también coincidió muy bien con los factores B de los residuos de la proteína quinasa. Un ejemplo de tales análisis comparativo detallado para el EGFR-WT en forma activa (Figura S5). Se encontró una correlación robusta entre el índice de frustración local basada en residuos y los valores del factor B (Figura S5 D). También se observó que los residuos de EGFR altamente frustrados correspondían a las regiones conformacionalmente móviles con los valores de B-factor más altas. Para ilustrar mejor estos hallazgos, se realizó un mapeo estructural de los factores B promedio en un conjunto de estructuras inactivas (Figura S5 A) y activas (Figura S5 B) de ABL, EGFR, BTK, KIT, BRAF, MET, y quinasas RET . Además, a nivel local residuos frustrados también fueron asignadas en el núcleo catalítico. Los sitios localmente frustrados correspondían a regiones de la proteína con el aumento de la movilidad térmica y se superponen con los residuos de la proteína de B-factores más altos.
El análisis de la flexibilidad de la proteína quinasa ha demostrado también que los cambios conformacionales en regiones funcionalmente importantes quinasa puede alostéricamente acoplado y altamente correlacionados. Más específicamente, encontramos evidencia de movimientos de proteínas altamente correlacionados y acoplamiento alostérico de la αC-hélice y el bucle de activación con todas las demás regiones quinasa (Tabla S3 S1 en el archivo). Curiosamente, el αC-hélice y el bucle de activación representados dos regiones de la proteína quinasa más altamente acoplados. Otros segmentos altamente correlacionados del dominio catalítico incluyen (a) la región bisagra y el bucle catalítico, y (b) el bucle P-bucle y la activación. Estos hallazgos consistentes con nuestra reciente análisis de los movimientos colectivos en ABL y EGFR complejos reguladores que se manifestaron en la "respiración" movimientos de cuerpo rígido del núcleo catalítico junto con las fluctuaciones de la P-loop, bucle de activación, αC-hélice y el ag-hélice de la C-terminal [136]. Numerosos estudios de biología estructural también han indicado una participación central del bucle-hélice αC y la activación de acoplamiento alostérico que controlan la regulación de la actividad de la proteína quinasa [110] - [113].
alostérica Efecto de mutaciones en Oncogénicos frustración local
Hemos investigado si la distribución espacial de la frustración local puede presentar puntos de iniciación de los cambios conformacionales globales y si el efecto de mutaciones oncogénicas en la frustración local sería local o alostérico. Si el efecto de las mutaciones oncogénicas era local, causaría sólo perturbaciones locales y el resultado en los valores negativos del índice de frustración para los residuos en la proximidad inmediata del sitio de mutación. Sin embargo, si el efecto de mutaciones oncogénicas era global, la distribución espacial de residuos altamente frustrados puede ser alostéricamente afectada y resulta en cambios notables en el mando a distancia de las regiones del sitio de mutación. Una comparación de la cartografía de los residuos a nivel local frustrado en el mutante ABL-WT y ABL-T315I reveló cambios sutiles todavía relevantes, donde la mayor parte de los residuos efectuadas fueron distantes del sitio de mutación (Figura 5). Se observó que la mutación portero de la forma quinasa inactiva puede perturbar alostéricamente rigidez estructural del núcleo catalítico y aumentar la frustración local de la αF-hélice, αE-hélice y regiones αC-hélice. estudio Nuestros hallazgos corroborados con una espectrometría de masas de cambio de hidrógeno (HX MS) de ABL quinasa [100], lo que indica que el efecto de la mutación ABL-T315I podría resultar no sólo en perturbaciones conformacionales locales cerca del αC-hélice, pero también cambiar alostéricamente proteínas flexibilidad en la distante de regiones de la proteína de mutación. Los cambios en la frustración locales inducida por ABL-T315I mutación en la quinasa inactiva podrían ser ilustrados en los ejemplos presentados en las Figuras S6, S7. Mientras que las parcelas frustración de ABL-WT y ABL-T315I fueron generalmente similares, hubo algunos cambios en los grupos de líneas rojas que conectan Asp-381 de la DFG motivo a Glu-286 que hace un enlace de hidrógeno importante con Lys-271 (Figura S6) . Otro cambio podría utilizar el β-hoja anti-paralelo de la parte inferior del bucle de activación (Figura S7). En esta región algunos de los residuos se convierten en altamente frustrado a mutación como es evidente por las líneas rojas residuos de conexión Tyr-393, Ala-395 y Pro-402.
La distribución espacial de la frustración local en las formas inactivas de ABL -WT (A) y ABL-T315I (B). El esquema de color de deslizamiento de frustración locales oscila entre mínimamente frustrado (en azul) hasta altamente frustrados (se muestra en rojo). Las regiones funcionales clave de la proteína quinasa junto con la gama respectiva de los residuos de proteínas se conocen por las flechas. mapeo estructural de frustración local en el núcleo catalítico de quinasa ABL se muestra para la estructura inactiva ABL-WT (PDB ID 1IEP) [90]. El efecto de T315I en la estructura de ABL inactiva se evaluó a través de modelado estructural se detalla en la sección de Materiales y Métodos. El programa PyMoI se utiliza para la visualización de las estructuras de la proteína quinasa y la cartografía de la frustración local (el sistema de gráficos PyMOL Molecular, Versión 1.2r3pre, Schrödinger, y LLC).
Es importante destacar que, parcial despliegue de la lucha contra la β-hoja paralelo en el extremo inferior del bucle de activación se determinó previamente como un requisito previo para la estabilización de la estructura intermedia Src-like y una característica común mecanicista de las vías de activación de EGFR ABL y [134]. En la conformación de Src-como, αC-hélice se gira y se mueve fuera del sitio activo (αC-hélice-Glu-fuera de posición), el motivo DFG volteado en la posición intermedia DFG-in, el β-hoja de antiparalelo