Extracto
El cáncer gástrico crece bajo un ambiente hipóxico. HIF-1α se sabe que juega un papel importante en el control de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la mitocondria en condiciones de hipoxia. Hemos establecido con anterioridad células HIF-1a desmontables (KD) y células de control (SC) en la línea celular de cáncer gástrico 58As9. En este estudio, se reveló que las células KD, pero no las células SC, la apoptosis inducida en condiciones de hipoxia (1% de O
2) debido a la producción excesiva de ROS. Un análisis cuantitativo de RT-PCR demostró que las expresiones de diez genes, que están implicados en los mecanismos de control de ROS (incluyendo el efecto Warburg, mitofagia, cadena de transporte de electrones [ETC] modificación y basura ROS), estaban regulados por HIF-1α. Por otra parte, la promoción de la captación de glucosa por la glucosa, más el tratamiento de insulina (GI) aumentó el efecto de apoptosis, que fue acompañado por una mayor producción de ROS en células hipóxicas KD. Un análisis de transferencia Western mostró que la expresión membranosa de GLUT1 en KD células se elevó por la glucosa y /o tratamientos de insulina, lo que indica que la captación de glucosa GI inducida está mediada por el aumento de la translocación de GLUT1 en la membrana celular. Por último, se evaluó el efecto anti-tumor de caída HIF-1α (KD) más GI utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor, donde existe naturalmente un ambiente hipóxico. Como resultado, el tratamiento GI inhibe fuertemente el crecimiento de los tumores KD por el que la apoptosis celular se altamente inducida en comparación con el tratamiento control. En contraste, el crecimiento de los tumores que expresan SC HIF-1α no se vio afectada por el tratamiento GI. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que la inhibición de HIF-1α más GI pueden ser una terapia ideal, ya que la apoptosis debido a la destrucción de ROS homeostasis es inducida específicamente en el cáncer gástrico que crece en un entorno hipóxico, pero no en el tejido normal bajo la condiciones aeróbicas
Visto:. Tanaka T, Y Kitajima, Miyake S, K Yanagihara, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) La apoptótica efecto de la inhibición de HIF-1α En combinación con glucosa más insulina en el tratamiento del cáncer gástrico en condiciones hipóxicas condiciones. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10.1371 /journal.pone.0137257
Editor: Ester Hammond, Universidad de Oxford, Reino Unido
Recibido: 30 de abril de 2015; Aceptado: August 13, 2015; Publicado: 4 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Tanaka et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El ambiente hipóxico es sustancial en tumores sólidos en los que acelera sus comportamientos malignos [1-4]. Al igual que otros tumores sólidos, carcinoma gástrico es conocido por afectar zonas amplias de la hipoxia dentro del tumor [5-7]. condiciones de hipoxia inducen varios eventos biológicos tales como la angiogénesis, la invasión local, diseminación metastásica, radio- o quimio-resistencia y la alteración del metabolismo de la energía en muchos carcinomas, que conduce a un mal pronóstico en los pacientes [2-4].
El factor de transcripción factor de inducible por hipoxia 1 (HIF-1) es el mediador principal de la adaptación celular a la hipoxia [8-10]. HIF-1 es una proteína heterodimérica que consiste en una expresado constitutivamente β-subunidad (HIF-1β) y una α inducible por hipoxia (HIF-1α) subunidad [8-10]. La subunidad HIF-1α se degrada a través de la vía ubiquitina-proteasoma en virtud de normoxia. Por el contrario, en condiciones de hipoxia, HIF-1α se estabiliza y se dimeriza con HIF-1β la interacción con CBP /p300, que luego se une al elemento de respuesta a hipoxia (HRE) en la región promotora de cientos de genes diana [11-16]. Estos informes anteriores han llevado al reconocimiento de HIF-1α como regulador central en la patogénesis del cáncer sólido
Las especies reactivas de oxígeno (ROS), tales como el anión superóxido (O
2
. - ), peróxido de hidrógeno (H
2O
2), y el radical hidroxilo (HO •), consisten de especies de oxígeno radicales y no radicales formados por la reducción parcial de oxígeno. Intracelular de ROS se genera principalmente en la mitocondria por la fosforilación oxidativa (OXPHOS), un proceso realizado por la cadena de transporte de electrones (ETC) [17]. Cuando ROS abrumar el sistema de defensa antioxidante celular, el estrés oxidativo se produce. El exceso de estrés oxidativo causa el daño mediado por ROS de ácidos nucleicos, proteínas y lípidos y conduce a la muerte celular [17, 18].
se ha informado para el control de la producción de ROS en condiciones de hipoxia a través de múltiples mecanismos de HIF-1α incluyendo la conversión de metabolismo de la energía de la fosforilación oxidativa para la glucólisis, que se conoce como el efecto Warburg [19-23], la inducción de la autofagia mitocondrial selectiva (designado como mitofagia) [24, 25], ETC modificación por un interruptor de subunidad en citocromo c oxidasa (COX) [26] y eliminadores de ROS [27]. En la vía metabólica del efecto Warburg, HIF-1α activa en primer lugar la transcripción de
GLUT1
para aumentar la captación de glucosa en las células. La glucosa se metaboliza a piruvato y luego por las acciones de los miembros de enzimas glucolíticas, que son conocidos para los objetivos de HIF-1α [28, 29]. En condiciones aerobias, el piruvato se convierte en acetil-CoA (AcCoA) por la piruvato deshidrogenasa (PDH) para la entrada en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). Por el contrario, en las células cancerosas expuestas a la hipoxia, el piruvato se desvía lejos de la mitocondria, en el que HIF-1α regula al alza la expresión de PDK1 para inhibir la actividad de la PDH. A partir de entonces, LDHA convierte alternativamente piruvato a lactato y MCT4 transporta el lactato fuera de la célula. Estos genes también están regulados por HIF-1α [16, 30, 31]. La hipoxia induce mitofagia para prevenir la excesiva producción de ROS por el cual las mitocondrias dañadas se eliminan a través de la digestión lisosomal [24, 25]. Estudios recientes han demostrado que HIF-1α activa la transcripción de los genes que codifican BNIP3 y BNIP3L, factores esenciales en el proceso mitofagia [32]. Otro estudio informó de que HIF-1α regula la conmutación subunidad COX4 mediante la activación de la transcripción de los genes relacionados con ETC-COX4-2 y Lon, una proteasa mitocondrial que se requiere para la degradación COX4-1 en condiciones de hipoxia [26]. El interruptor de subunidad COX4 se informó como un paso importante en la homeostasis de ROS, debido a su papel en la optimización de la eficiencia de la respiración en condiciones de hipoxia [26]. El MnSOD scavenger ROS es conocido para convertir los radicales superóxido a peróxido de hidrógeno. Un estudio previo ha informado de que MnSOD es upregulated en condiciones de hipoxia, aunque si esto upregulation está mediada por HIF-1α aún no se ha demostrado [27]. Recientemente, otro informe demuestra el hallazgo interesante que los fibroblastos embrionarios (MEFs) de ratones HIF-1α nulo hipóxico murieron debido a un exceso de producción de ROS, mientras que los MEFs fueron rescatados por el tratamiento con el antioxidante N acetil-L-cisteína (NAC) [ ,,,0],33]. Tomados en conjunto, estos informes indican que HIF-1α juega un papel central en la organización de la producción de ROS mitocondrial en células vivas en condiciones de hipoxia.
En este estudio, que tuvo como objetivo establecer un modelo terapéutico que demuestra que la apoptosis inducida por hipoxia a través la sobreproducción de ROS se puede introducir en células de cáncer gástrico deficientes HIF-1α. Inicialmente se determinó si la hipoxia induce la muerte celular por la excesiva producción de ROS en el derribo de HIF-1α (KD) de las células. A partir de entonces, se abordó la hipótesis de que la introducción de los niveles altos de glucosa por el tratamiento de KD células con insulina puede aumentar el efecto apoptótico. Por último, utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor, hemos propuesto que la inhibición de HIF-1α en combinación con el tratamiento de glucosa e insulina (GI) puede ser una potencial terapia para el cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Cultivo celular condiciones y reactivos
la línea celular de cáncer gástrico 58As9 fue proporcionado amablemente por el Dr. K. Yanagihara (Centro Nacional del cáncer hospital del Este, Chiba, Japón) en diciembre en 2009. la línea celular 58As9 se estableció originalmente de la escirrosa línea celular de carcinoma gástrico derivados de HSC-58 [34]. A continuación, esta línea celular fue autenticado aún más el día 24 Febrero
ª de 2015 por el Banco de Células JCRB (Osaka, Japón). Otra línea celular de cáncer gástrico, MKN74 se adquirió de Banco de Células, Centro de Recursos Bio RIKEN (Tsukuba, Japón). En el presente estudio, hemos utilizado desmontables células HIF-1α estables KD y 74 KD-, que fueron establecidos por la transfección del plásmido que alberga las secuencias de siRNA RNAi en las células 58As9 y MKN74 como se describe anteriormente [7, 35]. Las secuencias de siRNA dirigidos HIF-1α y control revueltos siRNA fueron diseñados como sigue: siRNA HIF-1α para KD o 74-KD (5'-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 ') y scramble siRNA para SC o 74- SC (5'-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 '). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS) y 100 g /ml de kanamicina (Meiji, Tokio, Japón ) y se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada. Las células se cultivaron bajo cualquiera de las condiciones de normoxia (20% O
2 y 5% de CO
2 en el aire) o condiciones hipóxicas (1% O
2, 5% de CO
2 y 94% N
2) en una cámara hipóxica (ASTEC, Fukuoka, Japón) y luego se trató con NAC (Sigma-Aldrich) y la insulina (Wako, Osaka, Japón) a una concentración final de 5 mM y 500 ng /ml, respectivamente. La concentración del medio de alto contenido de glucosa se preparó por la adición de 45% de D - (+) - solución de glucosa (Sigma-Aldrich) y la concentración final se determinó que era 10 g /L, que es 5 veces mayor que en condiciones normales RPMI-1640.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular bajo normoxia o hipoxia se evaluó mediante ensayos de exclusión con azul de tripano de tinte. Para la evaluación de los efectos del tratamiento de drogas, incluyendo NAC, alta glucosa y /o insulina en la viabilidad celular, 1 × 10
5 células fueron sembradas en placas de cultivo de 6 cm. Las células se trataron con diversos fármacos en las concentraciones indicadas y se cultivaron bajo normoxia o hipoxia durante 24 h a 96 h. Al final de la incubación, se recogieron las células flotantes y adherentes y se sedimentaron por centrifugación (3000 rpm, 5 min). Las células se resuspendieron en 90 l de medio completo, se mezcla con 10 l de solución de azul de tripano al 0,4% y se contaron usando un hemocitómetro bajo un microscopio. La tasa de muerte de las células se determinó como la relación del número de células muertas /número total de células. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y con independencia repitieron al menos tres veces.
análisis de transferencia de Western
lisados de células enteras a partir de células cultivadas y los xenoinjertos de tumores en ratones se prepararon usando tampón de lisis compuesta de 150 mmol /L de NaCl, 50 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% de Triton X-100, y una mezcla de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche, Mannheim, Alemania). Los lisados celulares a partir de la fracción de fracción de membrana celular y citosólica se prepararon utilizando un citocromo Liberar Apoptosis Assay Kit y un Kit de Extracción de proteínas de plasma de membrana (BioVision Inc., Milpitas, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante c. Se realizó el análisis por Western blot como [7] se describe anteriormente. Las alícuotas que contienen 30 g de proteína se separaron por electroforesis en 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana Amersham Hybond-ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) en un tampón de transferencia. Después de bloquear con leche para la piel 5% durante 30 min, la membrana se incubó con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-HIF-1α (1: 1000 dilución, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-exfoliados caspasa 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), c anti-citocromo (1 : dilución 500, BioVision), anti-GLUT1 (dilución 1: 100 000, Abcam) y anti-β-actina (dilución 1: 10.000; Sigma-Aldrich, Inc.). Después de la incubación con los anticuerpos secundarios correspondientes, las señales se desarrollaron utilizando un sistema Amersham ECL Plus Western Blotting de detección (GE Healthcare).
Detección de ROS intracelulares mediante citometría de flujo
valores intracelular de ROS se evaluaron utilizando un kit de detección total de ROS (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En breve, KD, SC, las células se cultivaron en condiciones de normoxia o hipoxia, ya sea con o sin tratamientos con fármacos (es decir, NAC, alta glucosa y /o insulina) durante 24 h, 48 h y 72 h. 74-KD y 74-SC también se cultivaron en condiciones de normoxia o hipoxia ya sea por 24, 48, y 72 horas sin ningún tratamiento con fármacos. Las células se lavaron y se re-suspendieron en la solución de detección de ROS. ROS fluorescencia se detectó por el flujo FACS Calibur citómetro (Becton-Dickinson, San Jose, CA) y se analizaron por el programa de software Cell Quest. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. La fluorescencia media de la producción de ROS se determinó automáticamente y se presenta como la GEO significa.
Total extracción de RNA y RT-PCR cuantitativa
ARN total fue extraído de las líneas celulares usando un kit de extracción de ARN Isogen ( Nippon gene, Osaka, Japón). Una g de ARN se convirtió en ADNc usando un ReverTra Ace (Toyobo) kit de reacción de transcripción inversa. El cDNA se utilizó como molde para la PCR. A-cuantitativa en tiempo real RT-PCR (RT-qPCR) se realizó por medio del sistema de instrumento Light Cycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) utilizando un kit Light-Cycler-FastStart DNA Maestro SYBR Green I (Roche). Los diez genes que se analizaron por RT-qPCR fueron los siguientes: 1 transportador de glucosa (
GLUT1
), aldolasa C (
ALDOC
), piruvato deshidrogenasa quinasa 1 (
PDK1
), lactato deshidrogenasa A (
LDHA
) y monocarboxylate transportador 4 (
MCT4
), Bcl-2 /adenovirus EIB 19-kDa de proteínas que interactúan 3 (
BNIP3
), al igual que BINP3 (
BNIP3L
), manganeso superóxido dismutasa mitocondrial (
MnSOD
), una proteasa mitocondrial
LON Opiniones y citocromo oxidasa subunidad 4-2 (
COX4 - 2
). Los cebadores se diseñaron de acuerdo con las secuencias de ADNc reportados (GenBank, Bethesda, MD) (Tabla 1). Después de realizar un paso de desnaturalización a 95 ° C durante 3 min, amplificación por PCR se llevó a cabo con 50 ciclos de 15 s de desnaturalización a 95 ° C, 5 s de hibridación a 60 ° C y 10 s de extensión a 72 ° C. Los valores cuantitativos se normalizaron a la β-actina (
ACTB
) expresión (Tabla 1). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron de forma independiente al menos tres veces.
La captación de glucosa ensayo
La captación de glucosa en las células cultivadas se determinó utilizando un 2-desoxiglucosa (2DG) Medición Uptake Kit (COSMO BIO Co. Ltd., Tokio, Japón). Brevemente, las células se cultivaron en condiciones de suero de hambre durante 6 h, seguido por el cultivo adicional durante 18 h en medio normal suplementado con 10% FBS. Las células se incubaron durante 24 h bajo normoxia o hipoxia. A partir de entonces, las células se trataron con o sin 500 ng de insulina /ml para 18 min. Finalmente, las células se trataron con 2DG por 20 min y se sometieron a la medición de la absorción de 2DG de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se calcularon los valores medios.
Los estudios en animales
Los animales protocolos fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Saga (protocolo 24-008-0 ) y se ajustaban a las directrices llegar para el uso de animales en la investigación. 4 semanas de edad, los ratones BALB /cA Jcl atímicos hembra (nu /nu) se obtuvieron de Nihon Crea Co. (Osaka, Japón). Los animales se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. Se les dio comida y agua estéril tratada en autoclave con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Los ratones fueron aclimatadas al medio ambiente durante 7 días antes de los experimentos. KD células o SC (3 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en el dorso de los ratones (n = 9 para cada línea celular). Diez días después de la inoculación subcutánea, los xenoinjertos de ambas células se hicieron palpable. Nueve ratones portadores de KD o SC xenoinjertos se dividieron en tres grupos para tratamiento por la glucosa (8 g /kg /día, Sigma), glucosa e insulina (GI) (1 unidad por 3 g de glucosa /día, Wako) o fosfato tamponada con de solución salina (PBS) como el tratamiento control. Cada uno de estos fármacos se administraron por vía intraperitoneal en tres ratones (seis en total) los tumores cada 24 h del día 1 al día 11. Durante este período, los tumores se midieron en 2 dimensiones perpendiculares con un calibre cada cuatro días. El tamaño del tumor (
T
) se evaluó como el área máxima se ha reducido y se determina mediante la siguiente fórmula:
T
= π /4 ×
a
×
b
, donde
a
es el eje más corto (mm) y
b
es el eje más largo (mm). Los ratones fueron sacrificados 12 días después de los tratamientos con fármacos y los tumores fueron cosechadas para el experimento posterior.
exfoliados caspasa 3 inmunohistoquímica y la evaluación de la apoptosis
in vivo
La tumores congelados fueron incorporados con Tissue-Tek octubre Compuesto. Estos bloques se cortaron en secciones de 4 micras de espesor. Para la recuperación de antígenos, los portaobjetos se calentaron en tampón Tris-EDTA (pH 9,0) en un microondas (500 vatios) durante 5 min. Las secciones fueron incubadas con anti exfoliados caspasa 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) durante 2 h a temperatura ambiente, y el Sistema de DAKO Envision + (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) se usó como anticuerpo secundario. Las señales se visualizaron con tetrahidrocloruro de diaminobencidina (0,02%). Para la evaluación de la apoptosis, la caspasa escindido células 3-positivas con núcleos de color marrón se contaron en cinco campos a 400 aumentos y se calculó la media. La expresión inmunohistoquímica de la caspasa 3 escindida fue revisado a ciegas y evaluada por un patólogo certificado (Dr. AN).
El análisis estadístico
Los datos se analizaron mediante un ANOVA usando el paquete de software Prism 5 ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Para la comparación entre los dos grupos, las diferencias en los valores medios fueron evaluados por
t-
de Student y la prueba de Mann-Whitney
T
prueba. Para la comparación entre tres o más grupos, se realizaron pruebas post hoc de Bonferroni para un ANOVA de una vía. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los datos se expresan como la media ± SEM.
Resultados
caída de HIF-1α inducida por la muerte celular apoptótica en condiciones de hipoxia en células de cáncer gástrico 58As9
La expresión de HIF-1α fue evaluado en células estable HIF-1α desmontables (KD) y células SC (como la línea celular de control). Un análisis de transferencia Western mostró que la expresión de HIF-1α fue eliminado por completo en las células KD después de 8 horas en condiciones de hipoxia en comparación con las células SC (Fig 1A). La tasa de muerte celular se estimó después de 24 h a 96 horas bajo normoxia e hipoxia. La tasa de mortalidad fue mayor en las células KD que en las células SC bajo normoxia durante 24 a 96 horas, sin embargo las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Fig 1B). En contraste, la tasa de muerte celular en las células KD estaba fuertemente aumentó en condiciones de hipoxia y significativamente mayor que la observada en las células SC a las 72 y 96 horas (Fig 1C). El análisis de transferencia Western demostró que la caspasa 3 escindida, así como citosólicas citocromo c estaban elevados en las células KD, pero no en las células SC en condiciones de hipoxia durante 8 horas (Fig 1D y 1E). La hipoxia muerte celular inducida también se confirmó en otras células gástricas desmontables HIF-1α cáncer 74-KD (S1 FIG). Estos resultados indican que la hipoxia inducida fuertemente la apoptosis en la línea celular KD caída HIF-1α.
(A) El análisis de transferencia Western de la expresión de HIF-1α se llevó a cabo en el SC o KD células en normoxia (20% O
2) y la hipoxia (1% O
2). El marcador interno β-actina (β-act) se expresó igualmente en todas las células. (B), (C) La tasa de muerte celular se evaluó utilizando células SC o KD células bajo normoxia (B) y la hipoxia (C) para 0 h a 96 h. Las tasas de mortalidad se compararon entre las células y las células SC KD. n.s .: no significativa, *: p & lt; 0,05, **: p & lt; 0,01, ***: p & lt; 0,001. (D), (E) Un análisis de Western blot de (D) caspasa 3 y (E) citosólica de citocromo c en el SC o KD células en normoxia e hipoxia durante 8 h escinde.
basura ROS invertido el fenotipo apoptótico observado en desmontables células HIF-1α
el nivel de ROS intracelular se calculó y se comparó entre los KD células y SC. El nivel de ROS aumentó de una manera dependiente del tiempo en las células KD en condiciones de hipoxia, mientras que el nivel se elevó ligeramente en las células SC (Fig 2A). El nivel de ROS en las células KD fue significativamente más alta en condiciones de hipoxia durante 24 a 72 horas que la de las células SC (Fig 2A). Los niveles de ROS también se evaluaron en las células 74-SC-74 y células KD (S2) Fig. Los niveles de ROS no difirieron entre los 74 y SC-74-KD células en normoxia (S2A FIG). Sin embargo, en condiciones de hipoxia, los niveles de ROS fueron significativamente mayores en las células 74 kD que en las células 74-SC en 48 a 72 horas (S2B FIG). NAC, un antioxidante, disminuyó significativamente el nivel de ROS en las células KD en condiciones de hipoxia durante 48 a 72 horas (Fig 2B). Con el fin de evaluar si la producción de ROS induce la muerte celular inducida por hipoxia en las células KD, se evaluó la tasa de muerte de las células con o sin NAC en células KD bajo normoxia e hipoxia. NAC tratamiento no afectó a la tasa de muerte celular en las células KD bajo normoxia (Fig 2C). En contraste, el tratamiento NAC redujo significativamente la muerte celular en las células de KD en condiciones de hipoxia durante 48 a 96 horas (Fig 2D).
(A) Los niveles de ROS se estimaron usando las células KD y SC en condiciones de hipoxia para 0 h a 72 h. (B) El nivel de ROS se analizó en las células hipóxicas KD con o sin tratamiento NAC 5 mM durante 0 a 72 h. (C) La tasa de muerte celular se evaluó en células KD con o sin NAC bajo normoxia (C) y la hipoxia (D) para 0 h a 96 h. KD-NAC (-): KD células NAC-no tratados, KD-NAC (+): KD células tratadas con NAC. *: P & lt; 0,05, ***:. P & lt; 0,001
caída de HIF-1α reducen la inducción hipóxica de varios genes implicados en el control de la producción de ROS
Para investigar la la acumulación de ROS inducida por hipoxia en las células desmontables HIF-1α, la expresión de ARNm de diez genes, que están implicados en el mecanismo de control de ROS (
GLUT1
,
ALDOC
,
PDK1
,
LDHA
,
MCT4
,
BNIP3
,
BNIP3L
,
LON
,
COX4-2
y
MnSOD
) se analizaron mediante un RT-qPCR. La inducción hipóxica de la expresión génica se evaluó por la inducción de plegado (FI). El IF en los diez genes fueron significativamente menores en las células KD que en las células SC (Figura 3). Por otra parte, cuando se está restringido a condiciones de hipoxia, los niveles de expresión de los diez genes fueron significativamente más bajos en las células KD que las células SC. Estos resultados mostraron que desmontables HIF-1α disminuyó notablemente la expresión inducida por hipoxia de los diez genes. Por otra parte, bajo normoxia, la expresión de PDK1 y BNIP3L fue significativamente menor en las células KD que en las células SC. Por el contrario, los niveles de expresión de LON y COX4-2 fueron significativamente mayores en los KD células en comparación con las células SC.
La expresión del ARNm de GLUT1, ALDOC, PDK1, LDHA, MCT4, BNIP3, BNIP3L, LON , COX4-2 y MnSOD se evaluó cuantitativamente bajo normoxia (barras negras) y la hipoxia (barras blancas) durante 24 horas. Los niveles de expresión se presentan en el gráfico. La inducción de plegado (FI) se estimó como la relación de la expresión de la hipoxia /normoxia y se presenta en la parte inferior de los gráficos. Los niveles de expresión de diez genes en las células KD se compararon con los niveles de expresión en las células SC tanto bajo normoxia e hipoxia. ns: no significativo, *: p & lt; 0,05, **: p & lt; 0,01, ***:. p & lt; 0,001
tratamientos de glucosa y de insulina aumentaron la muerte celular apoptótica en células de KD en condiciones de hipoxia
a continuación se investigó si la promoción de la captación de glucosa afecta a la apoptosis inducida por hipoxia en las células KD. La viabilidad celular se evaluó en las células KD y SC siguientes tratamientos con el control (PBS), alto contenido de glucosa, insulina o glucosa más alto de insulina (GI). la muerte celular inducida por hipoxia fue estimada por el FI. La tasa de muerte celular en condiciones de hipoxia se comparó entre el tratamiento control y los otros tratamientos en ambas líneas celulares (Fig 4). En las células SC, no se observaron diferencias significativas en la tasa de mortalidad FI y de células en condiciones de hipoxia entre cualquiera de los tratamientos (Fig 4A). En las células KD, el FI se incrementó significativamente por la hipoxia en todos los tratamientos. En particular, el tratamiento GI dio la más alta FI entre todos los tratamientos (Figura 4B). La tasa de muerte celular en condiciones de hipoxia fue significativamente mayor en las células GI-tratado que en las células de control tratadas (Fig 4B). Para investigar si los tratamientos afectaron a la producción de ROS, el nivel de ROS se analizó en las células KD. En comparación con condiciones de normoxia, el nivel de ROS fue significativamente elevado en las células de KD en condiciones de hipoxia (figura 4C). En condiciones de hipoxia, el nivel de ROS en células KD se incrementó significativamente por los altos de glucosa, insulina y el tratamiento GI en comparación con el tratamiento control. El nivel de ROS más alta se observó en las células positivamente KD GI-tratado (figura 4C).
El FI de la tasa de muerte de las células se determinó como la relación de la muerte de la hipoxia /normoxia. La tasa de muerte celular en tratado con PBS (control), alto contenido de glucosa y /o de las células SC tratados con insulina (A) y KD células (B) se representan gráficamente. El valor de FI se presenta en la parte inferior. La tasa de muerte de las células en condiciones hipóxicas en el tratamiento de control se comparó con la de alto nivel de glucosa, la insulina y el tratamiento GI. (C) El nivel intracelular de ROS en el control tratados con alta glucosa y /o KD células tratadas con insulina están trazados en el gráfico. Los niveles de ROS en las células KD tratados con el tratamiento de control se compararon entre normoxia (barras negras) y la hipoxia (barras blancas). El nivel de ROS en las células hipóxicas KD con el tratamiento de control se comparó con más que con alto nivel de glucosa, la insulina y el tratamiento GI. ns: no significativo, *: p & lt; 0,05, **: p & lt; 0,01, ***:. p & lt; 0,001
Evaluación de la captación de glucosa después de un tratamiento con insulina
La capacidad captación de glucosa se analizó en un estudio de incorporación 2DG. En las células SC y KD bajo normoxia, la incorporación de 2DG se elevó significativamente por el tratamiento de 2DG en comparación con las células no tratadas. La incorporación de 2DG se aumentó aún más por el tratamiento con insulina adicional tanto en las células (Fig 5A). En comparación con la normoxia, hipoxia estimuló más fuertemente la absorción de 2DG en las células SC, con o sin insulina (Fig 5B). Se observaron resultados similares en las células KD en condiciones de hipoxia (Figura 5B). Sin embargo, en condiciones de hipoxia, menos 2DG se incorporó en las células KD que en las células SC, con o sin el tratamiento con insulina adicional (Fig 5B). Para evaluar el mecanismo de la captación de glucosa dependiente de insulina, la expresión membranosa de GLUT1 se analizó en las células KD bajo normoxia e hipoxia. Bajo normoxia, la expresión GLUT1 membranosa fue elevado con alta glucosa y /o el tratamiento con insulina en comparación con la con la ausencia de tratamiento (Fig 5C). En comparación con la observada bajo normoxia, en condiciones de hipoxia, la expresión GLUT1 membranosa fue elevada en todos los tratamientos. Además, la expresión se incrementó en un alto nivel de glucosa y /o el tratamiento con insulina, en comparación con la de ningún tratamiento (Fig 5C). En particular, la expresión de GLUT1 membranosa fue más fuertemente aumentó un alto contenido de glucosa y el tratamiento con insulina (GI) en las células hipóxicas KD (Figura 5C). Por otro lado, la expresión de GLUT otra familia, GLUT3, se observó débilmente en las células KD, y este hallazgo no fue alterada entre estos diversos tratamientos (datos no mostrados). En este estudio, GLUT2 y GLUT4 no se expresaron en las células KD.
(A), (B) El nivel de absorción de 2DG en las células SC o KD células con o sin tratamiento con insulina se evaluó bajo normoxia (A) y la hipoxia (B). (C) El análisis de transferencia de Western de GLUT1 membranosa (54 kDa) expresión en las células KD con control, alta glucosa y /o tratamientos de insulina tanto bajo normoxia e hipoxia tal como se indica. ***:. P & lt; 0,001
caída de HIF-1α, más el tratamiento GI reprimida fuertemente el crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos
Por último, se determinó la
in vivo
efecto del tratamiento en xenoinjertos de tumores GI KD y SC. La figura 6A muestra el diseño experimental del modelo murino de xenoinjerto. Diez días después de la inoculación subcutánea de SC o KD células, xenoinjertos fueron cultivadas sobre las espaldas de ratones desnudos. En este punto, un análisis de transferencia Western confirmó la expresión de HIF-1α en los tumores SC, pero no en los tumores kD (Fig 6B). A partir de entonces, tres fármacos, que consta de PBS, glucosa o GI, se inyectaron intraperitonealmente en ratones desnudos portadores de un tumor o SC KD (día desde el día 1 al día 11). Las imágenes representativas de los ratones portadores de tumores que se trataron con PBS (SC-PBS y KD-PBS), glucosa (SC-glucosa y KD-glucosa) o GI (SC-GI y KD-GI) se muestran en la figura 6C . Los tumores KD-glucosa y KD-GI parecían ser más pequeño que los otros tumores. Fig 6D mostró la curva de crecimiento de los 6 tumores. Los tamaños de la KD-Glucosa y tumores KD-GI fueron significativamente más pequeño que el tumor KD-PBS el día 12. El tumor KD-GI era la más pequeña. Por otro lado, en los ratones SC, no hubo diferencia significativa en el tamaño de la SC-PBS, SC-glucosa y tumores SC-GI (Fig 6D). Se realizó un análisis inmunohistoquímico de la caspasa 3 escindida para evaluar la apoptosis inducida por la glucosa o el tratamiento GI. La expresión positiva de caspase3 escindido se observa con frecuencia en el KD-Glucosa y tumores KD-GI (Figura 6E). Sin embargo, todos los tumores KD exhibieron un cierto grado de caspasa 3 escindida (Fig 6F). En contraste, no hubo una diferencia significativa en la expresión de la caspasa 3 escindida entre el SC-PBS, SC-glucosa y tumores SC-GI. En los tumores KD, la expresión positiva de caspase3 escindido fue significativamente mayor en el tumor KD-PBS que en el tumor SC-PBS. Por otra parte, la expresión de caspase3 escindido fue significativamente mayor en los tumores KD-glucosa o KD-GI que en el tumor KD-PBS. Se observó la expresión más alta en el tumor KD-GI.
(A) La programación experimental de glucosa (G) o glucosa más tratamiento con insulina (GI) en los xenoinjertos de tumores. La inyección intraperitoneal inicial (i.p.) con control PBS o glucosa, GI está indicado por el triángulo vacío. Las inyecciones i.p. se indican mediante flechas. Los tumores recogidos en el día 12 se indican mediante el triángulo reticulada. (B) El análisis de transferencia de Western de HIF-1α en los xenoinjertos de las células del tumor SC (SC) y KD células tumorales (KD). (C) Imágenes representativas de la SC o tumores tratados con PBS KD, glucosa o IG. Los tumores tratados fueron designados como SC-PBS, SC-glucosa, SC-GI, KD-PBS, KD-Glucosa y KD-GI. (D) El tamaño de los tumores en 6 días 1 a 12 días se representó en el gráfico como se indica.