Extracto
Antecedentes
El butirato sódico, un inhibidor de la histona deacetilasa , se ha convertido en un fármaco anticanceroso prometedor para varios tipos de cáncer. Estudios recientes han indicado que el butirato de sodio podría inhibir la progresión del cáncer de próstata; Sin embargo, el mecanismo exacto todavía no está claro. El objetivo de este estudio fue investigar el mecanismo de acción butirato de sodio en las células DU145 de cáncer de próstata.
Métodos
Los efectos inhibidores de NaB sobre el crecimiento celular fueron detectados por el 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-diphenyltetrrazolium ensayo de bromuro. apoptosis celular se determinó mediante análisis de citometría de flujo de células DU145 teñidas con anexina V y PI. Hoechst 33258 y de fluorescencia microscopios se utilizaron para observar la morfología nuclear de las células DU145 después del tratamiento con NaB. Se establecieron desmontables células ANXA1 a través de la transfección con ANXA1 siRNA. los niveles de mRNA ANXA1 fueron medidos mediante qRT-PCR. Bcl-2, Bax, ANXA1, ERK1 /2 y pERK1 /2 se detectaron por transferencia de western.
Resultados
NaB inhibió significativamente el crecimiento y la apoptosis inducción de DU145 y células PC3 en una dosis -dependiente. La expresión del gen anti-apoptosis Bcl-XL y Bcl-2 en las células DU145 se reducen y la expresión del gen de la pro-apoptosis Bax y Bak aumentó después del tratamiento NaB. Otros estudios han demostrado que NaB hasta reguladas la expresión de ANXA1 y que la acción de inhibición de tumor de NaB se redujo notablemente a través de caída del gen ANXA1 en las células DU145. Además, las células siANXA1 mostraron que la proliferación celular aumentada y apoptosis de las células se indujo mediante la inactivación de la quinasa regulada extracelular (ERK).
Conclusión
Nuestros resultados apoyan una correlación significativa entre las funciones de NAP y los ANXA1 expresión en el cáncer de próstata, y allanar el camino para el estudio aún más el mecanismo molecular de acciones NAB cánceres
Visto:. Mu D, Gao Z, Guo H, G Zhou, Sun B (2013) Crecimiento butirato sódico induce la apoptosis y la inhibición de próstata humano DU145 células del cáncer de regulación de la expresión de la anexina A1. PLoS ONE 8 (9): e74922. doi: 10.1371 /journal.pone.0074922
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: April 9, 2013; Aceptado: 6 Agosto de 2013; Publicado: 23 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Mu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es un cáncer maligno relativamente común y la segundo cáncer más comúnmente diagnosticado en los hombres [1]. Recientemente, varias terapias eficaces se pueden ofrecer para el tratamiento clínico de cáncer de próstata; como la cirugía (prostatectomía radical) y la radioterapia (radioterapia de haz externo, la braquiterapia, o ambos) para los pacientes con enfermedad en fase temprana y tratamientos sistémicos adyuvantes (quimioterapia), que son eficaces para la enfermedad en estadio avanzado [2]; Sin embargo, las terapias tienen diferentes perfiles de efectos secundarios. butirato de sodio, uno de los inhibidores de histona deacetilasa más ampliamente estudiados, se ha convertido en un fármaco anticanceroso prometedor mediante la alteración de la expresión génica a través de modificación de la cromatina [3].
butirato de sodio, la sal de sodio de ácido butírico, se ha informado tener una amplia variedad de efectos sobre las células de mamífero en cultivo, tales como la inducción de la diferenciación y la inhibición de la proliferación celular, a concentraciones relativamente bajas [4], [5]. Por otra parte, hay un cuerpo de evidencia que muestra que el butirato de sodio podría inducir apoptosis en numerosas células del cáncer [6], [7]. Debido a su inhibidoras del crecimiento y la actividad inductora de la apoptosis, butirato de sodio, solo o en combinación con otros fármacos contra el cáncer, se podría utilizar para tratar una serie de tumores malignos [8], [9]. Recientemente, Degui Wang y sus colegas demostraron que el butirato sódico puede inhibir la proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata humano y tiene un efecto sinérgico con los medicamentos contra el cáncer en el tratamiento de cáncer de próstata, tanto
in vitro
y
in vivo
[10]. La utilidad clínica de butirato de sodio está restringida por su mecanismo de acción, que todavía no está claro. Un avance reciente importante ha sido que el butirato sódico se ha encontrado que un máximo de regular la expresión de anexina A1 (ANXA1) en células de adenocarcinoma de colon humano [11].
Las anexinas son una familia de proteínas de unión a fosfolípidos y calcio que están compuestos por 12 miembros en los mamíferos. Las anexinas son omnipresentes y se expresan en una variedad de organismos [12]. Hay algunas pruebas de que miembros de la familia de anexina tienen papeles importantes en el desarrollo tumoral y la progresión porque estas proteínas pueden afectar a la capacidad de invasión y proliferación de células cancerosas y mostrar la desregulación en numerosos tipos de cáncer [13]. ANXA1, el primer miembro de la familia de las anexinas, es una proteína intracelular que juega un papel importante en la apoptosis, la proliferación, y el cáncer [14], [15]. Una gran controversia aún existe con respecto a la expresión de ANXA1 en diferentes tipos de cánceres. Varios estudios han demostrado que la expresión de ANXA1 es el regulado en el cuello uterino, mama, cabeza y cuello o cáncer de tiroides [16], [17], [18], [19], [20]. Por otro lado, también hay cierta evidencia de que un aumento de la expresión de ANXA1 ha ocurrido en otros tipos de cáncer, como el de páncreas, de esófago, y carcinomas gástricos [21], [22], [23]. Hay una falta de evidencia experimental funcional adecuado que defina claramente el papel de las anexinas en el cáncer de próstata. Varios estudios recientes han indicado que la anexina II se redujo en los cánceres de próstata y anexinas A1 y A2 ya se han asociado con la supresión de tumores en el cáncer de próstata [24]. Lecona y sus colegas demostraron que el butirato-hasta podría regular la expresión de ANXA1 en células de adenocarcinoma de colon humano [11]. Estos estudios ponen de relieve el posible papel de butirato de sodio como un regulador ANXA1 para inhibir la progresión del cáncer de próstata. El estudio proporciona la primera evidencia directa en células de cáncer de próstata que el butirato sódico puede regular por incremento la expresión de ANXA1 que conduce a la apoptosis celular. Mostramos que el butirato de sodio inhibe el crecimiento celular e induce la apoptosis celular en células de cáncer de próstata por hasta la regulación de la expresión de ANXA1 a través de la vía de señalización de ERK.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos
mouse anti-Bcl-2 anticuerpo monoclonal anti-Bax anticuerpo monoclonal, anticuerpo monoclonal de ratón anti-Bcl-XL, anti-Bak anticuerpo monoclonal, anticuerpo de ratón ratón ratón anti-ANXA1 monoclonal y el anticuerpo monoclonal-β-actina de ratón anti eran obtenido de Abcam (Cambridge, MA). Anti-fosfo-ERK (Perk) anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal anti-ERK y de cabra conjugado con HRP anti-IgG de ratón se obtuvieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA).
Cell Culture
Los cáncer de próstata humano de la línea celular DU145 células (HTB-4; ATCC, Rockville, MD) y las células PC3 (ATCC, Rockville, MD) se cultivaron a 37 ° C bajo una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 95% de aire y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 1% de penicilina-estreptomicina y 1% de glutamina.
viabilidad de la célula de ensayo
la viabilidad celular se determinó por el ensayo de exclusión de azul de tripano, como se ha descrito previamente con modificaciones menores [25]. Brevemente, las células DU145 y PC3 se sembraron por separado en placas de 24 pocillos a 2 x 10
5 células por pocillo, cultivadas en medio RPMI 1640 para 24 h y después se añadió a diferentes concentraciones de NaB a una concentración final de 0, 1 , 5, y 10 mmol. Sólo se añadió sulfóxido de dimetilo (DMSO) para el grupo de control. Las células se cultivaron en una incubadora durante diferentes períodos. Las suspensiones celulares (10 l) en PBS se mezclaron con 40 l de azul de tripano (Sigma, St. Louis, MO). Las células se lavaron posteriormente tres veces con DMSO antes de contar con un microscopio de luz. Las células que demuestran la absorción de colorante se clasificaron como no viable.
MTT Ensayo de proliferación de
DU145 y la proliferación de células PC3 se midieron usando el descrito anteriormente 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2 , bromuro de 5-diphenyltetrrazolium (MTT) ensayo [26]. En pocas palabras, DU145 y PC3 células (aproximadamente 2 × 10
5) se sembraron separadamente en placas de 24 pocillos durante 48 h. El MTT (20 l, 5 mg /ml) se añadieron luego en el DU145 y células de cáncer PC3 durante 4 horas a 37 ° C. Se añadió DMSO (200 l) para solubilizar los cristales de 25 min a temperatura ambiente. El valor de la densidad óptica (DO) se midió a una longitud de onda de 490 nm mediante un espectrofotómetro (Multiskan MK3, Thermo, Waltham, MA). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces y se calcularon utilizando los resultados promedio.
Detección de Apoptosis Las células mediante citometría de flujo
La proporción de apoptosis celular se midió por la anexina V-FITC y PI seguida de tinción análisis con citometría de flujo (Beckman-Coulter, Brea, CA). En resumen, 2 × 10
5 células por pocillo en placas de 24 pocillos y luego se añadieron varias concentraciones de la AGN. Las células se trataron con tripsina y se recogieron por centrifugación y después se incubaron con anexina V y PI durante 15 minutos a temperatura ambiente. La apoptosis fue examinado por citometría de flujo usando el kit Annexin V-FITC /PI (BD PharMingen, San Diego, CA). Después de 30 minutos a 37 ° C, las células estaban listas para el análisis por citometría de flujo y la relación de apoptosis celular fue determinada.
Nuclear morfológica de observación de la AGN DU145 células de cáncer tratados
se sembraron
Las células en placas de 24 pocillos a 2 x 10
4 células por pocillo y se trataron con NaB a diversas concentraciones. Las células se fijaron con 10% de formalina tamponada /4% de formaldehído, y luego se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron con solución de tinción Hoechst 33258. La morfología nuclear de las células DU145 se observó por microscopio de fluorescencia reflejada (Nikon MF30 LED, Japón). La cuantificación de células apoptóticas se realizó mediante el recuento de 500 células DU145, a continuación, la determinación del porcentaje de células apoptóticas en al menos cinco secciones transversales por portaobjetos. El experimento se repitió al menos tres veces.
Cuantitativa en tiempo real-PCR (QRT-PCR)
ANXA1
niveles de mRNA se midieron en líneas celulares de cáncer de próstata DU145 utilizando el método de QRT-PCR. El ARN celular total fue aislado de las células DU145 utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 2 g de RNA total se sometió a transcripción inversa usando un ARN de alta capacidad a cDNA Kit (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. QRT-PCR se realizó en un solo color en tiempo real sistema de detección de PCR BioRad MyIQ utilizando SYBR Green Supermix (BioRad, Carlsbad, CA). Las secuencias de los cebadores utilizados para QRT-PCR fueron las siguientes:
ANXA1
hacia adelante, GAGCCCCTATCCTACCT TCA;
ANXA1
inversa, GGTTGCTTCATCCACACCT;
actina
hacia adelante, TCCCTGGAGAAGAGCTACGA;
actina
inversa, AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG. Estos cebadores fueron sintetizados por Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). Las condiciones de ciclación fueron las siguientes: pre-incubación: 95 ° C, 10 min; PCR: 94ºC, 10 s y 60 ° C, 30 s, 45 ciclos; elongación final: 72 ° C, 10 min. Los niveles de expresión de los genes relativos se calcularon utilizando el
2 -ΔΔCT método [27] y con el ARNm de β-actina como control interno.
Western Blot ensayo
La proteína total de DU145 células se extrajeron mediante el uso de tampón de lisis RIPA (Beyotime, Nantong, china) de acuerdo con los protocolos de operación. La concentración de proteína en los lisados se determinó mediante un kit de ensayo de proteína BCA (Beyotime, Nantong, China). Las proteínas (40 g /carril) se sometieron a 10% SDS-PAGE y se transfirió electroforéticamente a Immobilon P Millipore (Bedford, MA, EE.UU.). Ratón monoclonal y los anticuerpos policlonales se usaron como el anticuerpo primario y de cabra conjugado con HRP anti-IgG de ratón se utilizó como anticuerpo secundario. Los anticuerpos unidos se visualizaron usando el reactivo LumiGLO (Pierce, Rockford, IL) se determinaron y los niveles de las proteínas en relación con ß-actina. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
La transfección de ARN interferente pequeño
Las células DU145 de cáncer de próstata con la proteína ANXA1 fueron transfectadas con siRNA ANXA1 (siANXA10) o el control de siRNA (siMock) ( Takara, Dalian, china) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el método de Maxime [28], con modificaciones menores. En resumen, un día antes de la transfección, 2 × 10
5 células de cáncer de próstata se sembraron en un placas de 60 mm en medio RPMI 1640 que contiene 5% de FCS. En total, 1,5 g de ADN del plásmido se transfectó en células DU145 de ARN y la extracción de proteínas. Los transfectantes estables de células DU145 se seleccionaron con el medio de cultivo que contenía puromicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las colonias viables se recogieron y se transfirieron a nuevos platos después de 2 a 3 semanas después de la transfección. Las secuencias diana siANXA1 fueron: 5'-ATGCCTCACAG- CTATCGTGAA-3 '(sentido), y 5'-TTCACGATAGCTGTGAGGCAT-3' (antisentido). SiANXA1-transfectadas y se utilizaron las células transfectadas con siMock para experimentos adicionales.
Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como media ± el error estándar de la media (SEM). Las diferencias entre el control y los grupos tratados NaB se compararon mediante la prueba de Dunnett después de la ANOVA. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Resultados
NAB inhibe la proliferación y supervivencia celular en las células DU145
El efecto citotóxico de la AGN sobre el cáncer de próstata humano DU145 y PC3 se examinaron con diferentes concentraciones de NaB y tiempos por el ensayo de exclusión de azul de tripano (Fig. 1 A y C). Los resultados mostraron que la viabilidad de DU145 y células PC3 se redujo en todos NaB de una manera dosis-y dependiente del tiempo. NAB inducida por una aparente disminución en el número de células huésped viables dependiente de la dosis con una CI
50 de 7,07 mmol /L a las 48 h en las células DU145 y IC
50 de 8,71 mmol /L a las 48 h en células PC3 . Un intervalo de dosis de 0-10 mmol NAB tratamiento de las células DU145 y PC3 de cáncer de próstata durante 48 h son la concentración y tiempo de espera.
(A) NAB inhibe la viabilidad celular en un tiempo-y de manera dependiente de la dosis en DU145 Células. Las células cancerosas se trataron con medio solo o varias concentraciones de NaB (1, 5, 10 mmol) durante varios tiempos (12, 24, 48, 72, 96 y 120 h). (B) Efecto de la AGN sobre la proliferación de células DU145. Las células cancerosas se trataron con medio solo o varias concentraciones de NaB (1, 5, 10 mmol) durante 48 h. (C) NaB inhibe la viabilidad celular en células PC3. Las células cancerosas se trataron con medio solo o varias concentraciones de NaB (1, 5, 10 mmol) durante varios tiempos (12, 24, 48, 72, 96 y 120 h). (D) Efecto de NaB sobre la proliferación celular PC3. Las células cancerosas se trataron con medio solo o varias concentraciones de NaB (1, 5, 10 mmol) durante 48 h. (E) Efecto de NaB en combinación con DOC sobre la viabilidad celular de las células DU145 y PC3. Las células cancerosas se trataron con medio solo o NaB (5 mmol) en combinación con DOC (1 mol) durante 48 h. (F) Efecto de la NAB en combinación con DOC en DU145 y la proliferación celular PC3. Las células cancerosas se trataron con medio solo o NaB (5 mmol) en combinación con DOC (1 mol) durante 48 h. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de exclusión de azul de tripano. La proliferación celular se detectó mediante el ensayo de MTT. NaB inhibió significativamente el crecimiento de DU145 y células PC3. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Los datos son medias ± SEM. (N = 3) (prueba de Dunnett, * P & lt;.
0,05
versus control) guía empresas
También midió el efecto de la AGN en DU145 y PC3 proliferación celular mediante el ensayo de MTT.. Como se muestra en la Fig. 1B y D, se produjo una disminución drástica en la proliferación de células con dosis crecientes de la AGN (0-10 mmol). NAB inhibe la proliferación celular dependiente de la dosis tanto en DU145 y células PC3 (Fig. 1B y D). Estas observaciones indican que NaB puede inhibir la proliferación y supervivencia de las células DU145 y PC3, sin embargo, DU145 es más sensible para el tratamiento NaB.
Tiene alguna evidencia de que NaB combinarse con otros agentes contra el cáncer puede ser muy útil en la vejiga tipos de cáncer [10]. Por lo tanto, hemos examinado el efecto de la AGN en combinación con docetaxel (DOC) en las células del cáncer de próstata. Los resultados mostraron que hay una inhibición sinérgica del crecimiento de células de cáncer de próstata humano por NaB y DOC (Fig. 1E). Para confirmar aún más el efecto de inhibición del crecimiento sinérgico de NAB, la proliferación celular se detectó mediante el ensayo de MTT. Como se muestra en la Fig. 1F, NAB combinado con DOC podría inhibir la proliferación celular significativa.
NAB induce la apoptosis en líneas celulares DU145
La inducción de la apoptosis por NAB fue examinada por primera vez por el análisis de citometría de flujo de células teñidas con DU145 anexina V y PI (Fig. 2A). Los resultados mostraron que NaB causó un aumento dependiente de la dosis en la apoptosis celular, y la tasa de apoptosis aumentó a 30% cuando la concentración de NaB fue de 5 mmol /L
.
(A) La citometría de flujo análisis de NaB tratada DU145 células teñidas con anexina V y PI. (B) Nuclear observación morfológica de NaB tratada células de cáncer de DU145. Hoechst 33258 y un microscopio de fluorescencia se utilizaron para observar la morfología nuclear de las células DU145 después del tratamiento con NaB (400 ×). análisis (C) cuantitativa de la tasa de apoptosis de las células. (D) NaB modula la expresión de Bcl-XL y Bak en las células DU145. (E) NaB modula la expresión de Bcl-2 y Bax en las células DU145. La expresión de Bcl-XL, Bcl-2, Bax y Bak se determinaron por análisis de transferencia Western. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Los datos son medias ± SEM. (N = 3) (prueba de Dunnett, * P & lt; 0,05
vs
control.)
A continuación cuantificamos los cambios en la morfología nuclear de células mediante tinción con Hoechst bajo microscopía de fluorescencia.. Como se muestra en la Fig. 2B, las células cancerosas mostró brillante fluorescente formación de ampollas en los núcleos y la fragmentación del ADN, en comparación con las células de control DU145 después del tratamiento con NaB durante 48 horas. Además, se aumentó el número de células apoptóticas en una manera dependiente de la dosis NaB (Fig. 2C). Al mismo tiempo, la densidad celular se redujo de una manera dependiente de la dosis. Estos cambios están en conformidad con las características de la apoptosis
parece estar controlada por numerosos genes de la apoptosis de la célula.;
Bcl-XL, Bcl-2
,
Bax y Bak ¿Cuáles son los más importantes genes relacionados con la apoptosis entre ellos. Bcl-XL y de la proteína Bcl-2 son dos inhibidores de la muerte celular, mientras que Bax y Bak tienen un papel crítico en la facilitación de la apoptosis. Por lo tanto, se midió la expresión de Bcl-XL, Bcl-2, las proteínas Bax y Bak en las células DU145 por Western blot después del tratamiento con NaB (Fig. 2D y E). Los resultados mostraron que la expresión de Bcl-XL y Bcl-2 se redujo y la expresión de Bax y Bak son simultáneamente hasta reguladas. La tasa de apoptosis se incrementó de manera significativa debido a la sobre regulación de genes pro-apoptosis.
NAB hasta regula la expresión de ANXA1 en cáncer de próstata DU145 línea celular
Los resultados anteriores indicaron que NAB podría inhibir la proliferación y la apoptosis inducida en células de cáncer de próstata; sin embargo, el mecanismo de acción NaB todavía no está claro. Lecona y colegas sugirieron que el butirato puede regular por incremento la expresión de anexina A1 en células de adenocarcinoma de colon humano. Por lo tanto, nos preguntamos si había alguna conexión entre NAB y ANXA1. La expresión de ANXA1 y la sobre regulación de ANXA1 por NaB en las células DU145 se determinaron por RT-PCR y Western blot, respectivamente (Fig. 3). Como se muestra en la Fig. 3, se detectaron niveles aumentados ANXA1 ARNm y la expresión de proteínas en las células DU145 tratados con NAB. Los resultados demostraron que podía NaB hasta de regular la expresión de ANXA1 en las células DU145.
(A) expresión ANXA1 mRNA se detecta mediante qRT-PCR. grupos de tratamiento NaB significativamente mayor que el grupo control (tratamiento por medio solamente). (B) Análisis de transferencia Western de la expresión en células DU145 ANXA1 después del tratamiento NAB. Se normalizaron los datos con los valores de beta-actina y se expresan como cambios veces de β-actina en NaB grupo tratado con relación al control. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Los datos son medias ± SEM. (N = 3) (prueba de Dunnett, * P & lt;. 0,05
vs
control).
Establecimiento y los análisis funcionales de las células ANXA1 derribo
Desde ANXA1 expresión es regulada hasta en las células DU145 tratadas con varias concentraciones de NAB, supusimos que ANXA1 podría desempeñar un papel significativo en la actividad de la AGN. Para medir la ANXA1 funciones
in vitro, España un experimento siRNA se llevó a cabo en las células DU145. El nivel de mRNA y proteína ANXA1 en el grupo transfectado-siANXA1 fueron significativamente menores que el grupo transfectadas siMock (Fig. 4A). A continuación examinó el efecto de ANXA1 caída en la actividad de NAB, incluyendo la inhibición del crecimiento celular (ensayo MTT) y la inducción de apoptosis de las células (ensayo de transferencia Western). Los resultados mostraron que hubo un aumento en el crecimiento celular del grupo transfectadas-siANXA1 comparación con el grupo transfectadas-siMock (Fig. 4B). Por otra parte, la tasa de apoptosis se redujo en las células transfectadas con siANXA1 (Fig. 4C). Los resultados indicaron que la actividad NaB de inhibición del crecimiento y pro-apoptosis en células de cáncer DU145 se asoció con la expresión sobre-de ANXA1.
(A) análisis de transferencia de Western de la expresión en las células ANXA1 siANXA1 y siMock después de NaB tratamiento. Los datos se normalizaron con los valores de beta-actina y se expresan como cambios veces de β-actina en NaB grupo tratado con relación al control. (B) La proliferación de las células siANXA1 y siMock después del tratamiento NAB. (C) Análisis de transferencia Western de la expresión de Bax y Bcl-2 en las células siANXA1 y siMock. Bcl-2 y Bax niveles de expresión se normalizaron a beta-actina y se presentan como la relación de Bax /Bcl-2. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Los datos son medias ± SEM. (N = 3) (prueba de Dunnett, * P & lt; 0,05
vs
control.)
La sobreexpresión de la ANXA1 se relaciona directamente con la activación de ERK
la vía ERK es con frecuencia hasta reguladas en una variedad de tipos de cáncer [29], [30], y hay una cierta evidencia demostró que ANXA1 modula la vía ERK en un sitio proximal [31]. Para investigar más a un mecanismo potencial que podría estar implicado en la inhibición del crecimiento y pro-apoptosis en las células cancerosas, se detectó la expresión de ERK y ERK fosforilada (Perk). Perk fue significativamente menor en las células transfectadas con siANXA1 en comparación con el grupo siMock. Los resultados demostraron que la vía ERK fue atenuada en las células transfectadas con siANXA1 (Fig. 5).
La expresión de p-ERK y ERK se detectó por Western blot. La expresión de p-ERK se reduce notablemente en células ANXA1 desmontables en comparación con las células siMock, mientras que el nivel de ERK es casi sin cambios. Se normalizaron los datos con los valores de beta-actina y se expresan como cambios veces de β-actina. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Los datos son medias ± SEM. (N = 3) (prueba de Dunnett, * P & lt; 0,05
vs
control.)
Discusión
El cáncer de próstata es el segundo cáncer más comúnmente diagnosticado y. la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres. En la actualidad, varios de radiación y quirúrgicos terapias efectivas se pueden ofrecer para el tratamiento clínico de cáncer de próstata; Sin embargo, las terapias para el cáncer de próstata están lejos de cáncer de próstata avanzado satisfactoria y sigue siendo incurable [9]. Hay una necesidad urgente de encontrar sustancias o medicamentos que son adecuados para la prevención y control mejor de cáncer de próstata. NAB, un miembro del grupo de los inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC), es un ácido graso de cadena corta de origen natural que es capaz de iniciar la diferenciación de muchos tipos de células, tales como células de cáncer de colon humano HT29 y células de cáncer gástrico [32], [33]. NAB podría aumentar la actividad antitumoral con menor toxicidad, y hay varias líneas de evidencia que han demostrado que NAB puede inducir inhibición del crecimiento y la apoptosis en numerosos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata [5], [6], [9]. Sin embargo, el mecanismo exacto de la AGN en la tumorigénesis es poco conocida.
Actualmente está bien establecido que puede NAB hasta de regular la expresión de ANXA1. Por otra parte, las anexinas son frecuentemente dysregulated en diversos tipos de cáncer y su expresión ha indicado un supresor de tumores o posible papel homeostático [34], [35]. Por lo tanto, se asumió que NAB inhibió la proliferación celular y la apoptosis inducida por la expresión regulada de arriba ANXA1.
En el presente estudio, se evaluó la inhibición de proliferación y de promoción de la apoptosis efectos de la AGN en células DU145 de cáncer de próstata humana , junto con su mecanismo de acción. Nuestros estudios mostraron que la NAB a 1-10 mmol podría tanto inhibir la proliferación celular DU145 e inducir la apoptosis celular. La apoptosis, que es también conocida como la muerte celular programada, es un proceso fisiológico que está regulada por una serie de genes bien caracterizados y es importante para el desarrollo y la homeostasis de muchos organismos. En este estudio, se encontró que NAB puede regular a la baja expresión de Bcl-2 y un máximo de regular la expresión de Bax. Es probable que NaB induce cáncer de próstata DU145 apoptosis de las células mediante la inhibición de la expresión de bcl-2 y la activación de Bax.
Al mismo tiempo, se observó que NaB hasta reguladas la expresión de ANXA1 en las células DU145. Para determinar si la función ANXA1 es relevante para la acción NAB, hemos realizado estudios funcionales utilizando siRNA. Los resultados mostraron que la inhibición de la expresión de ANXA1 disminuyó significativamente la acción NaB de inhibir el crecimiento celular y pro-apoptosis. Por otra parte, nuestros resultados sugieren que el mecanismo de la AGN contra la apoptosis a través de la regulación de ANXA1 estaba relacionado con la vía de señalización de ERK. La inhibición de la expresión de ANXA1 podría inhibir la fosforilación de ERK1 /2, lo que indica que la expresión de ANXA1 podría activar la vía de señalización de ERK. Hasta la fecha, la expresión de ANXA1 ser hasta reguladas por NAB en el cáncer de próstata no ha sido confirmada. En nuestro estudio, hemos proporcionado alguna evidencia de que los NAP hasta regula la expresión de ANXA1 y se correlaciona con la progresión del cáncer de próstata. Estos hechos implican fuertemente que ANXA1 tiene un papel importante en la progresión del cáncer de próstata.
En conclusión, NaB exhibe anti-proliferativa y la actividad pro-apoptótica de una forma dependiente de la dosis en células de cáncer de próstata humano. Además, NaB puede aumentar la expresión de ANXA1, y ANXA1 puede aumentar la actividad de la vía de señalización de ERK. Se necesitan más estudios para revelar las interacciones definidas de ANXA1 y la vía de señalización de ERK. Los presentes hallazgos sugieren que NaB es particularmente eficaz en la inhibición de la progresión del cáncer de próstata a través de la regulación de la expresión de ANXA1.