Extracto
Antecedentes y Objetivo
El calcio se ha propuesto como un mediador de la quimioprevención del cáncer colorrectal (CCR), pero el mecanismo general que subyace a este efecto preventivo aún no está claro. Por lo tanto, se realizó este estudio para evaluar las posibles funciones y mecanismos de prevención de calcio mediada por la CRC inducida por 1,2-dimetilhidrazina (DMH) en ratones.
Métodos
Para el análisis de la expresión génica , 6 no tumorales tejidos colorrectales de los ratones del grupo DMH + calcio y 3 muestras de cada uno de los grupos de DMH y de control se hibridaron en un 4 × 44 K Agilent todo el genoma de microarrays oligo, y genes seleccionados fueron validados por cadena de la polimerasa en tiempo real reacción (PCR). Análisis funcional de los microarrays de datos se realizó utilizando KEGG y Gene Ontología (GO) analiza. Hub genes se identificaron utilizando el software Pathway Studio.
Resultados
Las tasas de incidencia de tumores en el DMH y DMH + Calcio grupos fueron del 90% y 40%, respectivamente. análisis de microarrays de expresión génica mostró que
S100A9
,
Defa20
,
MMP10
,
MMP7
,
Ptgs2
, y
Ang2
estaban entre los genes más regulación a la baja, mientras que
PER3
,
Tef
,
Rnf152
, y
Prdx6
fueron upregulated significativamente en el DMH + grupo de calcio en comparación con el grupo DMH. El análisis funcional mostró que los Wnt, ciclo celular, y las vías del ácido araquidónico se downregulated significativamente en el grupo + Calcio DMH, y que los términos de GO relacionadas con la diferenciación celular, el ciclo celular, la proliferación, la muerte celular, la adhesión y la migración de células se vieron afectados significativamente .
caja forkhead M1 gratis (
FoxM1
) y
factor nuclear kappa-B Opiniones (
NF-kB) fueron considerados como genes hub potentes.
Conclusión
En el modelo de ratón CRC inducida por DMH, mecanismos integrales tenían que ver con alteraciones complejas de expresión génica que abarca muchas vías alteradas y GO términos. Sin embargo, cómo el calcio regula estos acontecimientos aún no se ha estudiado
Visto:. Wang J-L, Lin Y-W, Chen H-M, Kong X, Xiong H, Shen N, et al. (2011) El calcio evita la tumorigénesis en un modelo de ratón de cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (8): e22566. doi: 10.1371 /journal.pone.0022566
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 13 Noviembre 2010; Aceptado: June 29, 2011; Publicado: 17 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de una beca del Ministerio de Salud Pública, China (Nº 200802094), una beca de la National Science encontrado de China (30830055) en Jing-Yuan Colmillo; y una beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n: 30900757) a Hua Xiong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La incidencia actual del cáncer colorrectal (CCR) es alta, y su pronóstico sigue siendo pobre [1]; por lo tanto, es importante idear estrategias para prevenir el desarrollo de CCR. Muchos agentes se utilizan para prevenir CRC [2]; Sin embargo, no hay consistencia en los efectos a través de agentes [3], [4], [5], y algunos agentes pueden dar lugar a efectos secundarios graves [6], [7]. Por lo tanto, un enfoque alternativo es necesario para la prevención de la CRC.
Una revisión sistémica reciente reveló que el calcio puede ser más atractivo en la prevención de la CRC en comparación con la aspirina y cribado [8]. Sin embargo, la eficacia de calcio es todavía incierto. resultados agrupados de 10 estudios de cohortes mostraron una relación inversa entre la ingesta de calcio y el riesgo de CCR [9], pero esta relación no se confirmó mediante un ensayo clínico controlado aleatorio [10]. Sin embargo, debido a las limitaciones del ensayo controlado aleatorio (ECA), por ejemplo, una dosis baja de calcio, de corta duración del seguimiento, y la influencia de la ingesta de estrógenos [11], la conclusión de la ECA no era convincente. No obstante, la efectividad del calcio en la prevención de la CRC sigue siendo controvertida [12].
Del mismo modo, el mecanismo de prevención de calcio mediada por la CRC no está aún clara. En estudios anteriores, se pensó de calcio para reducir el riesgo de CCR mediante la unión a ácidos biliares secundarios tóxicos y la formación de jabones insolubles en el lumen del colon [13], o mediante la reducción de la proliferación, la estimulación de la diferenciación, y la inducción de la apoptosis en la mucosa del colon [ ,,,0],14], [15]. Un estudio reciente sugiere que el calcio podría derogar la hiperplasia en el colon distal mediante la inhibición de un receptor de canal de calcio, es decir, receptor transitorio canal de potencial, V subfamilia, miembro 6 (TRPV6) [16]. Estos hallazgos indican que el calcio podría reducir el riesgo de CCR a través de una variedad de mecanismos, pero el mecanismo específico e integral aún no está claro. Por lo tanto, se realizó este estudio para evaluar las posibles funciones y mecanismos de prevención de calcio mediada por la CRC inducida por 1,2-dimetilhidrazina (DMH) en ratones. Creemos que nuestros hallazgos contribuirán a la investigación sobre la aplicación clínica de calcio.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Nuestro estudio fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité de la Jiao Tong-Escuela de Medicina del hospital Renji, Shanghai, china, la Universidad de Shanghai. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por el Consejo Chino de los Animales y el protocolo aprobado por el Jiao Tong-Facultad de Medicina, Hospital Renji, Shanghai, China, la Universidad de Shanghai.
Productos químicos
DMH se obtuvo de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.). alimentación normal de calcio y alto para los ratones se obtuvieron de Shanghai SLAC Laboratory Animal Company (Shanghai, China). Los principales componentes de la alimentación normal y alto de calcio fueron los mismos: proteínas, 22,1%; grasa, 5,28%; cenizas, 5,2%; fibra, 4,12%; Extracto libre de nitrógeno, 52%; fósforo, 0,92%; y Vitamina D3 6818,4 UI /kg. La concentración de calcio (en forma de carbonato de calcio) en la alimentación normal y alta en calcio era 1,24% y 3,0%, respectivamente. La alimentación de alta de calcio se ajustó mediante la adición de carbonato de calcio para obtener un contenido final de calcio de 3%. Porque pensamos que el polémico eficacia de la dieta con alto contenido de calcio en la prevención de la CRC puede ser parcialmente debido a la pequeña dosis de calcio en los estudios anteriores, por lo que decidimos utilizar el contenido de calcio más alta para probar el efecto preventivo exacto de la CRC y la tolerancia de los ratones .
Los animales experimentales
En total, 80 mujeres Slac: ratones ICR [peso, 18-20 g; grado, libre de patógenos específicos (SPF)] fueron adquiridos de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China). Se mantuvieron a temperatura ambiente (22 ° C) con una humedad relativa de 60% y 12 horas de luz /oscuridad ciclos; se suministraron una dieta estándar de laboratorio y agua potable. Los ratones se dividieron al azar en 4 grupos (20 ratones en cada grupo): grupo control, grupo E, del grupo DMH + Calcio, y el grupo de calcio. Los ratones del grupo de control se les proporcionó alimento normal y recibió inyecciones subcutáneas de solución salina normal; los del grupo DMH se les proporcionó alimento normal y recibieron inyección subcutánea de DMH a una dosis de 20 mg /kg una vez por semana durante 20 semanas; los del grupo de calcio + DMH se les proporcionó alimentación alta en calcio y recibieron inyección subcutánea de DMH a una dosis de 20 mg /kg una vez por semana durante 20 semanas; los del grupo de calcio fueron proporcionados alimentación alta en calcio y recibieron inyecciones subcutáneas de solución salina normal. Los ratones fueron sacrificados al final de las 24 semanas, y se examinó la incidencia de CCR en cada grupo. Este método ha sido descrito en detalle en nuestro estudio anterior [17]. En breve, las incisiones longitudinales se hicieron en los tejidos colorrectales para observar el número de tumores brutos. Después de entonces, los tumores brutos fueron retirados por separado y los tejidos colorrectales de espesor completo se cutted por la mitad por el eje longitudinal. Algunas de las muestras de tumor recién obtenidos junto con su medio no tumoral tejidos colorrectales se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido correspondiente. Las muestras restantes se fijaron en solución de formalina y embebidos en bloques de parafina para el análisis patológico e inmunohistoquímica.
El análisis histológico
Para el análisis histológico, de 4 micras de espesor secciones de fijado en formol, parafina se prepararon tumores de colon embebidas. Después de hematoxilina y eosina, secciones de cada tumor se examinaron bajo un microscopio de luz (Olympus, Japón). Los resultados fueron confirmados por el patólogo Chen XY.
extracción de ARN, el etiquetado, la hibridación y el análisis
Total ARN a partir de 12 tejidos no tumorales colorrectales [3 del grupo de control, desde el 3 grupo DMH, 6 del grupo de calcio DMH + (entre el 6 de entre el grupo + calcio DMH, 3 eran de ratones con tumores y 3 eran de ratones sin tumores)] se recogieron usando TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El contenido de ARN se midió utilizando un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000, y se llevó a cabo la electroforesis en gel desnaturalizante. A continuación, las muestras se amplificaron, marcaron utilizando el kit de marcaje de Agilent Amp rápida, y se hibridaron utilizando la totalidad del genoma de microarrays Agilent oligo (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) mediante el uso de cámaras de hibridación Agilent SureHyb. Después de la hibridación y el lavado, los portaobjetos procesados fueron escaneadas con el escáner Agilent DNA microarray utilizando la configuración recomendada por Agilent Technologies.
Los archivos de texto que resultan extraídos de la extracción de características de software Agilent (versión 10.5.1.1) se importaron en el software Agilent GeneSpring GX (versión 11.0) para su posterior análisis. la intensidad de fondo ha sido cortado antes de la normalización. Los conjuntos de datos de microarrays se normalizaron en GeneSpring GX utilizando el escenario de un solo color de Agilent FE (normalización principalmente mediana). Genes expresados diferencialmente se identificaron mediante la determinación del factor de cambio (FC) y los valores de p de
t-test
. Los genes con un FC de ≥1.5 y un valor p de ≤0.05 entre 2 grupos fueron identificados como genes expresados diferencialmente. Análisis funcional de los genes expresados diferencialmente se realizó a través de ontología de genes (GO) (http://www.geneontology.gov/) [18] y la base de datos KEGG vía (http://www.genome.jp/kegg/pathway. html). Hub genes fueron identificados con Pathway Studio (Ariadna Genómica) [19].
En tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa
La transcripción inversa se realizó usando cebadores oligo (dT) y transcriptasa inversa Superscript II (Takara ). La cuantificación de la expresión génica se realizó usando un kit de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) (Takara). El nivel de expresión de 18 s de rRNA se utilizó como control interno. Se analizó la expresión de los genes siguientes:
S100A9
,
Defa20
,
MMP10
,
Ptgs2
,
PER3
,
Tef
,
Rnf152
, y
Prdx6
. Los primers se enumeran en la Tabla 1.
La inmunohistoquímica
Cuatro micrómetros de espesor secciones de tejidos de colon, no tumorales incluidas en parafina fijadas con formalina se deparaffinized y rehidratada. El método de reparación de microondas se utiliza para la recuperación de antígenos. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de las secciones con peróxido de hidrógeno 0,3% durante 10 min. antígeno no específica fue bloqueada por incubación de las secciones con suero de oveja durante 30 min. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada con monoclonal de conejo anti-β-catenina (Cell Signaling Technology,#9562) a una dilución de 1:200. Anti-IgG de conejo se utilizó como anticuerpo secundario (30 min de incubación). Diaminobencidina se utilizó como cromógeno y las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Las muestras se incubaron con PBS en lugar del anticuerpo primario se utilizaron como controles negativos.
El análisis estadístico
Los resultados de los experimentos con animales y en tiempo real PCR fueron analizados utilizando el software SAS 9.2 (SAS Institute Inc. ESTADOS UNIDOS). Los datos se presentan como medias ± SD. Estudiante de
t-test
se utilizó para comparar los valores entre los 2 grupos independientes.
Resultados
Los experimentos con animales
Los principales resultados de los experimentos con animales se muestran en la Figura 1. Se indujo con éxito CRC en ratones usando DMH (Figura 1A). La mayoría de los cánceres fueron identificados como adenocarcinomas por análisis histológico (Figura 1B, 1C). En los + grupos de calcio DMH y DMH, la incidencia del tumor fue de 90% y 40% (Figura 1D), el número medio de tumores por ratón era 5,39 ± 1,97 y 3,0 ± 1,31 (Figura 1E), y la media de diámetro máximo de los tumores fue 6,44 ± 1,72 y 2,63 ± 1,19 (Figura 1F), respectivamente. No se encontró tumor en los grupos de control y de calcio. Crecimiento y desarrollo de los ratones en el grupo de calcio no se vieron afectados significativamente, y el examen patológico de sus riñones, corazón, pulmones, hígados y bazos no revelaron anormalidades obvias (datos no mostrados).
A.
Observación de los tumores en el intestino grueso de los ratones después del sacrificio a las 24 semanas.
B Opiniones (× 200) y
C gratis (× 400). La mayoría de los tumores se confirmaron como los adenocarcinomas por el examen patológico.
D
. la incidencia de tumores entre los 4 grupos.
E
. Tumor número /ratones entre los 4 grupos.
F
. diámetro tumoral máximo entre los 4 grupos (control: grupo de control, recibió alimentación normal y la inyección de sodio normales durante 20 semanas; DMH: grupo E, recibió alimentación normal y la inyección de DMH durante 20 semanas; DMH grupo + Calcio: recibió alta en calcio alimentar y la inyección de DMH durante 20 semanas, el grupo de calcio: recibió alimento con alto contenido de calcio y la inyección de sodio normal para 20 semanas). *
valor de p
. & Lt; 0,05 entre el grupo DMH + Calcio y el grupo DMH
perfil
La expresión génica de análisis de microarrays
Todos los tejidos del colon 12 despejaron el paso de control de calidad y se analizaron como se describe en la sección Métodos. Se llevó a cabo el análisis de microarrays entre el grupo de control (3 muestras), grupo E (3 muestras), y el grupo DMH + Calcio (6 muestras). También se compararon los niveles de expresión génica entre las muestras con o sin tumores en el grupo DMH + Calcio.
análisis de agrupación jerárquica de los datos de expresión matriz 12 mostró un perfil de expresión homogénea entre las muestras de cada grupo (Figura S1 ). Al establecer el filtro para la FC a ± 1,5 y el valor p en ≤0.05, se encontró que la expresión de 12395 genes se alteró significativamente en el grupo DMH en comparación con aquellos en el grupo control (ver Tabla S1), y el de 1508 genes se alteró de manera significativa en el grupo de calcio DMH + en comparación con los del grupo de DMH (ver Tabla S2). En comparación con la Tabla S1 y S2 tabla, se encontró que la expresión de 549 genes cuyos cambios debidos al tratamiento DMH podría ser revertido por calcio en la dieta (ver Tabla S3). En la Tabla 2, se muestran los 30 genes expresados diferencialmente más, la mayoría de los cuales están estrechamente relacionados con la tumorigénesis, como
S100A9 gratis (proteína de unión de calcio-S100 A9 [calgranulina B]),
Defa20
(alfa defensinas 20),
MMP10 gratis (metaloproteinasas de matriz 10),
Ang2 gratis (angiogenina, ribonucleasa A la familia, elemento 2),
PER3 gratis (periodo homólogo 3) ,
Tef gratis (tirotrópicos factor de embriones), y
Ptgs2 gratis (ptgs2). A los 8 genes seleccionados, es decir,
S100A9
,
Defa20
,
MMP10
,
Ptgs2
,
PER3
,
Tef
,
Rnf152
, y
Prdx6
, los resultados obtenidos a partir del análisis de microarrays fueron confirmados por PCR en tiempo real (Figura 2). Se seleccionaron estos genes para la confirmación de la PCR, ya que están estrechamente relacionados con la tumorigénesis y la investigación aún más la pena.
Se utilizó 18 s rRNA como un control interno. la expresión del ARNm relativa se calculó según el método -ΔΔT 2
. Los datos son la media de 10 muestras ± SD. Control, nivel de expresión génica en el tejido normal del colon de los ratones en el grupo control; DMH, el nivel de expresión génica en el tejido de colon no tumoral de los ratones en el grupo DMH; DMH + calcio, el nivel de expresión génica en el tejido de colon no tumoral de los ratones en el grupo de calcio + DMH; El calcio, la expresión génica en el tejido de colon no tumoral de los ratones en el grupo de calcio. *
P
valor & lt; 0,05 entre el grupo DMH + Calcio y el grupo DMH; §
P
valor. & Lt; 0,05 entre el grupo de calcio y el grupo de control
Para determinar si las vías biológicas específicas o grupos funcionales de genes diferencialmente fueron afectados por la dieta alta en calcio, que analizado nuestro conjunto de datos de microarrays (sobre la base de los resultados mostrados en la Tabla S3) utilizando el software GO y KEGG. Los resultados detallados se muestran en la Tabla S4 y S5 Tabla. Al establecer el valor p en ≤0.05, encontramos regulación a la baja significativa de 39 vías de señalización, incluyendo algunas vías relacionadas con el tumor como la vía del ciclo celular, vía de señalización Wnt, factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y la vía de señalización, y el factor de crecimiento transformante ( TGF-β) vía de señalización. Las vías más enriquecidos se muestran en la Tabla 3. Se utilizó la inmunohistoquímica para detectar la expresión de la proteína y la distribución de β-catenina, la molécula de núcleo en la ruta de Wnt, y encontramos que su expresión fue significativamente mayor en la mucosa del colon no tumoral de la grupo DMH que en el del grupo de control, sin embargo, su expresión en el grupo de calcio + DMH se redujo notablemente en comparación con el grupo DMH (Figura 3). En total, 703 GO términos, incluyendo GO términos relacionados con el tumor como la diferenciación celular, la proliferación celular, la apoptosis, la angiogénesis, la adhesión celular, ciclo celular y la división celular, se modificaron significativamente
Control, grupo de control.; DMH, grupo E; + El calcio, el DMH + Calcio grupo DMH; El calcio, el grupo de calcio.
También se utilizó el software Pathway Studio para filtrar los genes de cubo que pueden desempeñar un papel clave en la prevención de calcio mediada por la CRC (Tabla 4). De ellos, se seleccionaron 2 genes para construir redes de genes (Figura 4). Sobre la base de las redes, pudimos determinar claramente las funciones básicas de los genes hub
Los genes expresados diferencialmente regulados por los 2 genes cubo (A,
FoxM1
;. B,
NF-B) se muestran en forma de diagrama de red. coloración verde o rojo, secuencias que son downregulated o upregulated en el grupo de calcio DMH + en comparación con el grupo DMH, respectivamente. La intensidad del color es proporcional a la magnitud del cambio.
Además, se compararon aún más los niveles de expresión génica entre los ratones del grupo DMH + Calcio con /sin tumores y se encontró que los niveles de expresión génica de la mayor parte de los genes seleccionados anteriores en los ratones del grupo DMH + calcio con tumores fue de entre los del grupo DMH + calcio sin tumores y los del grupo DMH (véase la Tabla S6 y la Figura S1). También se encontró que la expresión de algunos transportadores de calcio fue diferente entre los ratones del grupo DMH + Calcio con /sin tumores. Por ejemplo, la expresión de TRPV6 y TRPV3 se upregulated significativamente en los ratones del grupo de calcio DMH + con tumores en comparación con los que no tienen tumores; Sin embargo, la expresión de plasmalemmal Ca
2 + -ATPasa (EPCP) fue significativamente downregulated.
Discusión
En este estudio, se utilizó el modelo de ratón CRC inducida por DMH que muestra fenotípica y las características genotípicas similares a los observados en humanos CRCs esporádicas y, por tanto, se pueden aplicar para estudiar la prevención de la CRC [20]. En este estudio, hemos encontrado que la incidencia de CRC disminuyó significativamente en los ratones alimentados con una dieta alta en calcio, lo que indica un papel claro de calcio en la prevención de la CRC. Nuestros resultados son consistentes con muchos otros estudios. Pence [21] han encontrado que las ratas en la dieta alta en calcio tienen una disminución de la incidencia de CCR en comparación con la dieta baja en calcio (86% vs. 53%), Salas [22] también se observó una disminución significativa en el número de tumores y una disminución en la incidencia CRC en el grupo alimentado con la dieta de calcio de alta (97% vs. 64%). Sin embargo, algunos estudios han observado diferentes resultados. Sitrin [23] encontró que ni la administración de suplementos de calcio por sí solo, ni suplementos de calcio junto con la deficiencia de vitamina D alteran la incidencia de CCR inducido por DMH, Mølck [24] incluso encontró una mayor incidencia en las ratas alimentadas con dieta alta en calcio. Pensamos que las diferencias en la cepa animal, la edad del animal, ambiente de crianza, la dieta base, dosis DMH y la duración de la inyección, la concentración de calcio, el tiempo de intervención de calcio puede explicarse las diferencias en los resultados de diversos estudios que utilizan altos de calcio. La eficacia preventiva confirmado de CRC con dieta alta en calcio sin embargo, no se pudo contener de esos estudios. Creemos que se puede deber a las pequeñas dosis de calcio en esos estudios. Así que usamos mayor contenido de calcio (3%) en la alimentación para probar el efecto preventivo de la CRC y la tolerancia a los ratones. De hecho, esta alimentación alta en calcio mostró un buen efecto preventivo de la CRC en nuestro experimento y sin efectos adversos obvios se encontró en ratones. Además, no se encontró tumor en los grupos de calcio. El crecimiento y desarrollo de los ratones en el grupo de calcio no se vieron afectadas significativamente, y el examen patológico de los riñones, corazones, pulmones, hígados y bazos no revelaron anormalidades obvias, la expresión de la mayoría de los genes seleccionados confirmadas por PCR en tiempo real en el grupo de calcio era igual a la del grupo de control. Estos hallazgos indican que esta dieta alta en calcio es seguro para los ratones.
A continuación, se utilizó el análisis de genes perfil de expresión de microarrays para determinar el mecanismo de prevención de calcio mediada por la CRC. A lo mejor de nuestro conocimiento, esta es la primera investigación para utilizar la tecnología de microarrays para el estudio del papel de la dieta alta en calcio en la prevención del CCR.
Cuando la FC se establece en ≥1.5, los cambios en 549 genes que eran el resultado del tratamiento DMH podría revertirse con calcio en la dieta.
S100A9
es el gen más regulados a la baja; su producto es un citoplasmática de Ca
2 + -la proteína de unión. Aunque extracelular S100A9 podría inducir la apoptosis mediante la unión a un receptor y causa aún desconocido dimerización de Bax y Bak y su translocación a la mitocondria que conducen a daño mitocondrial [25], su expresión en las células epiteliales de hecho podría inducir la proliferación celular mediante la activación de la phosphoinositide 3- quinasa vía de supervivencia (PI3K) -Akt-NF-kappa B, que se asocia con la tumorigénesis [26]. Además, S100A9 es una importante citoquina proinflamatoria implicada en la inmunidad innata, y se ha encontrado su expresión a ser elevados en numerosas condiciones patológicas asociadas con la inflamación [27]. Muchas otras citoquinas inflamatorias, tales como Defa, también fueron regulados a la baja de manera significativa [miembros de la familia de la defensina fueron regulados a la baja en los diferentes niveles:
Defa-RS2 gratis (FC = -9,88),
Defa20 gratis (FC = -8,16)]. El factor de necrosis tumoral (
Tnf-
) y sus receptores fueron también downregulated en diferentes niveles:
Tnf- gratis (FC = -1.87),
TNFRSF11B gratis (FC = -5,98),
Tnfrsf19 gratis (FC = -2,27). Varios otros estudios realizaron con el DMH o azoximetano (AOM) inducida modelo de CRC también encontrado altos niveles de expresión de S100A9 y Defa en los tejidos tumorales [28], [29]. Las citoquinas inflamatorias juegan un papel importante en la inmunidad innata y adaptativa; Sin embargo, esas citoquinas elevadas también están implicados en la iniciación del tumor, promoción, y la invasión [30], [31], [32], [33], y por lo tanto, juegan un papel importante en la inflamación asociada a la carcinogénesis [34].
MMPs son una familia de metaloproteinasas de la matriz que pueden desempeñar un papel importante en el microentorno del tumor [35]. Muchos miembros de la familia MMP fueron regulados a la baja de manera significativa en el grupo E de calcio [
MMP10 gratis (FC = -9,47),
MMP13 gratis (FC = -9.1),
MMP7
(FC = -7,07), y
MMP11 gratis (FC = -1,56)]. Otras metaloproteinasas también fueron regulados a la baja, como
ADAM8
y
ADAM10
, que fueron downregulated de 2,08 y 1,6 veces, respectivamente. Estudios recientes han demostrado que muchos de los miembros de la familia MMP y ADAM podrían desempeñar varios papeles en la tumorigénesis. Por ejemplo,
MMP7
podría escindir el ligando de Fas, lo que reduce el impacto de la quimioterapia en el tumor, mediante la anulación de la apoptosis [36].
ADAM10
puede desencadenar la liberación del factor de crecimiento epidérmico soluble (EGF), mediar en el derramamiento de la E-cadherina, la translocación de β-catenina en el núcleo, y por lo tanto, conducir la proliferación celular [37]. Sin embargo, el papel más importante de los miembros de la familia MMP y ADAM promueve la invasión tumoral y metástasis mediante la degradación de la matriz extracelular [38], [39]. Estos resultados indican que una dieta alta en calcio puede desempeñar un papel importante en la inhibición de la invasión y metástasis de CRC. Debido
in vitro
estudios demostraron que, en CRC células, la expresión de E-cadherina podrían ser inducidos por el aumento de la Ca extracelular
2 + concentración [40], el calcio puede ser considerado para suprimir la transición epitelial-mesenquimal (EMT) para inhibir la metástasis de CCR.
PER3
era el gen más regulada positivamente en nuestro estudio, que pertenece a los genes de época. Esos genes son elementos básicos de los circuitos de retroalimentación de la traducción de la transcripción /que generan el ritmo circadiano endógeno, y
PER3
participa en el cronometraje en la pituitaria y el pulmón [41]. Estudios recientes han sugerido que los genes circadianos participan en el crecimiento y desarrollo de diversos tipos de cáncer, y los genes de época ahora se han relacionado con las vías de respuesta al daño del ADN, la inhibición del crecimiento de células cancerosas, y el aumento de la tasa de apoptosis [42]. El estudio de Oshima ha demostrado que la expresión de
PER3
en los tejidos de CRC era significativamente más bajo que en la mucosa normal adyacente, lo que sugiere que
PER3
puede funcionar como un gen supresor de tumor [43].
Tef
fue el segundo gen más regulada positivamente en nuestro estudio. Pertenece a la PAR-dominio cremallera de leucina básica (PAR bZip) factores de transcripción y está implicado en la desintoxicación y el metabolismo de drogas [44] y en el mantenimiento de la forma celular en fibroblastos [45]. También sirve como un gen de pro-apoptóticos mediante la promoción de la expresión de bcl-gs o bik [46], [47]. Muchos otros genes también se upregulated, por ejemplo,
Rnf152
y
Prdx6
.
Rnf152
es una proteína con dedos novela anillo y se ha demostrado que tienen actividad pro-apoptótica [48].
Prdx6
es un miembro de la familia PRDX, asociados con funciones tales como la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis, ejecutando así la actividad anti-cáncer [49].
Mediante el uso de análisis de la vía, se se encontró que la vía de Wnt se vio afectada de manera significativa. Aunque la expresión del factor inhibidor de Wnt
WIF1
fue significativamente downregulated, la de muchos genes asociados con la vía de señalización de Wnt y su objetivo genes se downregulated [es decir,
TCF7
,
Myc
,
ciclina D1 gratis (
CCND1
), y
MMP7
en el FC de -1.53, -1.61, -1.62, -7.07 y, respectivamente]. La expresión de la proteína de β-catenina se redujo significativamente en el grupo de calcio + DMH, lo que sugiere que la vía de Wnt se downregulated en este grupo. Esto es consistente con los resultados anteriores [28], [50]. Curiosamente, la vía del ciclo celular también se inhibió significativamente en el grupo DMH + Calcio, con muchos genes en esta vía se downregulated consistentemente, es decir, las ciclinas
CCNB1
y
CCND1
se downregulated por 1,79 y 1,62 veces, respectivamente, y la expresión de la quinasa dependiente de ciclina
Cdk1
se redujo en 1,66 veces.
Entre las vías metabólicas, las vías del ácido araquidónico se inhibieron significativamente en el DMH + grupo de calcio. Muchas enzimas en esta vía mostraron una expresión reducida, por ejemplo, Ptgs2, también conocida como ciclooxigenasa-2 (COX-2), se redujo en 3 veces. La ruta del ácido araquidónico se activa durante la inflamación, lo que lleva a la síntesis de prostaglandinas y tromboxano, que desempeñan un papel importante en la respuesta inflamatoria [51]. Además, la enzima clave en esta vía, Ptgs2 (COX-2), juega un papel importante en la iniciación de CRC. COX-2 sobreexpresión fue demostrado que se correlaciona con la carcinogénesis en más de 80% de CRC [52]. En modelos animales, se descubrió que la COX-2 expresión a ser suficiente para inducir la tumorigénesis [53]. El mecanismo puede estar relacionada con la activación de la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) y la señalización para promover la formación de nuevos vasos sanguíneos [54] VEGF. Sobre la base de la conclusión de que la expresión de las citoquinas inflamatorias S100A9, Defa, TNF y receptores de TNF también se downregulated significativamente en el grupo DMH + Calcio, se especuló que el calcio puede desempeñar un papel importante en la reducción de la tumorigénesis relacionada con la inflamación.
Entre los genes derivados de cubo-Studio Camino, que pueden jugar un papel clave en la prevención de calcio mediada por la CRC,
FoxM1
,
NF-kB
, etc., eran también en cuestión. FoxM1 pertenece a una familia de reguladores transcripcionales evolutivamente conservadas que se caracteriza por la presencia de un dominio de unión a ADN conocido como el dominio de caja forkhead. De la expresión de FoxM1 se observó en muchos tipos de cánceres humanos [55]. FoxM1 puede jugar un papel importante en la proliferación celular y la apoptosis [56]. El mecanismo molecular que subyace a la inducción mediada por la señalización FoxM1 del crecimiento del tumor no ha sido completamente dilucidado. Sin embargo, múltiples vías oncogénicas tales como PI3K /Akt, NF-kB, señal extracelular regulada quinasa (ERK), activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK), el VEGF, especies reactivas de oxígeno (ROS), c-myc, y inducible por hipoxia factor de (HIF) -1 se ha informado de interactuar con señalización FoxM1; esto sugiere que la interacción entre FoxM1 de señalización y otras vías de señalización puede jugar un papel importante en la tumorigénesis [57]. Cabe señalar que la expresión de muchos genes regulados por NF-B mostró una expresión alterada en el grupo DMH + Calcio, por ejemplo,
TNF
,
PTGS2
,
MYC
,
CCND1
,
relacionado con ETS-1 gen gratis (
ERG1
),
S100A9
, y
el factor potenciador linfoide 1