Extracto
La aneuploidía con inestabilidad cromosómica es un sello distintivo del cáncer. Hemos estudiado el cromosoma 7 (CHR7) la variación del número de copias (CNV) en gliomas y en cultivos primarios derivados de ellos. Encontramos la heterogeneidad del tumor con células que tienen CHR7-CNV ocurre comúnmente en los gliomas, con un mayor porcentaje de células en gliomas de alto grado que lleven más de 2 copias de CHR7, en comparación con gliomas de bajo grado. Curiosamente, todos los tipos de células CHR7-aneuploides en la cultura parental de líneas celulares de glioma establecidos reaparecieron en subcultivos derivadas de una sola célula. a continuación, se caracterizó la biología de las tres culturas de glioma singénicos dominadas por diferentes tipos de células CHR7-aneuploides. Encontramos divergencia fenotípica de las células siguientes CHR7 mala segregación, que se benefició del crecimiento tumoral general
in vitro
y
in vivo
. La modelación matemática sugiere la implicación de la inestabilidad cromosómica y las interacciones entre las subpoblaciones de células en el restablecimiento del equilibrio óptimo de los tipos de células tumorales. Tanto nuestros datos experimentales y los modelos matemáticos han demostrado que la complejidad de la heterogeneidad del tumor podría ser mejorada por la existencia de cromosomas con las anomalías estructurales, además de sus erróneas segregaciones. En general, nuestros resultados muestran, por primera vez, la participación de la inestabilidad cromosómica en el mantenimiento de la heterogeneidad del tumor, lo que subyace en el aumento del crecimiento, la persistencia y la resistencia al tratamiento de los cánceres
Visto:. Hu Y, Ru N, H Xiao , Chaturbedi A, Hoa NT, Tian XJ, et al. Cromosoma (2013) específico de tumor mala segregación Controles cáncer plasticidad mediante el mantenimiento de la heterogeneidad del tumor. PLoS ONE 8 (11): e80898. doi: 10.1371 /journal.pone.0080898
Editor: Anita B. Hjelmeland, Clínica de Cleveland, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de mayo de 2013; Aceptado: 17 de octubre de 2013; Publicado: 25 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Hu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la UC Irvine fondos de configuración y un generoso regalo de popa de la familia (YHZ y ML), subvenciones proporcionadas por el Comité de la Universidad de California de Investigación del cáncer de Coordinación, Comité de Irvine UC de Investigación, Centro de cáncer del Fondo Semilla (Número Premio P30CA062203 de la Nacional del cáncer Instituto), Fundación para Musella tumor cerebral Investigación & amp; Información, y la Voz Contra el Cáncer Cerebral (YHZ), la Fundación Nacional de Ciencia DMS-0969417 (JX), VA Mérito de la opinión Grant (MRJ). Zhenyu Jia es parcialmente apoyado por el Colegio Normal de Guizhou, Guiyang, China, QKHJ [2013] 2238. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Liping Yu es un empleado de Ziren Research LLC, Irvine, CA, EE.UU.. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en el intercambio de datos y materiales.
Introducción
Según la hipótesis de la evolución clonal inicial Nowell [1], el desarrollo del cáncer es un proceso evolutivo y proceso ecológico, en muchos aspectos se asemejan a la evolución darwiniana [2]. Esta hipótesis está apoyada por la predicción de la progresión tumoral con la diversidad clonal genética en el adenocarcinoma esofágico [3], y ahora ha sido ampliamente aceptada como una explicación para la heterogeneidad tumoral observado en la mayoría de tipos de cáncer en el momento del diagnóstico clínico, en el original y metastásico sitios [4], [5]. El concepto de cáncer como un proceso evolutivo, con tumores que tienen genéticamente y fenotípicamente diversa subpoblaciones de células es coherente con el reciente modelo de cáncer de células madre, lo que enfatiza la importancia de cáncer que tiene un tipo de célula capaz de generar otros tipos de células de una manera unidireccional [6 ] - [9]. Sin embargo, el hallazgo de fenotípica inter-conversión entre tres subpoblaciones de células dentro de líneas celulares de cáncer de mama, lo que lleva a un equilibrio de la población de células [10] reveló la capacidad del cáncer para recuperar la diversidad biológica de algo más que la subpoblación de células madre similares. Tal capacidad de recuperar las condiciones de equilibrio después de una perturbación es un rasgo característico de un ecosistema establecido y bien equilibrada. La pregunta es si, y cómo, la transición fenotípica de las células cancerosas se manifiesta como una característica hereditaria.
La acumulación de evidencia apoya la noción de que los errores de mitosis causa inestabilidad cromosómica, lo que impulsa la evolución del cáncer, con la selección natural que actúa a nivel de la ecología del cáncer para evitar el caos citogenética. Al parecer, la distribución no aleatoria de las ganancias y pérdidas cromosómicas visto en determinados tipos de tumores es un efecto combinado de la inestabilidad cromosómica y la selección de fenotipos específicos de entre los cambios masivos del transcriptoma [11] - [15]. Los gliomas son tumores cerebrales malignos primarios que tienen de los astrocitos y /o características oligodendrogliales de diversa malignidad. El grado más alto, por desgracia, el glioma más comúnmente visto, es glioblastoma multiforme (GBM, grado IV), el comportamiento morfológicamente, genéticamente y citogenéticamente heterogénea, y uniformemente fatal debido rápida su proliferación celular y fuertemente invasiva [16] - [19]. Se sabe que la alteración del cromosoma 7 (CHR7) el número de copias se presenta tanto en gliomas de alto y bajo grado y que estos cambios parecen estar asociados con fenotipos invasivos y de proliferación celular [20] - [24]. Aquí mostramos estudios de diversidad celular aneuploidía relacionada CHR7 y el papel de CHR7 mala segregación (CHR7-MS) en el mantenimiento de la diversidad fenotípica de las subpoblaciones de células de glioma, lo que genera un efecto sinérgico sobre el crecimiento tumoral global.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Congelados y muestras de glioma frescas fueron proporcionados por el Banco de Tejidos de la Universidad de California, Irvine y la Universidad de Arkansas para las Ciencias médicas, con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional.
trabajo con animales y subcutánea (sc) e intracraneal (sc) xenoinjertos
El trabajo con animales fue aprobado por Cuidado de animales y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de California, Irvine. Para los estudios que utilizan intracraneal (ic) xenoinjertos, células de glioma (1 × 10
5/3 l de DMEM /F12) se inyectaron en el lóbulo frontal de 4-6 semanas de edad, de sexo femenino, ratones desnudos (tinción NCrNu-M, Taconic , Hudson, Nueva York), después de aprobado por el IACUC procedimientos quirúrgicos. Después de combustión interna la implantación, los ratones se observaron diariamente y se pesaron periódicamente para detectar signos moribundas (postura jorobada, marcada pérdida de peso y el deterioro de la marcha). Los ratones fueron sacrificados cuando desarrollaron síntomas de daño cerebral (ataxia, hemiparesia, etc.) y /o pérdida de peso corporal de 20%, y al día siguiente fue récord como la fecha de supervivencia para el análisis de supervivencia.
Para los estudios que utilizan subcutánea (sc) xenoinjertos, las células (1 × 10
6 células /50 l DMEM /F12) se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos, anterior a su derecha e izquierda muslos, en ambos lados. medidas de los tumores se tomaron cada 3-4 días después de la implantación, y el volumen del tumor se calculó usando la fórmula V = (L * W
2) /2 (L, longitud; W, ancho). Los ratones fueron sacrificados en un momento predeterminado del volumen del tumor experimento o cuando excede 1,5 cm
3.
Glioma cultivos primarios y líneas celulares
tejidos de glioma humano frescas se disociaron enzimáticamente (0,05% tripsina-EDTA durante 30-45 min a 37 ° C), se rompen mecánicamente (que pasa a través de una pipeta de vidrio en DMEM /F12 que contiene 0,10 mg /ml de DNasa y 10% de suero), y se cultivaron en tanto recubierta con colágeno (3-4 g /cm
2) placas de cultivo en DMEM /F12 suplementado con 5% de suero fetal bovino, designado como adherente suero (SA) las condiciones de cultivo, y agar (1%) - recubierto placas de cultivo en DMEM /F12 suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF, 20 ng /ml), factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF, 10 ng /ml), y 1-5% B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), designado como condiciones de cultivo esfera neural (NS). Las esferas de glioma multicelulares formados en condiciones de cultivo NS fueron pasados a la fibronectina (1 g /cm
2) placas revestidas en el mismo medio de cultivo antes de la congelación o someter a análisis FISH.
Las líneas celulares de glioma humano ( A172, LN229, LG11, T98G, U251 y U87) se obtuvieron del Departamento de Neuro-Oncología, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center. Los perfiles genéticos (marcadores STR-7 proporcionadas por IDEXX Radil, Columbia, MO) utilizado en este estudio fueron idénticos o muy similares a los perfiles genéticos reportados para cada línea celular (Tabla S1). A172 informó aquí fue nombrado originalmente como D54, sino que lleva a los perfiles genéticos que sugieren una variante de la A-172 reportado por la American Type Culture Collection (ATCC). U251 aquí presentados fue nombrado originalmente como U251HF, con el perfil genético sugiere una variante de U251, U251 en comparación con el NCI-60 línea celular de cáncer panel. Las comparaciones de variantes U251 (Tabla S2) se proporcionaron por Beth Bauer (IDEXX Radil).
Todas las líneas celulares de glioma (parentales) se cultivaron en condiciones de SA. Los derivados clones SA y NS se establecieron a partir de colonias individuales formadas en agar blando 0,3% en la parte superior de una capa de agar inferior (0,5%) en DMDM /F12 suplementado con suero bovino 5% o EGF /bFGF /B27 como para cultivos NS, recogido por una pipeta de vidrio, y ampliado en SA o NS condiciones. Para U251 las mismas mutaciones homocigóticas de PTEN [E242fs * 15 (723 724 insTT)] y TP53 (R273H) en los padres y SA y NS-subculturas fueron identificados por Mariam Youssef, Nirvi Shah y Anthony Wong (UC Irvine).
fluorescencia de hibridación in situ (FISH)
diapositivas Metafase propagación se obtuvieron mediante la exposición de 80% de células que crecen a confluently nacadozole solución (100 mg /ml final, Sigma) durante 1 hora. A continuación, las células se tripsinizaron (0,25% de tripsina /EDTA, Invitrogen) para recoger gránulos de células, que se trataron con una solución hipotónica (tampón fosfato) durante 5 minutos a 37 ° C. Los sedimentos de células se fijaron (metanol: ácido acético glacial = 3:01) durante al menos 30 minutos. Por último, las suspensiones celulares se dejaron caer sobre portaobjetos para obtener extensiones de cromosomas en metafase. El B-bandas estándar fue hecho para las diapositivas, ya que se realizaron como tratamiento (mismo tiempo) con tripsina, y se tiñeron con colorante de Giemsa (Invitrogen). FISH se realizó en metafase para untar y secciones congeladas de tumores (7 micras) utilizando ADN marcado con fluorescencia directa de la sonda con kits X Reunión del CPA /cepy, EGFR /CEP 7 y PTEN /CEP10 (Abbott Molecular Inc. de Des Plaines, IL). La hibridación, el lavado y la contratinción se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 250-300 células por muestra se contaron bajo un microscopio de fluorescencia con una lente de 100 ×.
infección Lentivirus
lentivirus infecciosa fue producido por co-transfección del plásmido lentiviral vector pGIPZ-vacío y pTRIPZ -Empty (Open Biosystems) con el empaquetado plásmido psPAX2 y sobre del plásmido pCMV-VSVG en células HEK-293T, siguiendo el protocolo del fabricante.
análisis de inmunofluorescencia de ic xenoinjertos
Las criosecciones (7-8 micras) de cerebros de ratones con combustión interna xenoinjertos fueron montadas para la observación directa de la fluorescencia expresada por el PP y las células tumorales GFP-etiquetados utilizando 2 × 20 × y lentes de un microscopio de fluorescencia Keyence BZ8100, después de la tinción nuclear con DAPI. cryosections adyacentes fueron sometidos a análisis de inmunofluorescencia usando conejo 15 mg /ml IMC1 (ab38432, Abcam), 15 mg /ml del ratón CD133 (130-090-422, Miltenyi Biotec), 10 mg /ml del ratón CD31 (CBL1337, Chemicon), 15 g /ml GFAP cabra (sc-6170, Sana Cruz), 10 mg /ml Melk conejo (A01390, GenScript), y 15 mg /ml del ratón SPARC (sc-73051, Sana Cruz) anticuerpos primarios, seguido de anticuerpo secundario apropiado, burro anti-ratón, conejo, rata, o una cabra Alexa Fluor 350 (azul), Alexa Fluor 488 (verde), y Texas Red (Invitrogen), siguiendo el proceso de inmunofluorescencia como se describe anteriormente [25]. Las secciones de tejido se montaron con el reactivo antifade prolongar Gold (Invitrogen), se ve con una lente de un microscopio de fluorescencia 40 × y fotografiada con una cámara de punto. imágenes co-localización se adquirieron y se analizaron usando un Nikon dos láser (HeNe y argón) PCM 2000 sistema confocal en un Eclipse E800 microscopio con 100 × _ENREF_20 objetivo (Melville, NY).
Neural vástago ensayo de diferenciación de células
células de glioma (5-10 × 10
3) mantenida en condiciones de cultivo esfera neurales fueron sembradas en 8 pocillos desliza pre-recubiertas con fibronectina (10 ng /ml) para el cultivo durante la noche en medio original ( indiferenciación), o en poli-L-lisina (15 mg /ml pozos) revestidos en DMEM /F12 que contiene 1% de FBS durante 7-10 días de cultivo (diferenciación); Se añadió un volumen de medio de medio fresco cada 3 días, antes de la fijación para los análisis de inmunofluorescencia. Las células fueron fijadas con PFA al 4% y se bloquearon con suero de burro 10%. Los anticuerpos primarios de conejo (nestina (1:1000) de Millipore (AB5922), MAP2 ratón (1:200) de Abcam (ab11267) y GFAP cabra (1:300) de Sana Cruz (SC-6170), ratón beta tubulina III (1:200) de ChemCon (MAB1637)), ratón CD133 (1:50) de Miltenyi Biotec (130-090-422), Melk conejo (1:200) de GenScript EE.UU. (A01390), y el conejo índice de masa corporal (1: 200) de Abcam se incubaron con las células durante la noche a 4 ° C y desarrollado utilizando AlexaFluor anticuerpos secundarios (de ratón o conejo Alexa Fluor 488 nm y 594 nm (1:200) a partir de Invitrogen).
en tiempo real cuantitativa comparativa reacción en cadena de polimerasa (CQ-PCR) y transcripción inversa cuantitativa (QRT-) PCR
muestras de ADN de especímenes de glioma congelados se aislaron utilizando un kit DNeasy (Qiagen, Valencia, CA). CQ-PCR estándar (producto CQ101) y cebadores de PCR para cuantificar
EGFR Opiniones y tres genes de referencia en 2q34 (
SPAG16
), 3p14.3 (
ERC2
), y 5q31.2 (
SPOCK1
) eran de Ziren Research LLC (Irvine, CA). Es un ADN recombinante que contiene fragmentos de PCR de
EGFR
y de referencia genes en una sola pieza para determinar CNV como se describe anteriormente [26]. PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando FAST-START-SYBR Green I Master Mix (Roche).
El ARN total (aproximadamente 1 g) extraído por medio de Ultraspec (Biotecx) a partir de cultivos SA y NS-adherentes, después de una cultivo de 24 horas en medio basal, se convirtió en ADNc utilizando 5 unidades de transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). Las muestras de cDNA se diluyeron y se cuantificaron las expresiones génicas por tiempo real QRT-PCR (SYBR Green I) utilizando un único estándar para marcadores y genes de referencia [27], normalizadas con respecto al
ACTB
. La cuantificación de
GAPDH
también se realizó para comparar con gen de interés. El primer secuencias de genes de QRT-PCR y PCR-CQ están disponibles a partir Ziren Research LLC (www.zirenresearch.com) a petición.
comparativo del genoma de hibridación (CGH)
ADN (1,5 g) muestras de células de glioma y de control (un grupo de seis muestras de ADN sangre humana normal) fueron etiquetados diferencialmente con Cy5 y Cy3-dUTP, respectivamente, se purificó y luego se hibridan a un Agilent Genoma humano CGH 244 k Microarray. Los datos se analizaron estadísticamente y se visualizaron utilizando dos métodos independientes, incluyendo Agilent Genómica Workbench 6.5 (Agilent) con el algoritmo de puntuación Z y un programa escrito en R (http://www.r-project.org/), que detecta el mismo aberraciones cromosómicas. El umbral de la puntuación Z utilizado para el método de Agilent se establece en 4.
Gelatina zymography, la enzima ensayos inmunométricos, Western Blot, y inmunocitofluorescencia
Las proteínas en el medio de cultivo celular de 24 horas acondicionado se precipitaron con 4 volúmenes de acetona fría, se centrifugó inmediatamente a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C, y se resuspendieron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contiene inhibidor de la proteasa Cocktail (Roche). Se utilizó la misma cantidad de proteína de medio condicionado para funcionar zimografía de gelatina. El medio acondicionado se sometió a ligado a enzimas (ELISA) para VEGFA (VEGF-165) y SPP1 (osteopontina) usando kits de ensayo de diseños (Ann Arbor, MI), y PTN de amplificador de I + D; D Systems (Minneapolis, MN). Sonicado lisado de células enteras en RIPA se utilizó para realizar la transferencia Western, con anticuerpos de EGFR de la señalización celular, y la actina de EMD Bioscience. Las células sembradas en poli-L-lisina o fibronectina recubiertos 8 pocillos portaobjetos de cámara, 2 × 10
4 células por cámara, y se incubaron durante la noche, se fijaron con 4% de paraformaldehído en PBS, con una breve permeabilización en 0,1% de Triton x -100, y de una incubación durante la noche con anticuerpo primario EGFR a 4 ° C. Se detectó la señal de inmunocitofluorescencia después de la incubación con Alexa Fluor® 594 anticuerpo secundario.
formación de colonias en agar blando ensayo
800-1000 células se mezclaron con 1 ml de agar blando 0,3% en DMEM /F12 suplementado con suero bovino 5% o un suplemento mitógeno para culturas NS como se detalla anteriormente, se extendió sobre agar blando endurecido 0,5% en el mismo medio (1 ml por pocillo en cuatro pocillos de esquina de una placa de 6 pocillos). se añadieron 2 y 3 semanas más tarde 1 ml del mismo medio y el número de colonias se contaron 4 semanas más tarde bajo un microscopio con 4 × lente.
El análisis estadístico
Se utilizó el análisis MANOVA en conjunción con diagrama ternario (http://www.davidgraham.org.uk) para comparar las muestras de GBM OG para los porcentajes de células que portan una copia, dos copias, o ≥ 3 copias de CHR7. por células madre similares a las subculturas y enriquecidas en células nonstem-como se compararon las diferencias en la expresión génica, ELISA, y los datos por medio de zimografía de 2 muestras de igual varianza pruebas t. La supervivencia global de los ratones portadores de xenoinjertos de glioma intracraneal se estimó a través de las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier, a continuación, en comparación a las diferencias utilizando un modelo de regresión de Cox estratificado con el fin de ajustar la variación de potencial ( "efectos Day") entre los diferentes experimentos. versiones 9.2 y SAS 9.3 (SAS Institute, Cary, NC) se han utilizado para todos los análisis y
P
. & lt; 0,01 se utilizó como el valor de significación para ajustar para comparaciones múltiples sin overinflating error de tipo II
el modelado matemático
modelo matemático de la construcción.
Denotar x1, x2, x3, x4, x5 como la abundancia de células con 1-5 copias de CHR7. Abandonarnos células con 6 copias, en el supuesto de que eran etapas anafase de células CHR7 3-copia. No esperábamos que los resultados a continuación se verían afectados de manera significativa por este supuesto ya que el porcentaje de las células 6-copia es baja en todas las mediciones. Para simplificar, suponemos también que las tasas de mala segregación de CHR7 normal y anormal son los mismos. Para STICS (2Chr7: 1n, 1d), asumimos que las células se pueden dividir ya sea de forma simétrica, o tienen una mala segregación CHR7, como se resume a continuación
Del mismo modo para TMC (3Chr7: 2n, 1d), tenemos
los parámetros
r
i es la constante de velocidad de crecimiento de las especies
i
, p
2 y p
3 se refieren a las probabilidades de asimétrica (mal) la segregación de un par de CHR7 en los STICS y TMC por la división celular, respectivamente. En general estas probabilidades dependen de x, pero por simplicidad que descuidan esta dependencia sea posible. Nótese que para los PTM, doble mala segregación de dos pares de CHR7 puede resultar en 1 + 5 o 3 + 3, para los que se supone la misma probabilidad. Para las células con otra CHR7 copiar números, ya que sus porcentajes son muy bajos, hemos descuidado las contribuciones más pequeñas de posibles eventos cromosoma mala segregación. Las ecuaciones de velocidad que rigen are China
Para facilitar la discusión que también denota el porcentaje de cada subpoblación α en un punto de tiempo dado como i. Estas cantidades fueron lo que mide de manera experimental mediante FISH.
Se consideran tres casos
No hay mala segregación, es decir, p
2 = p
3 = 0 SC y MC no tiene influencia mutua directo
existe mala segregación, STICS y TMC no tienen influencias mutuas directo
Missegragation existe, STICS inhiben parcialmente el crecimiento de TMC, que está modelado por una función de Hill como, y MCs activar el crecimiento de las SC, que se modela como, donde y son la constante de velocidad de crecimiento de TMC cuando porcentaje STIC y, respectivamente, y y son la constante de velocidad de crecimiento de STIC cuando TMC porcentaje y, respectivamente. En realidad, también consideramos el caso de coeficiente de Hill 4 en vez de 2, pero el resultado no muestra ningún cambio significativo
Método numérico
Las ecuaciones diferenciales ordinarias anteriores se resuelven usando Matlab. Al comienzo de cada pasaje, cambiar la escala de modo. Experimentalmente. Para nuestro modelo matemático el número exacto de N
0 no afecta a los resultados. Para el paso 1, se utilizaron los valores de ρ utilizados experimentalmente como los valores iniciales. Para pasos posteriores, se utilizaron los valores ρ calculados al final del paso anterior como valores iniciales.
En cada caso, el mejor conjunto de parámetros se obtuvo mediante la minimización donde y se refieren a los porcentajes calculados y medidos de α subpoblación al final del paso i, respectivamente. Se utilizó el método simplex cuesta abajo [28] para llevar a cabo la reducción al mínimo. Con cada mejor conjunto de parámetros, que predijo los tiempos de duplicación.
Resultados
heterogeneidad tumoral especificado por CHR7-CNV existe comúnmente en los gliomas de alto y bajo grado
Para determinar CHR7 la variación del número de copias (CNV) a nivel subpoblación de células, se realizó fluorescente
In situ
hibridación (FISH), con dos sondas para la
EGFR
gen y la región centromérica del cromosoma 7 (CEP7 ). Examinamos GBM y el tumor oligodendroglial (OT), el segundo más común del grupo de los gliomas, que se caracteriza por rasgos oligodendrogliales. OT incluye los oligodendrogliomas (OG, grado II), Oligoastrocitoma (OA, grado II); y oligodendroglioma anaplásico (AO, grado III), basado en criterios de la Organización Mundial de la Salud. El número de centrómeros CHR7 por núcleo, detectadas por la sonda FISH CEP7, se determinó contando con más de 250 células por tumor, y se utilizaron estos datos para establecer el nivel de heterogeneidad tumoral con respecto a CHR7-CNV. A continuación realizó una comparación de las diferencias en el estado de equilibrio de la heterogeneidad del tumor a partir de datos de la CNV CHR7-GBM de 14 y 12 OG. Hubo un porcentaje significativamente mayor de células que llevan más de 2 copias de CHR7 (amplificación) en GBM en comparación con OG (
P
& lt; 0,0005) (Figura 1A). En contraste con OG, la CHR7-CNV en la OA y AO fue similar a la del GBM, con datos representativos se muestran en la Figura 1B.
A, diagrama ternario de proporciones de población con 1 copia (supresión), 2 copias (normal), y 3 o más (amplificación) copias de CHR7, en base a las señales CEP7 en Ffuorescent
In situ
hibridación (FISH) de multiformes 14 de glioblastoma (GBM,
triángulo rojo
) y 12 tumor oligodendroglial (OG,
cuadrado negro
),
P = 0,0012
del análisis MANOVA. B, la comparación de la heterogeneidad del tumor en relación con el cromosoma 7 (CHR7) aneuploidía en el tumor original (T) y la correspondiente 3-4 semanas de edad, los cultivos primarios bajo adherente suero (SA) o condiciones de cultivo esfera neural (NS). C-D, los patrones de las células con CHR7-CNV en GBM-EGFR altas amplificadas y secuencial. FISH imágenes representativas de las células que llevan 1-4 copias de CHR7 con la amplificación de EGFR focal.
Para determinar si las poblaciones de células tumorales caracterizadas CNV CHR7 son viables y que contribuye a la diversidad clonal dentro de cada tumor, se examinaron a corto plazo (4-6 semanas con 1-2 pasajes) cultivos primarios bajo adherente suero (SA) y /o condiciones de cultivo esfera neural (NS). Encontramos las células de la subpoblación con CHR7-CNV en todos los cultivos primarios de glioma examinados (Figura 1B). Hubo un mayor porcentaje de células con CHR7-amplificación en cultivos de GBM que en los de OG. En ambos casos, el porcentaje de células con CHR7-ampliciation fue mayor en cultivos primarios que en el tumor correspondiente. Para AO, que es un tipo más progresivo de OT, también se observó un similares CHR7-amplificación en el tumor y en su cultivo primario derivado. Curiosamente, en oligo-astro mixto OT, llamada «OA", el equilibrio en la composición celular para CHR7-heterogeneidad en los tumores originales era similar a la de GBM. Sin embargo, en cultivos primarios de OA-derivado, se observó heterogeneidad se asemeja sorprendentemente que de OG, con una mayoría de células que tienen dos copias CHR7 y menos de 40% de células que llevan tres o más copias de CHR7 (Figura 1B).
a continuación, se compararon los patrones de CHR7-heterogeneidad en OG o GBM recurrente y con
de novo
estado, y se encontró correlación. Sin embargo, hubo aumentos incrementales en el porcentaje de células con CHR7-amplificación en GBM secuenciales (tumores es decir, la muestra con el tiempo a la progresión o recurrencia) de un paciente con neurofibromatosis (Figura 1C). Esto es consistente con el análisis anterior que muestra una capacidad de crecimiento más rápido para las células con CHR7-amplificaiton.
A consecuencia molecular directa de amplificación CHR7 es la amplificación del EGFR oncogén que reside dentro de él, lo que confiere una ventaja de crecimiento. amplificación focal de EGFR se ve comúnmente en el subtipo de GBM clásica [29]. por tanto, hemos comparado CHR7-CNV con EGFR-CNV, determinada por PCR en tiempo real cuantitativa comparativa. Encontramos un equilibrado
EGFR
relativa para hacer referencia a genes (relación de 0,7 a 1,3, dada una variación del 20-30% en la cuantificación) en todos los tumores oligodendrogliales (n = 17) y en el 53% de los GBMs (n = 51), y un bajo nivel de
EGFR
amplificación (relación 1.4-2) en el 23,5% de GBM, todo bien correlacionado con calculada
EGFR
niveles, con base en el porcentaje de células y su número CHR7. En el 23,5% restante de GBM, encontramos un alto nivel de
EGFR
amplificación (relación entre 5-48), que fue verificada por EGFR FISH /CEP7 para ser la amplificación de EGFR focal (Figura 1D). En EGFR (focal) GBM amplificados, se encontró que el patrón de heterogeneidad CHR7-tumoral que sea similar a la de GBM sin EGFR (focal) de amplificación.
En conjunto, se observó un nivel significativo de heterogeneidad tumoral, con las células que muestran CHR7-CNV que ocurren comúnmente en ambos gliomas de bajo y alto grado. La monosomía del cromosoma 10 es también una inestabilidad cromosómica funcionalmente relacionada con la malignidad del tumor [30] y se produce en aproximadamente 80% de los tumores de GBM. Cuando está presente, monosomía 10 se muestra de forma homogénea, en contraste con la heterogeneidad visto para CHR7. Esta diferencia sugiere que debe haber un proceso activo para mantener CHR7 heterogeneidad en tumores, que hemos identificado que ser CHR7-MS. Para estudiar más a fondo este proceso hemos examinado CHR7-MS y CHR7-CNV en líneas celulares de glioma establecidos.
CHR7-MS está incluida en el mantenimiento de la heterogeneidad celular en líneas celulares de glioma establecido
Se realizó B- anillado con la tinción de Giemsa en el cromosoma diferenciales de seis líneas celulares de glioma maligno humano y determina el rango de números de cromosomas enteros (WCN) agrupados en torno al modo en base a más de 7 células. EGFR FISH /CEP7 se realizaron y se utilizaron los recuentos de señales CEP7 en más de 250 células en interfase para determinar el porcentaje de células que llevan diferentes números de CHR7 (Figura 2A). Todas las líneas celulares de glioma mostraron co-existencia de diversas subpoblaciones de células basados en CHR7-CNV, con un porcentaje significativo de células que llevan 2, 3, y 4-copias de CHR7 con un cariotipo casi diploide (U251, U87 y LG11) , 4, 5, y 6-copias de CHR7 casi en triploides /tetraploide (A172 y LN229), y 6, 7 y 8 copias de CHR7 en cariotipos cerca-pentaploid (T98G).
A-B, el porcentaje de células con CHR7-CNV en líneas celulares de glioma, y sus subculturas SA y NS, desde individuales (por ejemplo, 1, 2) o mixta (mezcla) de colonias en agar blando, respectivamente. número de cromosomas enteros (WCN) se extienden cerca de la modo se encontraron en & gt; 50% de células en cada línea celular de glioma. D, pescado imágenes que muestran normal (n) y el derivado (d) y el cromosoma CHR7 desconocido (?) Que lleva un EGFR trasladadas desde una célula en metafase representativo para cada línea celular. El cromosoma se desprende de DAPI (azul), centrómero y EGFR se muestran mediante sondas FISH para CEP7 (verde) y EGFR (rojo).
En condiciones SA-cultura que han sido empleados para el cultivo éstas líneas celulares de glioma, se establecieron subcultivos de chapado de una sola célula o colonias de agar blando individuales de las líneas celulares de glioma, que nombramos SA clones (SA1, SA2, etc). FISH mostró la reaparición de la heterogeneidad de las células CHR7 en cada uno de los clones SA (Figura 2B), que conserva rasgos característicos de CHR7 y
EGFR
amplificación y /o translocación que se encontraron en sus cultivos parentales (Figura 2D) . Curiosamente, el porcentaje de aquellas células que habían estado en la mayoría de los padres en el cultivo disminuyó en los clonales subculturas SA. La excepción fue LN229, que fue compuesta inicialmente por dos subpoblaciones de células casi iguales en porcentaje. Evidentemente, la heterogeneidad tumoral se mantuvo en la línea celular de glioma establecido por CHR7-MS. También indica que una línea celular establecida es un ecosistema cultivadas con subpoblaciones de células que alcanzan cierto equilibrio con el tiempo. a continuación, nos preguntamos si al cambiar las condiciones de cultivo que podría cambiar el equilibrio de la heterogeneidad, tal como para permitir una subpoblación de células previamente minoría se convierta en dominante bajo nuevas condiciones de cultivo. Si eso resultó ser el caso, que sería capaz de variar las condiciones de cultivo para obtener un número suficiente de las diversas células minoritarios para el estudio adicional de sus fenotipos y contribuciones al crecimiento global.
Se expuso las líneas celulares de glioma a NS las condiciones de cultivo, que fueron desarrollados originalmente para el cultivo de células madre neurales y luego modificados para enriquecer las células de glioma que expresan características de células madre neurales similares [31], [32]. Se encontró que después de la cultura de un mes en condiciones NS, durante la cual hubo una muerte masiva de células, (con las células muertas retirados repetidamente haciendo pasar las células de ida y vuelta entre las condiciones adherentes no adherentes y fibronectina mediada por en medio NS), una subpoblación de células minoritaria en la línea parental llegó a dominar las subculturas NS. Establecimos más subculturas NS clonales de colonias individuales formadas en agar blando preparada usando medio NS, y nombramos estos "clones NS" (NS1, NS2, etc). La figura 2C muestra los datos representativos de FISH subculturas NS de líneas celulares de glioma. Estos datos muestran re-apariciones de la heterogeneidad de las células CHR7 de subculturas NS clonales.
Se tomó 4 semanas para las colonias que se forman en agar blando, antes de su traslado a SA o NS condiciones de cultivo para el crecimiento adicional. Después de la transferencia, que tomó cerca de 2 semanas para obtener suficientes células (2 × 10
5) para el análisis FISH. El tiempo requerido para volver a establecer la heterogeneidad cultura de una sola célula era de menos de 18 divisiones celulares, lo que llevó aproximadamente 6-7 semanas. Vuelva a la obtención de cultivos de células heterogéneas con CHR7-CNV en clonales SA y NS subculturas de todas las líneas celulares de glioma estudiados demostraron que CHR7-MS podría suceder en cualquier célula subpoblación para impulsar la diversidad de la población del tumor, mientras que las condiciones de cultivo determinan el equilibrio heterogeneidad de la