Extracto
La membrana pentaspan glicoproteína CD133 (también conocido como prominin-1) ha sido ampliamente utilizado como marcador de el cáncer y las células madre normales. Sin embargo, la función de CD133 no se ha dilucidado. Aquí se describe una línea de células madre del cáncer establecido a partir de carcinoma de células claras de ovario (CCC) y demostrar que interactúa con CD133 plakoglobina (también conocido como γ-catenina), una proteína de los desmosomas enlazador. Además, demuestran que desmontables de CD133 por los resultados de interferencia de ARN (RNAi) en la regulación a la baja de antidesmogleína-2, una cadherina desmosomas, y la adhesión célula-célula y la tumorigenicidad de las células madre CCC abroga. Especulamos que CD133 puede ser un objetivo prometedor para la quimioterapia del cáncer
Visto:. Koyama-Nasu R, R Takahashi, Yanagida S, Nasu-Nishimura Y, Oyama M, Kozuka-Hata H, et al. (2013) El cáncer de células madre marcador CD133 interactúa con Plakoglobin y controles Desmogleína-2 niveles de proteína. PLoS ONE 8 (1): e53710. doi: 10.1371 /journal.pone.0053710
Editor: Cara Gottardi, Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Septiembre, 2012; Aceptado: 3 de diciembre de 2012; Publicado: 10 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Koyama-Nasu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de la innovadora Biología celular por una tecnología innovadora (Análisis de Sistemas integrados de celulares oncogénicas redes de señalización), subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras (integrativa de Investigación sobre el cáncer Red microambiente) y para la Investigación Científica (C), Fundación Takeda Ciencia y en parte por el Programa Global COE (integrativa ciencias de la vida basada en el estudio de los mecanismos Biosignaling), MEXT, Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción se cree
las células madre del cáncer de tener la capacidad de proliferar y auto-renovarse y ser responsable de la tumorigénesis, la metástasis y la recurrencia [1], [2]. La presencia de células madre de cáncer se ha demostrado en una variedad de tumores [1]. En particular, las células madre glioblastoma se han estudiado ampliamente ya que se pueden mantener en medio libre de suero que favorecen el crecimiento de las células madre neurales [3]. Sin embargo, todavía es difícil de mantener y expandir las células madre cancerosas derivadas de otros tejidos
in vitro
. En el presente estudio, hemos tenido éxito en el establecimiento de una línea de células madre del cáncer de carcinoma de células claras de ovario (CCC), que tiene el peor pronóstico entre los cánceres ováricos epiteliales [4] y demuestran que CD133 interactúa con plakoglobina, controla antidesmogleína-2 de proteínas niveles y es necesario para la adhesión célula-célula y la tumorigenicidad de las células madre de la CCC.
resultados y Discusión
cultivaron las células madre de la CCC aisladas de un paciente diagnosticado con la CCC en condiciones libres de suero. Similares a vástago glioblastoma células [5], las células madre de la CCC crecieron de manera exponencial en placas recubiertas con laminina en condiciones libres de suero (Fig. 1A y S1A). Como se informó anteriormente para otros tipos de cáncer [3], [6], [7], las células madre de la CCC se sometieron a la diferenciación cuando se cultivan en medio que contiene suero (células diferenciadas CCC): exhibieron un ligero cambio morfológico (Fig 1A.), Y el los niveles de expresión de marcadores de células madre, como
CD133
[8],
Sox2
[9] y
LGR5
[10], se redujeron significativamente (Fig. 1B) . Cuando las células madre de la CCC se inyectaron subcutáneamente en ratones inmunocomprometidos, todos los ratones desarrollaron tumores que eran histopatológicamente similar a su tumor original (Fig. 1C y S1B). Por el contrario, ninguno de los ratones transplantados con tumores células CCC diferenciado desarrollados, a pesar de su capacidad para proliferar de forma exponencial
in vitro
(Fig. 1C y S1A).
(A) de vástago CCC y diferenciada células (Dif) en cultivo. se muestran fotografías de contraste de fase. (B) Los niveles de mRNA de los genes indicados fueron evaluados por RT-PCR cuantitativa y se muestran como cambio veces sobre los niveles de mRNA en células madre CCC. Las barras de error representan la S. D. (
n
= 3). (C) CCC madre o células diferenciadas fueron trasplantadas por vía subcutánea en ratones NOG (
n
= 3). Siete meses después del trasplante, los ratones (superiores) y los tumores (inferior) fueron fotografiados. (D) eluye de CD133 inmunopurificada de la fracción de membrana de las células madre de la CCC se resolvieron mediante SDS-PAGE y se visualizaron por tinción con plata. proteínas (E) desmosomas identificados por espectrometría de masas. Se muestran los números de péptidos únicos identificados. (F) Las muestras se prepararon como se describe en (D) y a inmunotransferencia con anticuerpos para las proteínas indicadas. (G) Co-localización de CD133 (rojo) con las proteínas de los desmosomas (verde). las células madre de la CCC se inmunotiñeron con anticuerpos para las proteínas indicadas. A-PRO-3 yoduro se utilizó para la tinción de ADN nuclear (azul). Las barras de escala representan 20 micras.
La expresión de CD133 se limita estrictamente a una población rara de células madre somáticas y cáncer [8]. Por tanto, es difícil obtener un número suficiente de células para llevar a cabo el análisis bioquímico del complejo de proteína que contiene CD133. Aprovechando la capacidad de las células madre CCC creciendo exponencialmente y mantener altos niveles de expresión de CD133
in vitro
, nos dispusimos a immunopurify el complejo CD133 endógeno. CD133 se inmunoprecipitó a partir de la fracción de membrana con el anticuerpo anti-CD133 y después de la confirmación por SDS-PAGE y tinción con plata, los inmunoprecipitados se sometieron a espectrometría de cromatografía de masa líquida (Fig. 1D). Entre las proteínas co-purificado identificados (Tabla S1), nos centramos nuestra atención en plakoglobina y desmoplaquina (Fig. 1E), ya que son componentes del desmosoma, que media la adhesión célula-célula [11]. Desmosomas son complejos de unión que consisten en miembros de la familia de las cadherinas de proteínas de adhesión celular y proteínas que unen que se unen las proteínas de adhesión de la superficie celular a los filamentos del citoesqueleto de queratina intracelular. Plakoglobina y función desmoplakina como las principales proteínas de los desmosomas, que une.
Nos confirmaron la capacidad de CD133 para interactuar con plakoglobina por
in vivo
ensayos de pull-down. Cuando un lisado de las células madre de la CCC se sometió a inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-CD133, seguido por inmunotransferencia con anticuerpo anti-plakoglobina, se encontró que plakoglobina tener co-inmunoprecipitado con CD133 (Fig. 1F). Plakoglobin no se detectó cuando se utilizó IgG de control para la inmunoprecipitación. Sin embargo, nuestros ensayos
in vitro
desplegables no detectar co-precipitación de plakoglobina con fragmentos que contienen dominios citoplasmáticos individuales de CD133 (datos no mostrados). Esto puede ser debido a que la topología de la membrana de CD133 es importante para su asociación con plakoglobina. Alternativamente, CD133 no se puede asociar directamente con plakoglobina. Los resultados con desmoplakina no fueron concluyentes, ya que co-precipitado con el anticuerpo anti-CD133 o IgG control en nuestras condiciones experimentales.
El análisis inmunohistoquímico de las células madre de la CCC reveló que CD133 y plakoglobina co-localizados dentro de las regiones de la célula contactos de las células beta (Fig. 1G). tinción CD133 no se detectó cuando las células fueron infectadas con un lentivirus expresar una shRNA orientación CD133 (Fig. 2C), lo que indica la especificidad de anticuerpo anti-CD133. Desmoplaquina se encontró que era parcialmente co-localizar con CD133 (Fig. 1G).
células madre CCC (A) fueron infectadas con un lentivirus expresar una orientación CD133 shRNA. Las células se someten a estrés mecánico por pipeteo en PBS que contenía mM CaCl
2 y MgCl 0,5 mM
2 1. Se muestran imágenes representativas (superior). El gráfico de barras que representa la relación entre el número de células número /cluster (inferior). Las barras de error representan la S. D. (
n
= 3).
p = 0,011
con comparación con el control shRNA mediante la prueba t. (B) las células madre de la CCC fueron tratados como se describe en (A). Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos para las proteínas indicadas. las células madre de la CCC (C) se trataron como se describe en (A). Las células se inmunotiñeron con anticuerpos frente a las proteínas indicadas (rojo). A-PRO-3 yoduro se utilizó para la tinción de ADN nuclear (azul). Las barras de escala representan 20 micras. las células madre de la CCC (D) se trataron como se describe en (A). Las células fueron trasplantadas en ratones inmunocomprometidos por vía subcutánea (
n
= 3). Once meses después del trasplante, se fotografiaron ratones (superiores) y los tumores (medias). El gráfico de barras que representa el peso del tumor (inferior). Las barras de error representan la S. D. (
n
= 3).
p = 0,007
con comparación con el control shRNA mediante la prueba t.
Se realizó el análisis inmunohistoquímico de antidesmogleína-2 y desmocolina-2, dos cadherinas desmosómicas que se expresan en las células madre de la CCC . Se encontró que estas proteínas también co-localizada con CD133 (Fig. 1G). En particular, CD133 y antidesmogleína-2 tenían patrones de distribución muy similares. Sin embargo, ni la desmogleína-2 ni desmocolina-2 puede ser detectada en los inmunoprecipitados de CD133, lo que indica que no están asociados físicamente (Fig. 1F). Por el contrario, se encontraron inmunoprecipitados plakoglobina para contener CD133 así como cadherinas desmosómicas (Fig. 1F). En conjunto, estos resultados sugieren que CD133 interactúa con plakoglobina pero no con el complejo de proteínas de los desmosomas que contiene desmogleína-2 y desmocolina-2.
A continuación estudiado el papel de CD133 en la regulación de la adhesión célula-célula. Hemos observado que las células madre de la CCC no podían ser fácilmente dispersadas por pipeteado. Sin embargo, cuando las células fueron infectadas con un lentivirus expresar una shRNA orientación CD133, las células podrían ser dispersados pipeteando (Fig. 2A). Por otra parte, colgando ensayos de agregación de células gota demostraron que desmontables células CD133 no correspondían con fuerza y podrían ser dispersados con la pipeta (Fig. S2). Por lo tanto, CD133 puede ser importante para la adhesión de las células madre CCC. Para elucidar el mecanismo molecular que subyace a esta disminución de la adhesión célula-célula, se examinaron los niveles de expresión de las proteínas de los desmosomas. Immunoblotting y RT-PCR análisis revelaron que desmontables de CD133 como resultado una disminución en los niveles de proteína desmogleína-2, pero no
desmogleína-2
mRNA (Fig. 2B y S3A), un resultado que fue confirmado por inmunohistoquímica (Fig. 2C).
Desmontables de CD133 usando un distinto shRNA también resultó en la regulación negativa de la desmogleína-2 (Fig. S3B). Se obtuvieron resultados similares con la línea celular epitelial intestinal humana Caco-2, que también expresa altos niveles de CD133 [12] (Fig. S3C). Además, desmontables de CD133 condujo a una localización ligeramente difusa de plakoglobina (Fig. 2C). Además, hemos encontrado que desmontables de plakoglobina resultó en una disminución en los niveles de proteína desmogleína-2 (Fig. S3D, E). De acuerdo con estos resultados, los ensayos de agregación celular gota colgante revelaron que desmontables de desmogleína-2 resultó en una disminución en la adhesión de las células de la CCC (Fig. S2). Estos resultados sugieren que CD133 es necesario para la estabilidad y la correcta localización de las proteínas de los desmosomas.
CD133 es ampliamente utilizado para aislar una gran variedad de células madre de cáncer, incluyendo CCC del ovario [8], [13]. Sin embargo, su contribución funcional a la tumorigénesis ha sido claro. la adhesión célula-célula es una característica inherente de los tumores sólidos, y varios informes han sugerido que la desmogleína-2 es esencial para la tumorigenicidad de varios tumores epiteliales [14]. Por lo tanto, hemos examinado el papel potencial de CD133 en la tumorigenicidad de las células madre CCC utilizando un lentivirus shRNA que codifica para derribar de forma estable la expresión de CD133. Los ensayos de formación de colonias en agar blando revelaron que desmontables de CD133 como resultado una disminución en la capacidad de formación de colonias de células madre CCC (Fig. S4). Además, desmontables de desmogleína-2 también redujo la formación de colonias. Cuando las células desmontables-CD133 se inyectaron por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes, que crecieron a una tasa reducida de manera significativa en comparación con las células control (Fig. 2D). Este resultado sugiere que CD133 es necesario para la tumorigenicidad de las células madre de la CCC.
En este informe, hemos demostrado que interactúa con CD133 plakoglobina y controla la adhesión célula-célula en las células madre de la CCC. De particular interés es el hecho de que desmontables de CD133 en las células madre de la CCC causó una reducción en los niveles de la desmogleína-2. El mecanismo por el cual el complejo CD133-plakoglobina estabiliza desmogleína-2 queda por investigar. En las células madre hematopoyéticas, CD133 se sabe que está enriquecido en los sitios de contacto con los osteoblastos [15]. Por lo tanto, CD133 puede funcionar tanto en las células madre normales como un regulador de las interacciones célula-célula y cáncer. Demostramos además que CD133 es importante para la tumorigenicidad de las células madre CCC. Este hallazgo es consistente con informes anteriores que muestran que la desmogleína-2 está implicada en la tumorigénesis [14]. Por tanto, es intrigante especular que CD133 y /o antidesmogleína-2 pueden ser dianas terapéuticas para el cáncer de células madre epiteliales CD133-positivo.
Materiales y Métodos
Tumor de muestras y Cultivos Celulares
el estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Biomédica de la Junta de Revisión Institucional Jikei, la Escuela de Medicina de la Universidad de Jikei, Tokio, Japón. Todos los pacientes procuraron su consentimiento escrito. muestra de tumor clasificado como carcinoma de células claras de ovario se obtuvo de un paciente sometido a tratamiento quirúrgico en el Hospital Universitario de Jikei. Los tumores se lavaron, y mecánicamente y enzimáticamente disocian en células individuales. Las células tumorales fueron cultivadas en laminina (Sigma) recubierta plato en DMEM /F-12 (Life Technologies) que contenía suplemento B27 (Life Technologies), EGF y FGF2 (20 ng /ml cada una, Wako Pure Chemical Industries). Para
in vitro
diferenciación, las células tumorales se cultivaron en DMEM /F-12 medio (Life Technologies) que contenía suero bovino fetal al 10%. 293FT y las células Caco-2 se cultivaron en DMEM (Nissui) que contenía suero bovino fetal al 10%.
subcutáneos xenoinjertos
Una semana después de la infección lentivirus, 1 × 10
se inyectaron 5 células por vía subcutánea en ratones NOG 6 semanas de edad (Instituto central de Animales experimentales) (
n
= 3). Los tumores se analizaron histológicamente después de hematoxilina y eosina (HE) de tinción. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Tokio, Tokio, Japón. Todos los protocolos experimentales con animales se realizaron de conformidad con la política del Comité de Ética Animal de la Universidad de Tokio, Tokio, Japón.
RT-PCR cuantitativa
El ARN total fue extraído por medio de NucleoSpin® RNA Clean -up kit (Takara) y transcritas invertir en cDNA utilizando PrimeScript RT Master Mix (Takara). PCR en tiempo real se realizó utilizando LightCycler480 SYBR Green I Master y un instrumento LightCycler480 (Roche). Los resultados se normalizaron con el valor detectado por
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)
. Los cebadores utilizados en la PCR en tiempo real fueron los siguientes:
GAPDH
hacia adelante (5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '),
GAPDH
inversa (5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3');
CD133
hacia adelante (5'-AGTGGCATCGTGCAAACCTG-3 '),
CD133
inversa (5'-CTCCGAATCCATTCGACGATAGTA-3');
Sox2
hacia adelante (5'-TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA-3 '),
Sox2
inversa (5'-CTGGGGCTCAAACTTCTCTC-3');
LGR5
hacia adelante (5'-GATTTCCTGCTTGACTTTGAGG-3 '),
LGR5
inversa (5'-GCAGGTGTTCACAGGGTTTG-3');
plakoglobina
hacia adelante (5'-GATCTTCCGGCTCAACACC-3 '),
plakoglobina
inversa (5'-GATGTTCTCCACCGACGAGT-3');
antidesmogleína-2
hacia adelante (5'-GGAAATTTTCAAGCTTTTGATGA-3 '),
antidesmogleína-2
inversa (5'-CCACAGAGATCCAATTATCTCTATCTT-3').
Los anticuerpos
anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) para CD133 (AC133) se obtuvo de Miltenyi Biotec. Mouse mAb a desmocolina-2/3 (7G6), antidesmogleína-2 (6d8) y α-tubulina eran de Santa Cruz Biotechnology. Mouse mAb a plakoglobina era de BD Biosciences. Mouse mAb a GAPDH era de Millipore. Mouse mAb a desmoplakina (2Q400) fue de Abcam y utilizados para inmunohistoquímica. anticuerpo policlonal de conejo (pAb) a desmoplaquina fue de Abcam y se utilizaron para la inmunotransferencia.
inmunoprecipitación e inmunotransferencia
La fracción de membrana de las células se lisó en tampón de lisis [50 mM HEPES-NaOH pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de NP40, 1 mM ditiotreitol y cóctel inhibidor de la proteasa (Roche)] (Fig. 1D). Alternativamente, la fracción de membrana se lisaron en tampón de lisis que contiene 1% de digitonina en lugar de NP40 (Fig. 1F). Los lisados se incubaron con anti-CD133, anti-plakoglobina o IgG1 de control inmovilizado en Activado CH-Sepharose 4B (GE Healthcare) durante 4 horas a 4 ° C. Después de cinco lavados con tampón de lisis, las proteínas unidas se eluyeron con 100 mM de glicina-HCl y se sometieron a digestión con tripsina. Después de desalado con ZipTip (C18; Millipore), la muestra se somete a espectrometría de cromatografía de masa líquida. Para la inmunotransferencia, las proteínas eluidas se fraccionan mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore). La membrana se sometió a análisis de inmunotransferencia usando fosfatasa alcalina conjugada con anti-ratón o IgG de conejo (Promega) como anticuerpos secundarios. La visualización se realizó mediante el sistema de sustrato colorimétrico NBT /BCIP (Promega).
Análisis de espectrometría de masas y la identificación de proteínas
Escopeta análisis proteómicos se llevaron a cabo por un ion lineal espectrómetro de masas de trampa-Orbitrap (LTQ- Orbitrap Velos, Thermo Fisher Scientific) junto con el nanoflow sistema LC (Dina-2A, KYA Technologies) como se describe anteriormente [16]. Identificación de proteínas se llevó a cabo mediante la búsqueda de datos MS y MS /MS en contra de la RefSeq (Centro Nacional de Información Biotecnológica) base de datos de proteína humana (32,968 secuencias de proteínas como del 12 Sep 2011) y utilizando la mascota ver. 02/03/02 (Matrix Science). la oxidación de metionina, la proteína de la acetilación N-terminal y piro-glutamination de glutamina N-terminal se establecieron como modificaciones variables. Un máximo de dos divisiones perdidas se dejó en nuestra búsqueda de base de datos y la tolerancia para la desviación de masas se establece en 3 partes por millón (ppm) para las masas de péptidos y 0,8 Da para MS /MS picos, respectivamente. Identificación de proteínas se basa en el criterio de tener al menos un dato de MS /MS con puntajes de la mascota que superó los umbrales (
p Hotel & lt; 0,01).
ARN de interferencia
las secuencias de oligonucleótidos shRNA fueron los siguientes: CD133#1 (5 'GGAUACACCCUACUUACUAAA-3'), CD133#2 (5'-GCACUCUAUACCAAAGCGUCA-3 '), desmogleína-2#1 (5' GUUAGCGAGAGCAUGGAUAGA-3 '), desmogleína -2#2 (5'-GCAUUAUCAGUAAUAAUUUGU-3 '), plakoglobina (5'-GAGCAUGAUUCCCAUCAAUGA-3').
Lentivirus Producción
Lentiviral vector (CS-RFA-CG) que expresan un shRNA dirigido por el promotor H1 se transfectó con los vectores de empaquetamiento pCAG-HIV-gp y pCMV-VSV-G-RSV-Rev en 293FT células utilizando Lipofectamine 2000 reactivo de transfección (Life Technologies). Todos los plásmidos fueron amablemente proporcionados por H. Miyoshi (RIKEN Centro de bio, Japón). sobrenadante viral se purificó mediante ultracentrifugación a 25.000 rpm durante 90 min (rotor SW28, Beckman). eficiencia de infección se controló por la proteína de fluorescencia verde expresión (GFP) ya que es impulsado por el promotor CMV.
Inmunohistoquímica
Las células se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio recubiertas con laminina y se fijaron con metanol enfriado con hielo . Las células se incubaron con anticuerpos primarios seguidos por incubación con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 o 594 (Life Technologies). Para la visualización de CD133, las células se incubaron con anticuerpo anti-CD133 conjugado con R-ficoeritrina. A-PRO-3 yoduro (Life Technologies) se utilizó para la tinción de ADN nuclear. Las células se fotografiaron con un microscopio de barrido láser LSM510 META (Carl Zeiss).
Disociación Celular Ensayo
5 × 10
4 células fueron sembradas en placas de 12 pocillos recubiertas con laminina. Las células se separaron de las placas de cultivo con un raspador celular y se pasa 10 veces a través de una punta de pipeta de 200 l en PBS que contenía mM CaCl
2 y 0,5 mM de MgCl
2 1. Las imágenes fueron capturadas por microscopía de contraste de fase. El grado de disociación de células fue representada por la relación del número de células /número de clúster.
colgante Cell gota Ensayo de agregación
Las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS y se resuspendieron a 5 x 10
5 células por mililitro en medio. 7,5 × 10
3 células se suspendieron como colgar gotas de la tapa de la placa de cultivo y se dejaron a agregarse durante la noche. Para la trituración, se pasaron las células 10 veces a través de una punta de pipeta de 200 l. Las imágenes fueron capturadas por microscopía de contraste de fase. El tamaño de las partículas se midió utilizando el software ImageJ 1.46r.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Caracterización de las células madre de la CCC. cinética (A) proliferación de las células madre de la CCC. CCC madre y células diferenciadas (dif) se cultivaron durante los tiempos indicados. El gráfico de barras que representa los días (
x
eje x) y el número de células (
y
eje x). (B) El análisis histopatológico de xenoinjertos tumorales. Tinción HE de células madre a la CCC se muestra xenoinjertos de tumores y paciente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s001 gratis (TIF)
figura S2.
CD133 y antidesmogleína-2 se requieren para la adhesión de las células madre de la CCC. las células madre de la CCC fueron infectadas con un lentivirus expresar una shRNA orientación CD133 o desmogleína-2. Las células se sembraron en cultivos de gota colgante y se dejaron agregar durante la noche. Antes de (-) y después de las células (trituración) se sometieron a estrés mecánico por pipeteo, las imágenes fueron capturadas por contraste de fase microscopía (superior). El gráfico de barras que representa el tamaño medio de las partículas en relación con las células que expresan el control shRNA (inferior). Las barras de error representan la S. D. (
n
= 3). NS: no significativo; *,
p Hotel & lt; 0,05 mediante la prueba t
doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
CD133 y plakoglobina controlar los niveles de expresión de antidesmogleína-2. Las células madre de la CCC (A) fueron infectadas con un lentivirus expresar una orientación shRNA CD133. Los niveles de mRNA de los genes indicados fueron evaluados por RT-PCR cuantitativa y se muestran como cambio veces sobre los niveles de ARNm en células que expresan el control shRNA. Las barras de error representan la S. D. (
n
= 3). (B) las células madre de la CCC fueron infectadas con un lentivirus expresar una CD133 de orientación shRNA (shRNA CD133 2 #). Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos para las proteínas indicadas. (C) células Caco-2 se infectaron con un lentivirus expresar una orientación CD133 shRNA. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos para las proteínas indicadas. las células madre de la CCC (D) fueron infectadas con un lentivirus expresar una plakoglobina orientación shRNA. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos para las proteínas indicadas. (E) las células madre de la CCC fueron tratados como se describe en (D). Los niveles de mRNA de los genes indicados fueron evaluados por RT-PCR cuantitativa y se muestran como cambio veces sobre los niveles de ARNm en células que expresan el control shRNA. Las barras de error representan la S. D. (
n
= 3)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s003 gratis (TIF)
figura S4.
CD133 y demoglein-2 son necesarios para el crecimiento independiente de anclaje de las células madre de la CCC. las células madre de la CCC fueron infectadas con un lentivirus expresar una shRNA orientación CD133 o desmogleína-2. Las células se sembraron en agar blando y se cultivaron durante 2 semanas. El gráfico de barras representa el número de colonias en relación con las células que expresan el control shRNA. Las barras de error representan la S. D. (
n
= 4). *,
p Hotel & lt; 0,05 con respecto al control de shRNA mediante la prueba t
doi:. 10.1371 /journal.pone.0053710.s004 gratis (TIF)
Tabla S1.
lista completa de los péptidos identificados en el análisis de espectrometría de masas.
doi: 10.1371 /journal.pone.0053710.s005 gratis (XLSX)