Extracto
proteína de esperma (Sp17) es un objetivo atractivo para el cáncer de ovario (OC) las vacunas debido a su sobre-expresión en primaria, así como en las lesiones metastásicas, en todas las etapas de la enfermedad. Nuestros estudios sugieren que una vacuna basada en Sp17 puede inducir una defensa duradera contra el desarrollo OC en ratones C57BL /6 con células ID8, siguientes tratamientos profilácticos y terapéuticos. Esta es la primera vez que se demostró un homólogo de ratón de un antígeno de cáncer de testículo (Sp17) que se expresa en un modelo de ratón OC, y que la vacunación contra este antígeno controlado significativamente el crecimiento del tumor. Nuestro estudio muestra que la vacuna adyuvada Sp17-CpG supera el problema de la tolerancia inmunológica, el principal obstáculo para el desarrollo de una inmunoterapia eficaz para OC. Por otra parte, este estudio proporciona una mejor comprensión de la biología OC demostrando que es necesaria la activación Th-17 células e inmunosupresora contemporánea inhibición células T-reg para la eficacia de la vacuna. Tomados en conjunto, estos resultados indican que las vacunas profilácticas y terapéuticas pueden inducir una protección de larga data contra el crecimiento de OC y el tumor de retraso, lo que sugiere que esta estrategia puede proporcionar tratamientos adicionales de OC humana y la prevención de la aparición de la enfermedad en mujeres con antecedentes familiares de OC.
Visto: Chiriva-M en co, Yu Y, L Mirandola, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. (2010) El cáncer de testículo antígeno vacunación proporciona protección a largo plazo en un modelo murino de cáncer de ovario. PLoS ONE 5 (5): e10471. doi: 10.1371 /journal.pone.0010471
Editor: Sudhansu Kumar Dey, Fundación para la Investigación de Niños de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Febrero, 2010; Aceptado: April 12, 2010; Publicado: 12 de mayo de 2010
Derechos de Autor © 2010 Chiriva-Internati et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por el Billy y Ruby Poder Fundación para la Investigación del cáncer y el Instituto Laura Bush W. para la Salud de la Mujer y el Centro de Salud de la Mujer y la medicina basada en género. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario (CO) es el sexto cáncer más común y la séptima causa de muerte por cáncer en las mujeres [1], [2]. Entre OC, el 90% de los casos están representados por los cánceres de ovario epitelial (EOC), derivada de epitelio de revestimiento, la superficie del ovario o de los quistes de inclusión [3], [4]. La letalidad de OC se deriva de la incapacidad para detectar la enfermedad en una etapa temprana limitada al órgano y de la falta de terapias efectivas para la enfermedad en estadio avanzado [4]. El diagnóstico tardío y la alta tasa de resistencia a la quimioterapia limitan las opciones de tratamiento disponibles. OC pacientes con antecedentes familiares de OC cuenta para el 10% de todos los casos [5]. opciones clínicos para estos pacientes son intervención quirúrgica que conduce a la infertilidad, o quimioprevención con los anticonceptivos orales, a menudo asociado con efectos secundarios graves [6], [7]. estrategias de inmunoterapia, incluyendo vacunas contra el cáncer son considerados menos tóxico y más específico que los tratamientos actuales [8], y por lo tanto tienen el potencial de proporcionar beneficios para los pacientes con enfermedad OC evidente y para los pacientes de alto riesgo de OC. Debido a su especificidad de acción, potente y efectos duraderos y aplicabilidad a prácticamente cualquier tipo de tumor, las vacunas contra el cáncer están impulsando el interés de los oncólogos clínicos. Un paso clave en el desarrollo de vacunas básicas cáncer es la implementación de las estrategias de vacunación que permiten la inducción consistente de la respuesta inmune a los antígenos tumorales. A este respecto, la elección de los antígenos apropiados, basado en la frecuencia y la especificidad de su expresión en tejidos de cáncer, es de suma importancia. antígenos de cáncer /testículo (CTA) [9], [10], [11], [12], que incluyen el antígeno Sp17 [9], [13], [15], están surgiendo [14] [16] como candidatos prometedores para objetivos específicos inmunoterapéuticos. CTA representan una subclase de antígenos asociados a tumores (TAA) que son antígenos propios no mutadas expresadas o sobreexpresados en tumores, y reconocido por células T CD8 [12], [14], [17], [18], [19], [20]. La proteína inmunogénica Sp17 ha sido ampliamente caracterizado [10], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Sp17 humano está altamente conservada, que tiene 70% de homología con el conejo y el ratón, y el 97% de homología con babuino [25]. Sp17 tiene un peso molecular de 17,4 KDa, está codificada por un gen localizado en el cromosoma 11, y se expresa de forma aberrante en los cánceres de origen histológico no relacionada [25], incluyendo el mieloma múltiple (MM) y OC [21], [22]. CTL Sp17-específico, generado a partir de donantes normales, MM y los pacientes de OC, se ha demostrado para matar líneas de células tumorales con HLA compatible y células tumorales frescas que presentan epítopos SP17 unidos a HLA de clase I moléculas [13], [14], [21] . Estas observaciones apoyan los estudios recientes que sugieren que Sp17 puede ser un antígeno adecuado para la inmunoterapia en OC [13], [25]. Las proteínas recombinantes se utilizan comúnmente en el desarrollo de vacunas antivirales, y pueden constituir atractivos vacunas antitumorales candidato [11], [26], [27], [28], [29]. células profesionales presentadoras de antígeno (APC) detectan patógenos a través de una variedad de receptores tales como los receptores tipo Toll (TLR), que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos, incluyendo oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODN) dentro de las secuencias que flanquean definidos [27], [ ,,,0],29], [30], [31]. motivos CpG, que se expresan con frecuencia en el genoma bacteriano pero genómicamente suprimida en vertebrados, se consideran extraños por el sistema inmune y, como resultado, estimular los mecanismos de defensa del huésped [11], [27], [29], [32], [33], [34]. CpG-ODN presentan un gran potencial en el tratamiento terapéutico de cáncer debido a su capacidad para activar la inmunidad innata y adaptativa [15], [26], [27], [28]. El CpG TLR9 de unión induce la secreción de citocinas Th1, incluyendo IFN-γ y TNF, y la producción de IgG2a específica del antígeno por las células B [11], [12], [32], [33], [34]. En este estudio, se evaluó la respuesta inmune profiláctica y terapéutica provocada por la vacunación repetida con la proteína recombinante Sp17 se administra con CpG. Se utilizó la línea celular murina OC ID8, derivado de una espontánea
in vitro
transformación maligna de las células epiteliales de la superficie del ovario C57BL /6 ratones para inducir el crecimiento del tumor en ratones [34]. Nuestros resultados muestran por primera vez que imprimación con proteína Sp17 y CpG es una estrategia eficaz para inducir la terapia OC durable.
Resultados Caracterización de Sp17 y la expresión de MHC-I en las células ID8
mRNA Sp17 (Figura 1a) y la proteína Sp17 (Figura 1b) se detectaron en la línea celular ID8. Además de la caracterización por inmunocitoquímica (CPI) e inmunofluorescencia (IF) reveló citoplasmática y la superficie de la tinción de estas células (Figura 1c). El cytospin de ID8 permeabilizaron células (P) presenta una tinción citoplásmica positiva para Sp17, que fue confirmado por IF. Adicionalmente, las no permeabilizadas (NP) Las células también muestran una expresión clara a través de IF (Figura 1c, cuadrantes inferiores) aunque menos por la CCI (Figura 1c, cuadrantes superiores). Estamos analizarse más expresión en la superficie Sp17 a través del análisis de citometría de flujo mostró que la alta frecuencia de Sp17 células positivas (figura 1d). Del mismo modo, el análisis de citometría de flujo reveló que 60% de las células ID8 manchado positivo para MHC-I en condiciones de cultivo basal, mientras que la adición de 100 IU /ml de IFN-γ durante 72 horas resultó en células positivas 98% MHC-I.
Sp17 mRNA en las células tumorales ID8 murinos y en los testículos de ratón (control positivo). Los niveles de mRNA fueron analizados por RT-PCR para la expresión Sp17. Un gen de mantenimiento celular, B-actina, se incluyó como control. Un control de PCR de sólo (sin etapa de RT) no pudo generar un producto, lo que indica que no había contaminación de ADN en las muestras. Además de la RT-PCR (véase la figura 1a), Western blot se llevó a cabo y la figura 1B muestra la expresión de Sp17 a nivel de proteínas. La línea celular ID8 se caracteriza además por una inmunocitoquímica (CPI) e inmunofluorescencia (IF). Esta figura muestra un cytospin de las células permeabilizadas ID8 (P) y una tinción positiva para Sp17 a nivel citoplasma. Además, Sp17 fue confirmada por SI en el citoplasma. Además, en la figura 1c, la no permeabilizadas (NP) las células muestran una expresión clara a través de SI y menos por la CCI. El panel D muestra la caracterización ID8 para la expresión en superficie de Sp17 y MHC-I; isot. ctrl, anticuerpo de control de isotipo; porcentaje indica células con tinción positiva. MHC-I expresión fue evaluada con o sin IFN-g estimulación.
En vivo
crecimiento de las células ID8 después de la inyección intraperitoneal
cuatro dosis diferentes de células ID8 (10
5, 5 × 10
5, 10
6 y 2 × 10
6) se inyectaron en cuatro grupos de ratones (cinco por grupo) para determinar la dosis óptima para la inducción de tumor /formación de ascitis. Cada conjunto de inoculaciones experimentales con diferentes dosis de células ID8 se realizó al menos tres veces. Animales de cada grupo de titulación tumor fueron sacrificados a diferentes puntos de tiempo, en las que se realizó un examen post mortem en animales enteros y los órganos diseccionados (no mostrados). Se observó crecimiento tumoral óptima (en función del tiempo y la dimensión) con 1 de los 4 condiciones (2 × 10
6 células ID8) ensayados. La figura 2a muestra que una inyección i.p. inyección de 10
5 células ID8 generó un crecimiento tumoral después de 120 días, mientras que 5 × 10
5 células ID8 generado una masa tumoral /ascitis en 90 días (figura 2b). Una dosis de 106 células mostró un crecimiento de la masa tumoral significativa /ascitis por unos 60 días (Figura 2c) y cuando se inyectaron 2 x 106 células ID8, la masa tumoral /ascitis óptimos se logró en 40 a 45 días (Figura 2d), y la mayoría de las muertes ocurrieron entre 50-65 días, ya sea debido a la masa tumoral o el sacrificio para evitar excesivas molestias para los ratones. La Figura 3a representa un ratón inyectado con la dosis óptima (2 × 10
6) de las células ID8 para generar masa tumoral /ascitis (44 mm de ancho) en menos de 45 días, y un ratón de control (20 mm de ancho) que no se inyectaron con células ID8. La Figura 3b muestra la generación de la ascitis de una inyección ip de 2 × 10
6 células ID8 en menos de 40 días, y también muestra una vista detallada de la cavidad peritoneal de un ratón después de aspirar 22 ml de ascitis, revelando varios metastásico los nodos y las masas tumorales. Además, la figura 3 confirma que las células en el peritoneo de ratones inyectados con células ID8 expresan Sp17 por inmunohistoquímica (IHC), mientras que las células de un ratón sin inyección de tumor fueron negativos para Sp17 (figuras 3e, f y g). Estos resultados muestran que Sp17 se expresa en la línea celular ID8,
in vivo
. Para confirmar la masa tumoral /ascitis originó a partir de las células ID8, especímenes de peritoneal, tumor de masa /nodos, pulmón, hígado, ascitis, el bazo y los ovarios fueron investigados por RT-PCR. Los resultados se muestran en la Figura 3d, (imagen representativa de 5 ratones por experimento, repetido por triplicado) para los ratones inyectados con ID8 (figura 3d-1) y de ratones control (Figura 3D-2). Además, un ensayo de localización basado en la fluorescencia se realizó para detectar células positivas para GFP ID8
in vivo
, y confirmó la localización peritoneal de ID8 células (Figura 3h).
muestra la formación progresiva de ascitis /tumores cuando ip inyectados con células ID8. ID8 ratones inyectados se muestran como m1-m5. Los ratones de control fueron inyectados con PBS solo. 1a muestra los ratones inyectados con 10
5 células ID8. Los tumores no alcanzaron un tamaño significativo hasta después de 150 días. 2b muestra la formación progresiva de la ascitis /tumores cuando i.p. inyectados con 5 x 10
5 células ID8. Los tumores no alcanzaron un tamaño significativo hasta después de 120 días. 2c muestra la formación progresiva de la ascitis /tumores cuando i.p. inyectados con 10
6 células ID8. Los tumores alcanzaron un tamaño significativo de 90-120 días. 2d muestra la progresiva formación de ascitis /tumores cuando i.p. inyectados con 2 × 10
6 células ID8. Los tumores alcanzaron un tamaño significativo en 35-60 días (p & lt; 0,0001); un aumento visible de los ratones se observó a los 30 días.
una muestra en el lado izquierdo de un ratón de control (ancho de ratón 20 mm) no inyectados con células ID8 y en el lado derecho inyectaron un ratón con 2 x 106 células ID8 después de 40 días (ancho de ratón 44 mm). Estos ratones representan experimentos con resultados similares. b muestra la cavidad peritoneal completa de la ascitis inducida de una inyección ip de 2 × 106 ID8 en 40 días (izquierda) y una bella vista de la cavidad con varios linfáticos metastásicos y masas tumorales (centro y derecha, después de aspirar 22 ml de ascitis) . c muestra una peritoneo negativo para Sp17 de un ratón control no inyectado con células ID8. f muestra una expresión positiva de Sp17 en el peritoneo de un ratón inyectado con 2 × 106 células ID8 después de 40 días. Testis es el control positivo para Sp17 por ICH (g). La figura D muestra PCR para el ADN Sp17 (y el control B-actina): un panel de tejido derivado de (1) los órganos de un ID8 2 × 106 inyectaron ratón fue positivo para Sp17 y un panel de tejidos derivados de órganos de un ratón sano revelado sin expresión de SP17. También se muestran los controles positivos (ID8 y testículo) para Sp17. Panel h muestra en imágenes de fluorescencia in vivo de un control (izquierda) y con inyección de ID8 ratón (derecha) para la localización de las células GFP-positivas ID8.
regímenes de inmunización y la medición del crecimiento del tumor
Los ratones fueron vacunados con diferentes formulaciones: SP17 solamente; Sólo CpG; y Sp17 + CpG, co-administrado. Un total de 22 ratones fueron inmunizados con cada formulación de vacuna. Los ratones se inmunizaron por vía intramuscular (i.m.) con 50 g de proteína Sp17 y 20 g CpG en diferentes puntos de tiempo como se detalló anteriormente. La evaluación del crecimiento tumoral y /o ascitis se controló cada tres semanas utilizando pinzas de ingeniero. La supervivencia se siguió hasta que los tumores alcanzaron volúmenes de más de 1.000 mm
3, de acuerdo con nuestras directrices del Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo.
Evaluación de las tasas de supervivencia después de la vacunación Sp17 /CpG profilácticas y terapéuticas
se inyectaron
las células del tumor 30 días después de la 3
er la vacunación del régimen profiláctico, o 21 días antes de la primera vacunación terapéutica. Todo Sp17 + CpG ratones vacunados (100%) estaban libres de tumor 91 días después de la inyección del tumor con células ID8 (2 × 10
6), mientras que ninguno de los animales no vacunados (ID8 solamente) estuviera vivo. La figura 4a muestra las tasas de supervivencia de los ratones que recibieron las vacunas profilácticas: 12,5% de Sp17 + CpG ratones vacunados desarrollaron pequeñas masas tumorales y ascitis después de 91 días y murió después de 180 días con tumores de carga pesada. Por otra parte, el 8% de los ratones vacunados desarrollaron tumores y ascitis, y murió después de 200 días. Sin embargo, los tumores eran significativamente más pequeños que los tumores de ovario de los ratones de control que fueron vacunados sólo con PBS. La supervivencia global de Sp17 + CpG ratones vacunados fue del 79% durante más de 300 días. El análisis realizado por una prueba de log-rank (Mantel-Cox) mostró que las curvas de supervivencia global fueron estadísticamente significativas (p & lt; 0,0001) en el grupo vacunado con Sp17 + CpG en comparación con el resto de titulaciones de vacunas. La figura 4b muestra las tasas de supervivencia de los ratones que recibieron las vacunas terapéuticas. Menos del 11% de Sp17 + CpG ratones vacunados desarrollaron pequeñas masas tumorales y ascitis después de 150 días y murieron después de 210 días de los tumores de carga pesada. Además, menos del 10% de los ratones vacunados desarrollaron tumores y ascitis, y murió después de 280 días. La supervivencia global de Sp17 + CpG ratones vacunados fue del 80% durante más de 300 días. El análisis se realizó por un Log-rank (Mantel-Cox) de prueba y demostró que las curvas de supervivencia global fueron estadísticamente significativas (p & lt; 0,0001) en el grupo vacunado con Sp17 + CpG en comparación con los otros titulaciones de vacunas. Por último, los grupos de control vacunados con Sp17 solos y solas CpG mostraron alguna o ninguna protección, que no fue estadísticamente significativa (figura 4a y 4b).
La supervivencia global de los ratones de los cuatro ensayos de profilaxis (a) o terapéutico (b grupos), que se detallan en el texto (libre de tumor, Sp17 + CpG vacunados, vacunados, vacunados Sp17 o CpG). los ratones portadores del tumor fueron por vía intraperitoneal inyectados con 10
6 células ID8 tanto para los regímenes profilácticos y terapéuticos. Se inyectaron células tumorales 30 días después de la 3
er la vacunación del régimen profiláctico, o 21 días antes de la primera vacunación terapéutica. En el grupo terapéutico, la diferencia media en peso entre los animales desafiados con el tumor y libres de tumor era de 10 gramos al inicio del régimen de vacunación. pantallas de ejes horizontales tiempo expresado en días desde el inicio del tratamiento. log-rank test indica diferencia estadísticamente significativa entre los no vacunados y Sp17 + CpG vacunados frente al grupo no vacunado o tratado CpG (p & lt; 0,0001). tanto para los regímenes
respuestas de anticuerpos Medición de Sp17-específicos y por la expresión de citoquinas ELISA ensayo
Análisis de la respuesta de anticuerpos Sp17-específica generada en los ratones vacunados se muestra en la figura 5. el ensayo ELISA representante se realizó para analizar la respuesta inmune a partir de 3 diferentes formulaciones de vacuna: Sp17 + CpG; Sólo CpG; y sólo Sp17. vacunaciones posteriores aumentaron las respuestas de anticuerpos anti-Sp17 específicos en comparación con la primera vacunación. En la figura 5b, puso de manifiesto una alta cantidad de anticuerpos anti-SP17 específicas de ambas formulaciones SP17 a las 3
er la vacunación. Exploramos el calendario de vacunación repetida debido a que, en un entorno clínico, los pacientes que están en remisión a menudo se continuaron para ser vacunados de manera que no hay ninguna recurrencia del tumor. Sin embargo, hubo una ligera disminución de la cantidad de la respuesta inmune en comparación con el 3
vacunación rd análisis en las tres formulaciones en el 9
TH vacunación (figura 5c), pero anti-Sp17 los niveles de IgG en Sp17 + CpG vacunados grupo eran todavía estadísticamente mayor en comparación con las otras formulaciones de vacuna (p & lt; 0,001). En el grupo de régimen terapéutico, Sp17 + CpG ratones vacunados mostró una significativamente mayor (p & lt; 0,01) la producción de IgG anti-Sp17 después de 270 días, en comparación con los ratones tratados con las otras formulaciones (Figura 5d). En la figura 6 se demostró la expresión de citocinas en día 270 (en el 9
TH vacunación) terapéuticos (6b) regímenes tanto profiláctica (6a) y. Se recogió suero y se analizó por ELISA de ensayo (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF) de los ratones vacunados con Sp17 + CpG y se compara con el suero de ratones vacunados con solo Sp17, CpG solo o PBS solo. Curiosamente, IFN-γ de la Sp17 + CpG ratones vacunados se incrementó en casi dos pliegues en comparación con los animales vacunados Sp17 o alrededor de tres pliegues en comparación con CpG vacunados animales (figura 6a y b). En los ratones vacunados de manera profiláctica, TNF-α de la formulación Sp17 + CpG se incrementó más de tres pliegues, en comparación con el CpG ratones vacunados y sólo dos pliegues en comparación con Sp17 vacunado ratones (figura 6a). incrementos de GM-CSF eran tres veces más altas que en los ratones vacunados con CpG y menos de dos pliegues más arriba contra Sp17 ratones vacunados (figura 6a). En los animales vacunados terapéuticamente, TNF-alfa de formulación Sp17 + CpG se aumentó dos pliegues en comparación con el CpG y con las formulaciones solo SP17 (figura 6b). GM-CSF está representada de dos veces y el incremento de más de un veces en comparación con CpG y SP17 formulaciones solas, respectivamente (Figura 6b). En cuanto a las otras citoquinas, no había ninguna expresión significativa de IL-2, IL-4, IL-5 o IL-10 (figura 6a y b).
se recogió y se analizó por el suero de los ratones sometidos a diferentes tratamientos ELISA para los niveles circulantes de anti-Sp17 IgG. El eje X muestra diluciones en serie de suero. a, b y c muestran los resultados obtenidos en los esquemas de vacunación profiláctica, mientras que d muestra la respuesta de los ratones del régimen terapéutico. En el día 7 (a) la respuesta inmune fue baja para Sp17. En el día 97 (b), la respuesta inmune fue mayor que en el día 7. En el día 270 (c), la respuesta de Sp17 fue poco menos que en día 97.
En el día 300, suero se recogió y se analizó por ELISA para la medición de los niveles de citoquinas indicadas en ratones profilácticamente (A) o terapéuticamente (b) vacunados. Para ambos regímenes, IFN-gamma, TNF-alfa y GM-CSF estadísticamente se detectaron incrementos significativos sólo en Sp17 + CpG ratones vacunados en comparación con los controles (PBS). no se evidenciaron diferencias significativas para la IL-2, IL-4, IL-5 o IL-10 niveles.
Evaluación de CTL respuestas antitumorales
En la figura 7a, el ELISPOT de IFN ensayo -γ se realizó en días 270 (9
TH vacunación) usando células de bazo de Sp17 + CpG ratones inmunizados de forma profiláctica. La estrategia de repetidas vacunaciones en este modelo animal es para reflejar los ensayos clínicos humanos actuales. Estos resultados sugieren que la frecuencia de Sp17-específica CTL aumentó en el grupo óptimo (Sp17 + CpG ratones vacunados) y mostró 220 ± 30 puntos positivos en las células de bazo frente a la Sp17 vacunados (184 ± 18) y frente a los ratones vacunados con CpG que eran tan bajos como 9 ± 2. En la figura 7b, el ensayo de TNF-α ELISPOT se realizó el día 270 (9
º vacunación profiláctica de lo previsto) usando células de bazo de Sp17 + CpG ratones inmunizados (que era la mejor formulación de una respuesta inmune fuerte). Estos resultados sugieren que la frecuencia de Sp17-específica CTL aumentó en el grupo óptimo (Sp17 + CpG ratones vacunados), mostrando 240 ± 35 puntos positivos en las células de bazo en comparación con el Sp17 vacunado solamente (200 ± 31) y en comparación con el CpG ratones vacunados que eran tan bajos como 12 ± 2. Análogamente, en el régimen de vacunación terapéutica, la frecuencia de Sp17-específica CTL aumentó en el grupo Sp17 + CpG con 259 ± 20 IFN-γ y 159 puntos positivos ± 30 TNF-a, en comparación con 100 ± 20 IFN-γ y 70 ± 10 manchas positivas TNF-a en Sp17 y CpG sólo formulaciones, respectivamente (Figura 6C y D). Estos resultados sugieren que en general una reacción inmune alta y específica inducida por Sp17 cuando se coadministra con CpG, sin tener en cuenta el calendario de vacunación adoptado para el ensayo de citotoxicidad por
medición de liberación de 51Cr, los esplenocitos se recogieron en el momento de la 1
st, 3
ª y 9
º vacunación de los ratones vacunados Sp17, CpG ratones vacunados y Sp17 + CpG ratones vacunados. El ensayo CTL mostró fuertes respuestas de CTL en Sp17 + CpG ratones vacunados en comparación con los ratones inmunizados con Sp17 o CpG solamente, tanto en profiláctico (figura 8) y terapéutica (Figura 9) regímenes. Debido a que en las condiciones de cultivo normales ID8
in vitro
, hay una baja expresión de células MHC de clase I moléculas ID8 fueron tratados
in vitro
con IFN (100 UI /ml durante 72 horas) para inducir mayores niveles de expresión, como se informó anteriormente (Figura 1D, panel inferior). células ID8 activadas con IFN-γ se utilizaron como mejores objetivos para el ensayo de citotoxicidad.
En el día 270 (9
TH vacuna) esplenocitos de diferentes formulaciones de los ratones vacunados y los controles fueron recogidos y analizados por ELISPOT ensayo. a, b) la frecuencia de IFN-gamma y TNF-alfa células positivas en las vacunas profilácticas; c, la frecuencia d) de IFN-gamma y TNF-alfa células positivas en vacunas terapéuticas. Estos resultados se presentan como células formadoras de puntos por 10
6 esplenocitos. números de spot representan la media de diez ratones en cada grupo vacunado; bares, SE.
esplenocitos de las tres formulaciones diferentes de ratones y controles profilácticamente vacunados fueron recogidos y analizados por
ensayo de liberación de 51Chromium en día 7 (primera vacuna), 97 (tercera vacuna) y 270 (novena vacuna), usando esplenocitos como células efectoras y ID8 como células diana. Estos resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes. eje de abscisas indican efector: diana
Los esplenocitos de los tres formulaciones diferentes de ratones vacunados y controles terapéuticamente fueron recogidos y analizados por
ensayo de liberación de 51Chromium.. Estos resultados muestran tres experimentos independientes después de tercera vacuna (día 97) y noveno de la vacuna (día 270), utilizando esplenocitos como células efectoras y ID8 como células diana. eje de abscisas indican efector:. ratios objetivo
Evaluación de Th-17 y T-reg frecuencia de células
La figura 10 muestra la frecuencia de las células Th-17 o T-reg en SP17 + CpG vacunado o control de esplenocitos de ratones, se recogieron en diferentes puntos de tiempo (sin tumor: día 0; ID8 solamente: día 45; profiláctico y terapéutico día 270).
Los esplenocitos de los ratones que recibieron las vacunas o los controles profilácticos o terapéuticos (ratones sin tumor o ratones portadores de tumores sin vacunación) se recogieron en diferentes puntos de tiempo (sin tumor: día 0; ID8 solamente: día 45; vacunas profilácticas y terapéuticas: día 270) analizados por citometría de flujo para la medición de una ) J-17 de la población (CD4 /IL-17 de doble positivo) o b) frecuencia de la población T-reg (CD4 /Foxp3 doble positivo).
Tanto las vacunas profilácticas y terapéuticas provocó un aumento significativo en Th-17 y una disminución de células T-reg frecuencias medias (3-y 1,5-pliega respectivamente, Fig. 10) en comparación con los animales no vacunados desafiado-tumorales (prueba t no pareada P & lt; 0,001, para vacunados frente a ratones no tratados control) . Las vacunas terapéuticas y profilácticas que consisten en Sp17 o CpG solo también indujo un incremento de frecuencias Th17; sin embargo, tal efecto no fue significativo (prueba t no pareada p & gt; 0,05, por SP17- o CpG solamente vacunados frente a ratones no tratados control). SP17 o CpG se administra solo reducida frecuencias de la población T-reg en una medida mayor en comparación con las formulaciones SP17 + CpG combinados en ambos regímenes terapéuticos y profilácticos; esta reducción fue significativa en comparación con el tumor desafiado ratones no vacunados (sin pareja prueba t p & lt; 0,01), pero no en comparación con las vacunas Sp17 + CpG (prueba t no pareada p & gt; 0,05).
Discusión
la letalidad del carcinoma de ovario se debe principalmente a la incapacidad de los médicos para detectar la enfermedad en una etapa temprana limitado al órgano y por lo general asintomática, combinado con la falta de terapias eficaces para la enfermedad en estadio avanzado [14], [33], [35], [36]. El diagnóstico tardío y la alta tasa de quimio-resistencia de esta forma de cáncer demuestra la necesidad de nuevas dianas terapéuticas y una mejor comprensión de los mecanismos implicados en la propagación de la CO.
En el presente estudio, se evaluó la eficacia de la proteína recombinante Sp17 más CpG en entornos profilácticos y terapéuticos en el modelo murino ID8. SP17 se ha demostrado aquí que se expresa fuertemente en el citoplasma y en las membranas superficiales de células ID8 (por la CCI, SI y citometría de flujo). Hemos sido capaces de seguir el crecimiento del tumor usando Sp17 como un biomarcador (figuras 1 y 3). Este modelo murino genera ascitis como se muestra en las figuras 3a y 3b, y por lo que parece reflejar la patología de la forma más agresiva y frecuente de la enfermedad de ovario humano en las etapas III y IV. La generación de los nodos de tumor y de fusión del peritoneo también se parece al proceso humano (véase la figura 3b), así como el típico localización peritoneal demuestra
in vivo
por imágenes de fluorescencia (Figura 3h). El uso de este modelo animal se ha informado de diversos estudios relacionados con la orientación tumor y factor de crecimiento vascular [23], [37], pero esta es la primera vez que un homólogo de ratón de un antígeno de tumor humano asociado, Sp17, se ha demostrado que se expresa en un modelo de ratón de OC.
Uno de los principales criterios para decidir qué candidato autoantígeno para orientar las estrategias de prevención o terapéuticos es la creación de una respuesta inmune de una manera segura, y la evidencia sugiere que aquí Sp17 puede ser un candidato tal. Hemos demostrado anteriormente que las células T-SP17 específica adoptivamente transferidas tienen actividad anti-tumor [13], [14], [21], [22], pero la vacunación terapéutica o profiláctica-dirigida de Sp17 no ha sido probado en un modelo de tumor. Estos resultados indican claramente que la co-administración de Sp17 + CpG i.m. inyectada cada 30 días para un total de diez vacunas prevenir la formación de tumores de hasta 300 días, con una tasa de supervivencia de 77% para el grupo profiláctico y 80% para el grupo de vacunación terapéutica. En particular, los efectos de la vacunación en los regímenes profilácticos y terapéuticos fueron similares. Ambos regímenes indujeron una fuerte inmunidad que impedía el crecimiento tumoral en ratones estimulados con el tumor. Los ratones que en última instancia sucumbió a la enfermedad mostró retraso en el desarrollo del crecimiento del tumor en comparación con los ratones no vacunados. Nuestra hipótesis es que nuestro régimen terapéutico será eficaz en el rechazo de otra manera por etapas OC, ya que nuestras vacunas terapéuticas no comenzó hasta que los tumores ID8 mostraron un crecimiento significativo, con características que normalmente se observan en estadio III-IV OC humana, incluyendo el cáncer diseminado más allá de la pelvis, para el revestimiento del abdomen o a los ganglios linfáticos (www.ovariancancer.org) [38]. Tumor de inyección, los animales no vacunados muestra la extensión del tumor al peritoneo, los ganglios linfáticos, los pulmones, el hígado y el bazo. De hecho, la diferencia media en peso entre los grupos desafiado-tumorales y libres de tumor era de 10 gramos, que corresponde a aproximadamente 50% peso medio de los animales antes de las inyecciones tumorales (20 gramos).
La activación de una respuesta inmunitaria fuerte contra Sp17 fue demostrado por ensayos de ELISA y ELISPOT, que muestra un aumento de los anticuerpos anti-Sp17 en ratones suero, expresión de citoquinas asociadas a Th1 y respuestas citotóxicas específicas de tumor. Es de destacar que no reactividad serológica significativa a Sp17 fue detectable antes de la vacunación, lo que indica la capacidad de la vacuna a las células B vírgenes específicas primos. Comparando los resultados de SP 17-títulos de anticuerpos específicos obtenidos con diferentes formulaciones de vacunas terapéuticas, se encontró sólo un pequeño pero evidente aumento de la producción de anticuerpos anti-SP17 en CpG + SP17 animales vacunados en comparación con los otros grupos, especialmente después de la 9
TH vacunación. Por lo tanto, no podemos juzgar si el rechazo del tumor después de la vacunación CpG + SP17 se puede atribuir a respuestas humorales. Dado que las diferencias en los títulos de anticuerpos entre los grupos son pequeños, llegamos a la conclusión de que los de antígenos específicos de la respuesta inmune celular del tumor que detectamos más probable es lograr una mayor contribución al rechazo del tumor en los animales + CpG Sp17-vacunados solamente. Curiosamente, la co-administración de Sp17 + CpG era mejor que Sp17 solo o CpG solo como un adyuvante. Ha sido bien documentado que i.m. inyecciones de proteínas generalmente no inducen respuestas inmunes significativas a menos que se mezclan con adyuvantes [30], [32], [39]. visualización efectiva adyuvantes al menos 2 mecanismos de acción: un efecto de depósito que conduce a la exposición al antígeno prolongada en el huésped, y una capacidad para activar el sistema inmune innato a través de la activación de las células dendríticas (DC) a través de receptores de tipo toll (TLR) [35 ]. A la presentación apropiada de antígenos, que se activa DC juegan un papel clave en la inducción de respuestas de células T [29], [34], [40], [41], [42].