Extracto
En muchos tipos de cáncer, una población lateral (SP) se ha identificado sobre la base de la alta capacidad de flujo de salida, enriqueciendo de esta manera para las células chemoresistant, así como para las células madre del cáncer candidato (CSC). Aquí, hemos explorado si el adenocarcinoma ductal pancreático humano (PDAC) contiene un SP, y si su perfil de expresión génica se asocia con la quimio-resistencia, CSC y el pronóstico. Después de la dispersión en células individuales y la incubación con el reactivo de Hoechst, se analizaron las resecciones PDAC humanos especímenes usando citometría de flujo (FACS). Se identificaron un SP y principal población (MP) en todas las muestras de resección PDAC humanos (n = 52) analizado, pero detectamos inmune (CD45
+) y endoteliales (CD31
+) de las células en esta fracción, junto con las células tumorales . Las células SP y MP, o fracciones purificadas más empobrecido de CD31
+ /CD45
+ células (PSP y PMP), fueron ordenados por FACS y se sometieron a análisis de expresión de todo el genoma. Esto reveló la regulación positiva de genes asociados con la resistencia a la terapia y de marcadores identificados antes en putativo CSC de páncreas. PSP firmas genéticas de 32 o 10 hacia arriba o downregulated genes se desarrollaron y probaron para la competencia discriminatorio entre PSP y PMP diferentes conjuntos de muestras PDAC. El valor pronóstico de los genes PSP fue validado en una gran serie independiente de los pacientes PDAC (n = 78) utilizando el análisis nCounter de expresión (en el tumor
frente
tejido pancreático que rodea) y la regresión de Cox para libre de enfermedad y global supervivencia. De estos genes, los niveles de expresión de
ABCB1
y
CXCR4
se correlaciona con la supervivencia del paciente peor. Por lo tanto, nuestro estudio, por primera vez demuestra que PDAC humano contiene un SP. Esta subpoblación tumor puede representar una diana terapéutica valiosa dadas sus características de expresión de genes asociados y chemoresistance--CSC con un potencial valor pronóstico
Visto:. Van den Broeck A, Vankelecom H, Van Delm W, Gremeaux L, J Wouters , Allemeersch J, et al. (2013) El cáncer pancreático humano contiene una población Side cáncer que expresa Stem Cell-asociados y pronósticos genes. PLoS ONE 8 (9): e73968. doi: 10.1371 /journal.pone.0073968
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 15 de mayo de 2013; Aceptado: 23 de julio de 2013; Publicado: 17 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Van den Broeck et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio con el apoyo del Fondo para la Investigación Científica de Flandes (FWO ASP-08 a 00.379; 3M080177). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de grandes esfuerzos para mejorar su pronóstico, el cáncer de páncreas (adenocarcinoma ductal pancreático o PDAC) sigue siendo una causa importante de mortalidad relacionada con el cáncer [1]. retraso en la detección y la resistencia a la terapia son determinantes críticos de fracaso del tratamiento PDAC. Una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de resistencia terapia es por lo tanto esencial. En varios tipos de cáncer, una población lateral (SP) se ha identificado como una subpoblación que enriquece para células que son quimio y radioresistant debido a la presencia de los transportadores de múltiples fármacos y la capacidad para reparar el daño del ADN y resistir la apoptosis [2]. Sobre la base de su capacidad de flujo de salida, se identifican las células SP-citometría de flujo en el análisis (FACS) como una rama lateral de las células '' Hoechst-bajos después de la incubación con el colorante Hoechst33342 [3].
resistencia a la terapia también se considera una característica particular de los llamados "células madre del cáncer" (CSC) [4]. CSC se cree que sobrevivir terapias convencionales y por lo tanto responsable de recidiva tumoral. Candidatos pancreáticas poblaciones CSC Recientemente se han identificado a partir de marcadores de membrana celular. CD24
+ /CD44
+ /molécula de adhesión celular epitelial (EPCAM)
+ células CD133 y se demostró que las células
+ para mostrar las propiedades de CSC [5], [6]. Sin embargo, sólo se encontró superposición parcial entre estas diferentes poblaciones CSC pancreáticas, lo que indica la necesidad de estrategias de identificación de alternativas. En diversos tipos de cáncer, la SP se ha demostrado que ser enriquecido por CSC fenotipo (similares) y la actividad [7]. En cuanto al cáncer de páncreas, un SP fue encontrado previamente en líneas de células cultivadas [8] - [11], y recientemente, nuestro grupo identificó un SP en los tumores de xenoinjertos crecido a partir de muestras PDAC humanos en ratones inmunodeficientes [12]. Estos SP se demostraron poseer la capacidad quimioresistente. Sin embargo, no se ha demostrado si PDAC directamente del paciente, sin intervenir cultura o expansión en el entorno de acogida murino, también contiene un SP. En el presente estudio, mostramos que PDAC aisladas de pacientes alberga un SP y que este SP expresa genes asociados con la CSC y la quimio-resistencia de páncreas, así como con el pronóstico del paciente.
Materiales y Métodos
las muestras PDAC y Análisis SP
entre 2008 y 2010, las muestras de resección quirúrgica PDAC se obtuvieron de 52 pacientes en el hospital de la Universidad de Lovaina (UZ Lovaina, Bélgica) tras el consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el Comité Ético UZ /KU Leuven antes de la contratación del paciente, y recibió el número de estudio ML3452. El estudio se registró en clinicaltrials.gov con el número NCT00936104. Después de la resección, los bloques tumorales se picaron en trozos pequeños y se incubaron con colagenasa tipo IV (1 mg /ml en medio 199; Invitrogen, Grand Island, NY) durante 2-3 h mientras se dispersa mecánicamente en puntos de tiempo de 20 min regulares. La suspensión de células final se filtró a través de una malla de nylon 40 m (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica), y número de células y la viabilidad determinada. La viabilidad de las células obtenidas después de la dispersión de los tejidos PDAC era rutinariamente ~ 50% y el rendimiento de 400 mm
3 muestras PDAC recién obtenidos fue de aproximadamente 3 × 10
6 células vivas.
SP El análisis se llevó a cabo como se ha descrito antes
3. Las células se incubaron con Hoechst33342 (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica) durante 90 min a una concentración final de 5 g /ml, y se analizaron por FACS (FACSVantage SE, equipado con software DIVA FACS, versión 6.0; BD Biosciences). Los láseres utilizados fueron: UV cercano (375 nm, 10 mW de salida), azul (488 nm, 13 mW) y amarillo-verde (561 nm, 30 mW). Los filtros utilizados fueron: 450/40 Hoechst azul; 630/22 y 610 LP por Hoechst rojo; 530/30 y 520 LP para FITC; y 582/15 para el PE. Se añadió a marcar las células no viables, con exclusión de los desechos en el canal de Hoechst-azul y Hoechst-rojo; yoduro de propidio (Sigma-Aldrich 2 mg /ml). De longitud de onda dual análisis FACS identificó una rama lateral de células Hoechst bajo 'como la SP, verificados adicionalmente por co-adición de verapamilo (100 M; Sigma-Aldrich) que se traduce en reducción del tamaño de SP mediante el bloqueo de la eflujo de colorante a través de múltiples fármacos transportador (s). La población principal (MP) estaba cerrado ya que el grueso de las células 'Hoechst-brillantes ". Para una caracterización adicional, se immunostained células PDAC para el marcador CD31 endotelial y hematopoyético /CD45 marcador inmunológico. Después de la incubación con Hoechst, se disolvieron las células en tampón de tinción (PBS + 2% de FBS), y de fluoresceína (FITC) marcado con anti-CD31 humano y ficoeritrina (PE) marcado con anticuerpos CD45 anti-humanos se añadieron usando diluciones recomendadas por el fabricante (BD Biosciences). Ambos se llevaron a cabo de isotipo (BD Biosciences) y controles positivos. tinciones adicionales que no se realizaron, ya que podrían dificultar su análisis de los resultados de FACS.
Todo el genoma de análisis de expresión mediante microarrays
25000 y 25000 células SP MP (total o empobrecido de CD45
+ /CD31
+ células) fueron ordenados por FACS en solución de lisis frío del Kit RNeasy Micro (Qiagen, Venlo, Países Bajos). El ARN total se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. concentración de ARN y la pureza se determinaron espectrofotométricamente utilizando el sistema de ND-1000 Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) y la integridad del ARN se evaluó mediante una Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Sólo las muestras con ARN Número Integridad (RIN) ≥7.5 se utilizaron para su posterior análisis de microarrays en el VIB Nucleomics Core (www.nucleomics.be). ARN se amplificó con el kit NuGEN Pico WTA (Nugen Tecnologías, Santa Carlos, CA) y posteriormente biotinilado. La mezcla final ARNa se purificó y fragmentada, y después se hibridó en Affymetrix HG U133 Plus 2,0 arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA), seguido de tinción y lavado en una estación de fluidos GeneChip 450 (Affymetrix) de acuerdo con los procedimientos del fabricante. Para medir la intensidad de la señal de la sonda en bruto, fichas fueron digitalizadas mediante un escáner GeneChip 3000 (Affymetrix) y se analizaron con el paquete affy_1.26.0 (Bioconductor, Seattle, WA).
Análisis Estadístico y funcional de los microarrays de datos
los microarrays de datos en bruto se normalizaron dentro de matrices y entre matrices siguiendo el procedimiento robusto multichip media (RMA) [13]. se utilizó para evaluar la detección por encima del fondo, el algoritmo 5.0 MAS (Affymetrix 2001 Microarray Suite guía del usuario, la versión 5). De los 54616 sonda fija, 10255 estaban por debajo de antecedentes y omitidos del análisis adicional. Análisis de Componentes Principales (PCA) se realizó con el paquete de Bioconductor pcurve y se utiliza para calcular las principales fuentes de variación entre las muestras. Para el análisis comparativo entre SP y MP, los datos fueron emparejados por paciente. El paquete limma de Bioconductor se utilizó para evaluar el contraste entre SP y MP [14]. La significación estadística de esta diferencia se probó con una prueba t moderado (implementado en limma). Es significativo que los genes hasta downregulated-o se definieron como los genes con ≥2 veces el cambio (log
2 SP /o MP≥1 ≤-1), en combinación con p & lt; 0,001. esquemas clásicos para ajustar para múltiples pruebas puede dar como resultado un bajo poder estadístico de los estudios de microarrays. El estricto corte de p & lt; 0,001 se utilizó como alternativa, enfoque pragmático para equilibrar el número de falsos positivos y falsos negativos [15]. están disponibles en la Expresión Génica Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) a través del número de serie de la adhesión GSE42404 datos de expresión génica. la vía de análisis funcional en todos los conjuntos de sonda significativamente expresados diferencialmente se realizó con el programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com; Redwood City, CA), construido sobre la base de conocimientos Ingenio, una base de datos manualmente comisariada la literatura. Todos los conjuntos de sonda con un valor de p & lt corregido; 0,001 y un pliegue del cambio de & gt; 2 o & lt; -2 se han utilizado como entrada. En caso de múltiples sondas que se refiere el mismo gen, el registro promedio
2-relación entre el conjunto de valores de entrada para este gen fue tomada para su posterior análisis. redes generadas fueron ordenados por un marcador significa importancia, que se calcula como la relación entre el número de sondas de entrada que asignan a la vía dividido por el número total de sondas de la vía. Importancia de las funciones biológicas y las vías canónicas fueron probados por la prueba exacta de p-valor de Fisher después de la aplicación del método de Benjamini-Hochberg de múltiples pruebas de corrección. Pathways se consideraron significativas cuando p & lt; 0,05. Adicional identificación de las funciones biológicas (ontología de genes, GO) y KEGG (Kyoto Enciclopedia de genes y genomas) itinerarios se realizó utilizando la base de datos de anotación, y Visualización Integrada Discovery (DAVID, versión 6.7, http: //www.david.abcc. ncifcrf.org). Para este análisis, la sonda fija con un valor de p & lt corregido; 0,001 y a & gt; 2,0 veces el cambio se utiliza como entrada. La facilidad Resultado, una prueba p-valor exacto de Fisher modificada, se utilizó para ajustar para múltiples pruebas.
Desarrollo de un gen Firma
Una estrategia de aprendizaje supervisado se aplicó a los datos de microarrays de la CD45
- /CD31
- SP y MP poblaciones (es decir, el SP purificada o PSP, y el PMP). Una lista de 200 genes de interés se compone basa en un estudio de la literatura a fondo mediante los siguientes términos: "el cáncer de páncreas", "cáncer de células madre", "parte de población", "vías canónicas ',' genes stemness ',' transición epitelio mesénquima (EMT) "," resistencia a múltiples fármacos "," oncogenes "y" genes Polycomb '. Los datos procesados previamente se limitan a 512 conjuntos de sonda (195 genes) que tenían los símbolos de genes en la lista de 200 genes de interés. En total, se utilizaron 29 criterios de clasificación diferentes, lo que representa varias combinaciones de modelos de clasificación de 5, 3 modos de selección de características y métodos de clasificación 3 [16]. La evaluación de estos enfoques se hizo utilizando la licencia-un-out-validación cruzada (LOOCV) para crear un receptor de funcionamiento (ROC) curva característica [17]. Los métodos de selección univariado resultó tener ningún valor añadido desde el enfoque óptimo con mayor área bajo la curva ROC (AUC) y la menor tasa de error equilibrado (BER) consistió en una máquina de vectores de soporte sin la clasificación de entidad o selección previa (datos no mostrados ). Para reducir aún más la firma de genes, se utilizó la estrategia de PINTA para la priorización de genes candidatos [18]. Al observar la expresión diferencial de la vecindad de un gen en una red de interacción proteína-proteína en todo el genoma, la estrategia PINTA realiza efectivamente la función de selección multivariante mediante la incorporación de un conocimiento previo de la biología molecular. Un grupo de 32 genes fue asignado como significativas, y se eligieron los conjuntos de sonda con el nivel de expresión más alto. Por último, la firma PINTA se redujo aún más a esos 10 genes con el mayor cambio veces (arriba o abajo).
El valor predictivo del 32-gen y la reducción de la firma de 10 genes se validó con LOOCV en diferentes SP
conjuntos de datos frente
MP.
Análisis nCounter
entre 2006 y 2010, se recogieron muestras de tejido, después de consentimiento informado, de los pacientes que fueron sometidos a resección pancreática para el PDAC. Las muestras se almacenaron a -80 ° C en RNAlater (Qiagen). Desde el tumor primario de 143 pacientes y de los alrededores de páncreas no tumoral (control) de tejido de 14 pacientes, el ARN total se extrajo usando el kit RNeasy Mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Sólo las muestras con un número de integridad del ARN (RIN) de & gt; 7,0 se utilizaron para su posterior análisis, es decir, 78 muestras PDAC (relación mujer /varón: 41/37; edad: 32-80 años con una mediana de 64 años) y 6 tejidos de control (razón hombre /mujer: 4/2; edad: 51-66 años con una mediana de 63 años). Se proporcionan las características del tumor y las características de pronóstico (con un seguimiento hasta julio de 2011) de los 78 pacientes (véase el cuadro S1). Utilizando el sistema de nCounter (Nanostring Technologies, Seattle, WA), los niveles de expresión de los genes de la firma anteriormente definidos se cuantificaron en tumor pancreático
frente
tejido circundante (VIB Nucleomics Core) [19].
ABCB1 la inmunohistoquímica en PDAC resección especímenes
para analizar la expresión de la proteína ABCB1 por inmunohistoquímica, se prepararon 5 micras secciones a partir de muestras PDAC incluidas en parafina fijadas con formalina de los 11 pacientes cuyos PSP y ARN PPL fueron utilizados para el análisis de microarrays. Después de la desparafinación y rehidratación de las diapositivas, recuperación diana se realizó con EnVision Solución FLEX Target Recuperación (Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 20 min. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada utilizando reactivo EnVision peroxidasa de bloqueo (Dako) durante 5 min. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario (ABCB1 anti-humana de Monosan, Uden, Países Bajos) a la dilución recomendada (1/20) durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, los portaobjetos fueron procesados con el Envision Dual Link (Dako). El complejo se visualiza con DAB (3,3'-diaminobenzidina; Dako), seguido de una tinción de contraste con hematoxilina (Dako). Imágenes fueron tomadas con una cámara Leica DC 300 en un microscopio Leica DMLB
Análisis estadístico
software estadístico SAS (versión 9.1; SAS Institute, Cary, NC). Se utilizó para todos los análisis estadísticos. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. supervivencia libre de enfermedad (DFS) y supervivencia global (SG) se calcularon utilizando el método de Kaplan-Meier (Tabla S1). Para probar el valor pronóstico de los genes, el análisis univariado para SLE y la SG se realizó mediante regresión de Cox con y sin estrías cúbicos restringidos (RCS), seguido de un análisis multivariado para el sistema operativo mediante regresión de Cox. Un modelo seleccionado se utilizó para el análisis independiente de las variables ya se correlacionaron con la supervivencia (ECLNI, género, pM y PT; véase el cuadro S1).
Resultados
El cáncer pancreático humano contiene una población Side
muestras de resección PDAC humana se analizaron para la presencia de una población lateral (SP). En todas las muestras examinadas (n = 52), se identificó un SP que representa entre el 0,2 y el 21,5% (mediana: 1,8%). PDAC de las células totales (Fig. 1A)
A) del gráfico de puntos de doble longitud de onda de análisis FACS de células PDAC humanos frescos después de la incubación con Hoechst33342 que representa una cola de las células 'Hoechst bajo' (SP), en relación con una mayor mayor de células 'Hoechst-brillantes ", la población principal (MP) (
izquierda Panel
). Un ejemplo representativo se muestra y la proporción indicada SP. células PI
POS (muertos) se excluyeron del análisis de Hoechst33342, CD45 y CD31 etiquetado. El diagrama de caja (
inserción
) resume las proporciones SP de 52 muestras analizadas PDAC. bloques verapamilo Hoechst flujo de salida, lo que reduce el tamaño de la SP y confirmar el fenotipo SP (
panel de la derecha
). B) FACS diagrama de puntos de la PDAC SP, a inmunotinción para CD45 y CD31. Se muestra un ejemplo representativo. Los números indican las proporciones de CD45
+, CD31
+ y CD45
- /CD31
- células dentro de la SP. Análisis C) Componentes Principales (PCA) de los perfiles de expresión de todo el genoma obtenidos de CD45
- /CD31
- SP (PSP,
rojo
) y CD45
- /CD31
- MP (PMP,
azul
) (n = 11). D) Tinción inmunohistoquímica de ABCB1 en muestras de resección PDAC (n = 11). Se muestra un ejemplo representativo (4% SP en el análisis FACS). Aumento original: x200 (
izquierda) y x400 (
derecha) guía empresas
células de la población principal '(MP) (SP y ver la figura 1A para.. gating) fueron ordenados por FACS y se sometió a todo el genoma de perfiles de expresión (n = 10 PDAC). Ingenuity Pathway Analysis (IPA) reveló en los genes y las vías SP relacionados con los procesos inmunológicos, tales como 'la diferenciación de células T-helper', 'La comunicación entre células del sistema inmune innato y adaptativo "y" maduración de las células dendríticas' (datos no mostrados). células de tipo inmune, así como células endoteliales, son conocidos para co-segregar en mayor o menor grado en el SP de tejidos y tumores. Por lo tanto, analizamos la humana PDAC SP por citometría de flujo para la expresión de la CD45 marcador inmunológico /hematopoyético y el CD31 marcador endotelial. Alrededor del 60% de las células SP son CD45
+ (mediana: 61,4%, rango: 19,5-75,4%; n = 18), mientras que sólo un pequeño número de células SP son CD31
+ (mediana: 0,7%, rango: 0,2 a 2,1%; n = 15) (Fig 1B).. También se observaron CD45
+ y CD31
+ células en el MP a niveles comparables (mediana de 63,7% y 1,6%; y rango: 41,1-75,4% y 0,1-6,7%, respectivamente). Para los análisis posteriores, el SP y MP se agotaron desde el CD45
+ y CD31 +.
El purificada PDAC SP muestra la expresión de genes asociados a CSC
Estamos ordenados el CD45
- /CD31
- SP y CD45
- /CD31
- células MP (designados en adelante SP como purificada o PSP, y MP purificada o PMP, respectivamente) a partir de 11 muestras de PDAC y otra vez realizado todo el genoma de perfiles de expresión. Análisis de Componentes Principales (PCA) muestra que el cluster PSP y Separar de los reproductores portátiles de música (figura 1C).
De los 1861 conjuntos de sondas que son expresados diferencialmente (≥2 veces, p & lt; 0,001)., 993 son regulada al alza en el PSP y 868 son downregulated (véase GEO, número de acceso GSE42404). El transportador de múltiples fármacos
ABCB1 gratis (
MDR1
,
P-glicoproteína) está altamente regulada positivamente en la PSP
frente
PMP (doblar: 5.3, p & lt ; 0,001), y es potencialmente subyacente en el fenotipo SP. El análisis inmunohistoquímico confirmó la expresión de ABCB1 en las células tumorales PDAC, que se encuentra principalmente en la superficie apical de las células (n = 11 muestras PDAC; Fig. 1D).
ABCG2
, otro transportador que puede mediar flujo de salida de SP, no se expresa diferencialmente (p & gt; 0,5), pero la señal de microarrays fue en general bajo y no de fondo por encima de la mitad de las muestras. Curiosamente, se ha descrito previamente marcadores pancreáticos (incluyendo CSC
CD44, CD133
y
CXCR4
) se sobreexpresan significativamente en la PSP (Tabla S2). Además, otros (cáncer) '' stemness genes (como
LGR4, SOX9, KLF5
y
MET
) también están regulados positivamente en la PSP.
De todos expresados diferencialmente sonda fija de 1690 podría ser asignada a los genes en la base de conocimientos Ingenio y se sometieron a IPA (Tabla S3). Las redes más regulados positivamente en la PSP son 'metabolismo de los aminoácidos "(que incluye
HNF4A
o" factor nuclear de hepatocitos 4 alpha', doble: 2,7, p & lt; 0,001), 'la célula a célula de señalización' ( que incluye
TJP2
o "proteína de unión estrecha 2 ', doble: 2,4, p & lt; 0,001) y' el crecimiento celular y la proliferación" (que incluye
EPHA2
o "Efrina receptor A2 ', veces : 2.1, p & lt; 0,001; y
EphA4
, doble:. 2.6, p & lt; 0,001)
las funciones biológicas enriquecidas en la PSP
frente
PMP abarcan "movimiento celular ',' señalización célula a célula y la interacción "," el crecimiento celular y la proliferación ',' El desarrollo embrionario "," tumor morfología 'y' cáncer '(Tabla S3). Para discriminar entre PSP- y funciones biológicas asociadas-PMP en más detalle, se aplicó análisis de DAVID. Las agrupaciones relacionadas con la 'unión de células teléfono' (Puntuación de enriquecimiento o ES: 6,8), 'actividad de la proteína quinasa' (ES: 3,4), "desarrollo" (ES: 3,0), 'activadas por mitógenos (MAP) la actividad quinasa' (ES: 1.8), 'señalización de la integrina' (ES: 1,6) y 'la regulación de la apoptosis "(ES: 1,4) se enriquece en la PSP
vías canónicas, a partir de los genes expresados diferencialmente, también se analizaron utilizando IPA.. Una serie de 46 vías canónicas llegó a la significativa SP enriquecimiento de corte de p & lt; 0,05, incluyendo 'células madre embrionarias de pluripotencia Humano', 'señalización unión estrecha', 'la señalización NF-kappa B', 'la señalización /β-catenina vía', 'señalización de la integrina' y 'de señalización Efrina' (Tabla S3). Un análisis más detallado mediante DAVID (KEGG vías) mostró regulación al alza de la "vía de señalización de ErbB '(incluyendo
ErbB3
, doble: 2,1, P & lt; 0,001). En la PSP
firmas de genes que discriminan PDAC PSP desde el PFP
el uso de una estrategia de aprendizaje supervisado aplicado a los datos de expresión de todo el genoma de la 11 CD45
- /CD31
- pares PSP y PMP como se ha analizado anteriormente, se desarrolló una un conjunto de 512 conjuntos de sonda (195 genes) como potencial 'pSP firma genética ". La precisión para discriminar entre PSP y pMP utilizando esta firma fue del 95% en la cohorte de formación, según se evaluó con LOOCV (ver Materiales y Métodos).
Uso de PINTA (ver Materiales y Métodos), esta gran firma genética pSP se redujo a 32 genes, de los cuales 19 están regulados al alza y 13 downregulated (Tabla S4). La validación de este reducido firma genética de PSP en el conjunto de datos original (n = 11 muestras PDAC) demostró una precisión de clasificación el 91% de PSP y PMP, comparable a la predicción mediante la firma de 195 genes. Dentro de la firma de 32 genes, los genes regulados positivamente en la PSP incluyen marcadores previamente CSC pancreáticas propusieron (
CXCR4
,
CD133
) o juegan un papel en la resistencia a múltiples fármacos (
ABCB1
) y en las vías importantes en la tumorigénesis y la progresión tumoral (ver Tabla S4).
Finalmente, se reducían aún más la firma genética de esos 10 genes con mayor plegar hacia arriba o regulación a la baja (Tabla S4, en negrita). La precisión de esta firma genética condensada distinguir PSP desde pMP (90%) es comparable con el poder discriminatorio del conjunto de 32 genes.
Como última prueba del valor discriminante de la 32- y 10- firmas de genes, que aplican ambos conjuntos a una serie adicional, independiente de 10 pares SP /MP utilizando LOOCV. Ambas firmas de genes presentan una precisión de discriminar entre SP y MP de 85%.
Valor pronóstico de ABCB1 y CXCR4
Para investigar si los genes de la PSP (32 y 10-) las firmas de genes tienen valor pronóstico, los niveles de expresión se determinaron primero en una serie independiente de los pacientes (n = 78; Tabla S1) en tumor
frente
tejido circundante utilizando análisis nCounter (ver Materiales y Métodos) y después se sometió a análisis univariado de potencial correlación con el pronóstico /supervivencia. En primer lugar, la firma genes sobreexpresados en la PSP se relacionan con el pronóstico, mientras que no se encontró correlación con la firma genes regulados negativamente en la PSP (datos no mostrados). Por otra parte, la regulación positiva de
ABCB1
y
CXCR4
se correlaciona significativamente con un peor pronóstico, es decir, con el sistema operativo más bajo y DFS (cuadro S5). a continuación, se realizó un análisis multivariante de los genes con p & lt; 0,1 en el análisis univariado (
ABCB1
,
ADAM10
,
CDH1
,
CXCR4
,
ESRP1
,
MMP1
,
Rab25
,
ST14
), designando
ABCB1
como un predictor independiente de mal OS (cuadro S5) .
Discusión
en el presente estudio, se identificó un SP en el cáncer de páncreas humano. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe que describe la presencia de un SP en PDAC de los pacientes analizados. Al igual que en otros tejidos y tumores, el PDAC SP contiene una fracción de CD31
+ células endoteliales y CD45
+ células inmunes [20]. En el presente estudio, nos centramos en el SP no endotelial, no inmune (PSP) y es controlada su perfil de expresión génica. El PSP representa principalmente las células epiteliales tumorales debido a la alta expresión de
CDH1
,
EPCAM, TJP1
y
TJP2
[21]. En este PDAC pSP encontramos la regulación positiva de la multidrug transporter
ABCB1
, que puede ser responsable de la quimiorresistencia de estas células. La inmunotinción confirmó la presencia de ABCB1 en PDAC, que se encuentra principalmente en la superficie apical de las células tumorales que se puede producir el transporte del fármaco activo. La regulación positiva de factores reguladores de la apoptosis (
Bcl2L11, España veces: 2,9, p & lt; 0,001;
EPHA2
, ver resultados) en la PDAC pSP puede apoyar aún más su carácter quimioresistente. Recientemente hemos demostrado que la SP es muy resistente a la gemcitabina en un modelo de ratón en el que PDAC se hizo crecer como xenoinjertos [12]. Resistencia de la SP a la gemcitabina También se ha informado en las líneas celulares de cáncer de páncreas
in vitro
[8], [9], [11]. En su conjunto, el SP parece representar una subpoblación quimioresistente del tumor de páncreas, y por lo tanto puede ser uno de los culpables del fracaso del tratamiento y la recurrencia del cáncer.
En varios tipos de cáncer, el SP se enriquece por el candidato CSC [7], [22]. Se encontró que los marcadores identificados recientemente en las poblaciones putativos CSC de cáncer pancreático humano, están regulados por incremento en el PDAC PSP. Además, se han detectado algunos otros marcadores de cáncer stemness '' (por ejemplo,
LGR4, SOX9, KLF5, MET
), así como los factores relacionados con la embriogénesis-pancreáticas que pueden ser re-iniciado en CSC (por ejemplo,
HNF4A
) [5], [6], [23] - [26]. Por otra parte,
in silico
análisis funcional de la expresión de datos pone de manifiesto la aparición de vías de desarrollo embrionario y la pluripotencia de células madre embrionarias en el PDAC SP, más el apoyo a su "troncalidad '. También en líneas celulares de cáncer de páncreas, el SP apareció enriquecido en CSC [9] - [11]. Sin embargo, está claro que se necesitan más pruebas para demostrar de manera concluyente el fenotipo CSC de la PSP, incluyendo la actividad tumorigénico
in vitro gratis (formación de esferas) y
gratis (el crecimiento del tumor in vivo en ratones inmunodeficientes ).
El PDAC pSP puede representar una diana terapéutica interesante dado su carácter asociado y chemoresistance--CSC. Las células PSP expresan altos niveles de
CXCR4, España, que tras la activación, pueden estimular las células se muevan o se sometan a 'transición epitelio-mesenquimal' (EMT), un proceso de conducir la progresión del cáncer y los tumores malignos. En líneas celulares de cáncer de páncreas, el SP de hecho puede ser activado hacia EMT cuando son tratados con TGF [21]. En el PDAC PSP, se observó la regulación positiva de
SMAD3
, conocido para mediar en la señalización de TGF. Más interesante,
CXCL12
, el ligando de CXCR4, es altamente expresado en el tejido pancreático circundante del tumor PDAC (datos no mostrados) y pueden atraer células del tumor para la invasión o mayor difusión. En analogía, la expresión de CXCR4 se ha encontrado para caracterizar una subpoblación de la CD133
+ pancreático CSC que parece ser el responsable de los de la metástasis del tumor [6], [27].
Upregulation de
EPHA2
y
EphA4 Hoteles en la PSP está en línea con un importante papel de la vía de señalización Efrina en PDAC patogénesis. Expresión de EPHA2 en PDAC se ha asociado con el aumento de la capacidad invasiva y metastásica y pobre supervivencia [28]. Desmontables expresión EphA4 disminuye PDAC la viabilidad celular [29]. Además, se encontró que la vía de señalización de ErbB es upregulated en la PSP (KEGG análisis), incluyendo la más alta expresión de
ErbB3
. El receptor ErbB3 juega un papel crucial en el desarrollo de páncreas, así como en la tumorigénesis de páncreas. La sobreexpresión de
ErbB3
se correlaciona con la etapa avanzada PDAC y la disminución de la supervivencia global, y recientemente, su papel como potente mediador de la señalización de PI3K se ha puesto de relieve [30], [31]. Por otra parte, la activación de ErbB3 puede ser esencial en la resistencia a la inhibición de EGFR de un solo agente. inhibir específicamente la actividad ErbB3 (por ejemplo, con MM-121) resulta prometedora
in vitro, España y por lo tanto también pueden tener potencial clínico [31]. Tanto las vías de señalización Ephrin y ErbB pueden presentar posibles dianas terapéuticas en PDAC. Cabe señalar que nuestro estudio no examinó el valor pronóstico de
EPHA2
y
ErbB3
ya que estos genes no se incluyeron en los PSP firmas evaluadas contra la supervivencia.
La desarrollados firmas genéticas PSP confiadamente discriminan la PSP desde el PMP. Algunos de los genes regulados positivamente están relacionados con CSC 'stemness cáncer' /como
CXCR4, CD133, EPCAM
y
SOX9
[5], [6], [24], mientras que otros son asociado con la apoptosis (
FASLG, TJP2, DUSP4
), la vía MAPK (
MAP2K4, DUSP4
), y la quimio-resistencia (
MMP1
, un
ETS1
gen diana) [32], [33]. Además, la firma contiene genes relacionados con el aumento de la motilidad y la invasión (
ADAM10, Rab25, DUSP4, CXCR4
). También algunos de estos genes pueden representar objetivos prometedores.
Por último, se evaluó la relevancia pronóstica de los genes incluidos en las firmas PSP.
CXCR4
y
¿Cuáles son ABCB1 una relación negativa con la supervivencia después de la resección curativa, que también se encuentra en otros informes [34], [35].