Extracto
células de cáncer cervical comúnmente albergan una defectuosa G
1 /S de control debido a la interacción de oncoproteínas virales con p53 y la proteína de retinoblastoma. La activación de la G
2 /M puesto de control puede así ser esencial para la protección de las células de cáncer de insultos genotóxicos, como la quimioterapia. En 52 pacientes con cáncer de cuello uterino tratados con quimioterapia neoadyuvante, se investigó si los niveles de fosforilados Wee1 (pWee1), un G tecla
2 /M quinasa de control, y γ-H2AX, un marcador de ADN doble filamento se rompe, discriminados entre los pacientes con una respuesta patológica completa (pCR) y aquellos con enfermedad residual. También probamos la asociación entre pWee1 y Chk1 fosforilada (pChk1), una quinasa que actúa aguas arriba Wee1 en el G
puesto de control vía 2 /M. pWee1, γ-H2AX y pChk1 se evaluaron retrospectivamente en biopsias de diagnóstico mediante técnicas de inmunohistoquímica. Los grados de expresión y pWee1 pChk1 se definen mediante tres métodos diferentes de clasificación, es decir, la intensidad de tinción, la puntuación Allred, y una puntuación multiplicativo. gamma-H2AX se analizó tanto como variable continua y categórica. Independientemente de la clasificación utilizada, los niveles elevados de pWee1 y γ-H2AX se asociaron significativamente con una menor tasa de PCR. En los análisis univariados y multivariados, pWee1 y γ-H2AX se asociaron con una reducción de la PCR. La validación interna llevada a cabo a través de una re-muestreo sin procedimiento de sustitución confirmó la solidez del modelo multivariado. Por último, encontramos una asociación significativa entre pWee1 y pChk1. El mensaje transmitido por el presente análisis es que los biomarcadores de daño y reparación del ADN pueden predecir la eficacia de la quimioterapia neoadyuvante en el cáncer de cuello uterino. Se necesitan más estudios para validar de forma prospectiva de estos alentadores resultados
Visto:. Vici P, S Buglioni, Sergi D, L Pizzuti, Di Lauro L, Antoniani B, et al. (2016) El daño y la reparación del ADN biomarcadores en el cáncer cervical pacientes tratados con quimioterapia neoadyuvante: un análisis exploratorio. PLoS ONE 11 (3): e0149872. doi: 10.1371 /journal.pone.0149872
Editor: Yanchang Wang, de la Universidad del Estado de Florida, Estados Unidos |
Recibido: 3 de diciembre de 2015; Aceptó 7 de febrero de 2016; Publicado: 1 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Vici et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas : ATM, ataxia-telangiectasia mutada; ATR, la ataxia telangiectasia y la proteína relacionada con Rad3; Chk1, Checkpoint quinasa 1; Chk2, Checkpoint quinasa 2; DDR, la respuesta al daño del ADN; OSD, rotura de la doble cadena; PCR, la respuesta patológica completa; pChk1, hosphorylated Chk1; gamma-H2AX, fosforilados histona H2A miembro de la familia X; pRb, la proteína retinoblastoma; pWee1, fosforilados Wee1; Wee1, Wee1-como la proteína quinasa
Introducción
Las células eucariotas están constantemente expuestos a fuentes endógenas y exógenas de daño en el ADN. La transmisión de ADN en buen estado a la descendencia está asegurada por una red molecular complejo, la respuesta al daño del ADN (DDR), que opera a través de la actividad coordinada de los puntos de control del ciclo celular, los mecanismos de reparación del ADN y las vías de apoptosis [1, 2]. La presencia de lesiones genéticas desencadena la detención de punto de control mediada del ciclo celular [2]. Este evento permite a los efectores de reparación del ADN y la apoptosis vías para reparar la lesión o eliminar las células dañadas irremediablemente, respectivamente.
Las células cancerosas utilizan mecanismos de reparación del ADN aberrante de sobrevivir en condiciones estresantes, como la exposición a la quimioterapia [2]. Un rasgo común a una variedad de tumores es la naturaleza defectuosa del G
1 /puesto de control de la fase S, derivado de la inactivación mutacional o funcional de p53 o retinoblastoma proteína (pRb) [3]. Cuando esto ocurre, las células cancerosas llegan a ser extremadamente dependientes de la G
2 /M punto de control para la detención del ciclo celular y la reparación del ADN [3]. La proteína ataxia telangiectasia y la relacionada con Rad3 (ATR) quinasa -Checkpoint 1 (Chk1) -Wee1 tipo proteína quinasa (Wee1) cascada representa el núcleo de la G
2 /punto de control de M, cuya activación conduce a la inhibición de la quinasa dependiente de ciclina 1 y culmina en la detención del ciclo celular mediada por puesto de control [3]. De tal manera, las células cancerosas tienen el tiempo para corregir las lesiones del ADN inducidas por quimioterapia, evitando la entrada en una mitosis letal conocido como catástrofe mitótica [4]. G
2 /dependencia punto de control de M en un fondo molecular p53 defectuoso es un concepto explotados actualmente para el desarrollo clínico de la terapéutica basada en la letalidad sintética. Cuando G
1 /S-fase de células de punto de control defectuosos están expuestos a agentes quimioterapéuticos, la inhibición farmacológica concomitante de G
2 /M puesto de control de quinasas es perjudicial para la aptitud de células [3].
razonó que G
2 /M puesto de control "adicción" para compensar p53 o pRb defectos tras la exposición a agentes genotóxicos puede ser explotado en la búsqueda de biomarcadores predictivos que prevén la quimioterapia sensibilidad /resistencia. En este análisis exploratorio nos hemos centrado en el cáncer de cuello de útero, el prototipo de tumores p53 y pRb-defectuosos. De hecho, el virus del papiloma humano oncoproteínas E6 y E7 promueven la degradación mediada por ubiquitina de p53 y pRb, respectivamente [5]. De este modo, de forma retrospectiva investigó la asociación entre los niveles de daño en el ADN y reparación biomarcadores, evaluada en muestras biópticos recogidas de pacientes no tratados en el momento del diagnóstico, y patológica respuesta completa (PCR) después de la quimioterapia neoadyuvante, es decir, la quimioterapia entregado en el plazo de tiempo entre el diagnóstico biopsia y la resección quirúrgica. Todos los pacientes fueron tratados de forma homogénea con paclitaxel, ifosfamida y cisplatino (régimen TIP). Nos centramos en Wee1 fosforilada (pWee1) como proxy del G
2 puesto de control de activación /M, y miembros de la familia fosforilados histona H2A X (γ-H2AX) como un marcador de ADN de doble filamento se rompe. Chk1 fosforilada (pChk1) se puso a prueba en una fracción de las muestras para un estudio de señalización.
Materiales y Métodos
Participantes en el Estudio y Procedimientos
Cincuenta y dos diagnóstico histológico de pacientes con cáncer cervical (estadio IB2-IIIa) que recibieron quimioterapia neoadyuvante se incluyeron en este análisis retrospectivo. Todos los pacientes fueron tratados con el régimen de TIP (paclitaxel 175 mg /m
2 el día 1 + ifosfamida 2500 mg /m
2 en los días 1 y 2 + cisplatino 50 mg /m
2 el día 2 cada 21 días para tres o cuatro ciclos) seguido de cirugía radical. Los pacientes fueron considerados elegibles si completaron el tratamiento planificado, los datos sobre las características clínicas y los resultados del tratamiento estaban disponibles, y la cantidad de materiales biológicos en sus biopsias fueron suficientes para los análisis moleculares. PCR se define como la ausencia de la enfermedad residual en las muestras quirúrgicas. La evaluación inmunohistoquímica de pWee1, γ-H2AX, y pChk1 se realizó en parafina de tejidos fijados con formol (FFPE), obtenida a partir de las muestras biológicas recogidas a través de procedimientos biópticos en los pacientes no tratados, utilizando los siguientes anticuerpos: anti-fosfo-H2AX ( Ser139) (JBW301 clon) anticuerpo monoclonal de ratón (Mab) (Upstate, NY, EE.UU.) a una dilución de 1: 500, anti-fosfo-Wee1 (Ser642) (clon D47G5) de conejo MAb (Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU. ) en la dilución de 1: 100, y anti-fosfo-Chk1 (Ser345) (clon 133D3) Signaling conejo MAb (Cell, Danvers, MA, EE.UU.) a la dilución de 1: 100. La tinción inmunohistoquímica se realizó en un sistema de tinción automática automatizada (ENLACE-III, Leica, Milán, Italia) por una peroxidasa de rábano picante polimérico libre de biotina (HRP) conjugado anticuerpo enlazador sistema (Leica, Milán, Italia). Para cada tumor, se analizaron tres, 3 micras diferentes secciones de parafina y examinadas por microscopía de luz. Inmunoreacción de las células tumorales se contó en cuatro campos de alta potencia (400 aumentos) por sección. pWee1 y pChk1 se consideraron positivas cuando ≥10% de las células neoplásicas mostró una inmunorreactividad nuclear distinta. pWee1 y pChk1 se calificaron en una escala de cuatro grados en base a la intensidad de tinción (0: negativo, 1+: débil, 2+: moderada, 3+: fuerte). Los tumores fueron clasificados como negativos (0 = pWee1
neg y pChk1
neg) o positiva (1-3 = pWee1
pos y pChk1
pos) se obtuvieron puntajes .El Allred como se describe anteriormente [6 ], teniendo en cuenta la intensidad de tinción y el porcentaje de células tumorales que expresan, e indicará con arreglo a una escala de 0 a 8. los tumores fueron clasificados como de bajo expresando si la puntuación Allred fue ≤ 2 (pWee1
Allred baja, pChk1
Allred bajo), o tan alto expresando si la puntuación Allred era & gt; 2 (pWee1
Allred alta, pChk1
Allred alta). Las puntuaciones multiplicativos se obtienen multiplicando la intensidad de tinción x el porcentaje de células tumorales que expresan, y se expresaron en una escala de 0 a 300. Los tumores fueron clasificados como de bajo expresar (pWee1
Multi baja y pChk1
múltiples bajo) o de alta expresión (pWee1
alta múltiples y pChk1
alta múltiples) mediante la puntuación media de todos los tumores como un punto de corte. γ-H2AX expresión se consideró como el porcentaje de células que expresan tumorales y se analiza tanto como (γ-H2AX
cont) continua y variable como categórica, cuya modalidad se definió mediante la puntuación media de todos los tumores (γ-H2AX
baja y γ-H2AX
alto). Las muestras tumorales fueron evaluados de forma independiente por dos investigadores (SB y MC) que fueron cegados a los resultados del tratamiento, y se revisaron los casos discordantes (MM). Este estudio retrospectivo se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de la "Regina Elena" Instituto Nacional del Cáncer de Roma, el centro de coordinación. consentimientos informados escritos fueron asegurados antes de la quimioterapia.
El análisis estadístico
Cáncer- y características relacionados con el paciente se caracterizaron de forma descriptiva para todos los pacientes incluidos en el presente análisis. Las medianas y los rangos se utilizaron para informar sobre las variables continuas, mientras que las variables categóricas se expresan mediante frecuencias y porcentajes. Con el fin de evaluar las relaciones entre las variables categóricas la prueba de Chi-cuadrado de Pearson de la independencia (2 colas) y se emplearon la prueba exacta de Fisher. El uso de modelos de regresión logística univariante ayudó a identificar las variables susceptibles de afectar el resultado del tratamiento. Los modelos de regresión logística multivariante se construyeron mediante la inclusión de las variables de la prueba significativo en la evaluación de una sola variable o identificados en función de la plausibilidad clínica de su papel en la influencia de la PCR. Para estimar el riesgo de un modelo multivariado overfitted y examinar su estabilidad, una validación interna se llevó a cabo usando un procedimiento de re-muestreo sin reemplazo. Con este fin, un centenar de conjuntos de datos se generaron mediante la eliminación al azar de aproximadamente 20% de la muestra original. Para cada simulación, se repitió el modelo de regresión logística multivariante y el coeficiente Kappa de Cohen, el valor predictivo positivo (VPP), el valor predictivo negativo (VPN), sensibilidad y especificidad se calcularon. Se consideraron los valores estadísticamente significativos de p inferior a 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (SPSS versión 21, SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
Las características basales de los 52 pacientes incluidos en este estudio se resumen en la Tabla 1. La mediana de tiempo entre la biopsia de diagnóstico y cirugía radical fue 4,99 meses [IQ Rango: 4,01 a 5,83]. Todas las muestras pre-quimioterapia, que consisten en biopsias de diagnóstico, se examinaron para pWee1 y γ-H2AX, mientras estaban disponibles para 37 muestras de datos pChk1. La mediana de los porcentajes de células que expresan nucleares para pWee1, pChk1 y γ-H2AX fueron 40% (min /max 10/80), 30% (min /max 10/80) y 30% (min /max 0/80), respectivamente . patrones de tinción inmunohistoquímica representativos se ilustran en la figura 1. Como se muestra en la Tabla 2, se encontró una asociación estadísticamente significativa entre la expresión pWee1 nuclear elevada y reducida tasa de PCR. La asociación a prueba significativa para todos los métodos de calificación investigados (pWee1
pos vs pWee1
neg, p = 0,016; pWee1
Allred alta vs pWee1
Allred baja, p = 0,016; pWee1
múltiple alta vs pWee1
Multi baja, p = 0,034) (Tabla 2). Del mismo modo, los niveles nucleares elevados de γ-H2AX se asociaron con una reducción de tasa de pCR, tanto cuando se considera como variable categórica y continuo (p = 0,037 y p = 0,026 en la Tabla 2 y en la Fig 2, respectivamente). Al considerar la combinación de los dos marcadores, sólo 1 paciente de 16 con tumores dobles positivos experimentó una PCR, 9 de 16 pacientes con tumores dobles negativas lograr una PCR, y un resultado intermedio se observó en pacientes cuyos tumores expresado sólo un biomarcador (p = 0,009) (Tabla 3). Seis de cada 8 muertes fueron observados en los tumores positivos dobles (p = 0,013) (tabla 3). En el modelo de regresión logística univariante, pWee1 y γ-H2AX se asociaron directamente con PCR (pWee1
pos vs pWee1
neg: odds ratio (OR) 5,31, 95% intervalo de confianza (IC): 1,42 a 19,87, p = 0,013; gamma-H2AX
alta vs γ-H2AX
baja: OR 4.20, IC del 95%: 1,13 a 15,59, p = 0,032, respectivamente) (Tabla 4); el modelo multivariado confirmó el papel predictivo de pWee1 y γ-H2AX (Tabla 4). La validación interna realizada a través de un procedimiento de re-muestreo confirmó la solidez del modelo multivariado. Concordancia, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, sensibilidad y especificidad se muestran en la Tabla 5. Por último, en la investigación de los patrones de co-expresión, no se observó ninguna asociación entre pWee1 y γ-H2AX (datos disponibles a pedido), mientras que un estadísticamente se informó de una asociación significativa entre pWee1 y pChk1 (figura 3)
.
tres secciones consecutivas para cada tumor se mostraron. (AC) A tumor positivo triple con nuclear γ-H2AX (A), pWee1 (B) y pChk1 (C) inmunoreactividad. (DF) Un tumor que no expresa γ-H2AX (D), y que co-expresado pWee1 ( e) y pChk1 (F). (GI) Un tumor que expresa expresión nuclear γ-H2AX (G) que carecía de pWee1 (H) y pChk1 (I)
En la figura:. La línea horizontal superior de la caja es la 75 percentil; la línea horizontal inferior de la caja es el percentil 25; la barra horizontal dentro de la caja es el valor de la mediana; la barra horizontal superior fuera de la caja es el valor máximo; la barra horizontal inferior fuera del área de los valores mínimos.
(A) Asociación de acuerdo a las manchas de clasificación basado en la intensidad (positivo vs negativo). (B) Asociación de acuerdo con la puntuación de la clasificación Allred (alta vs baja). (C) Asociación de acuerdo a una clasificación de puntuación multiplicativo (alta vs baja).
se generaron cien menos que funcionan con conjuntos de datos de simulación, cada una de aproximadamente 80 % del tamaño original.
Discusión
en el presente estudio se exploró de forma retrospectiva la importancia predictiva de pWee1 y γ-H2AX expresión, evaluado en biopsias diagnósticas relacionadas con 52 pacientes con cáncer de cuello uterino que se recibido quimioterapia neoadyuvante. También se investigó la asociación entre pWee1 y pChk1 con el fin de proporcionar pistas sobre si la activación Wee1 en el cáncer de cuello de útero está mediada por Chk1. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que informó sobre el daño del ADN y reparación biomarcadores en cáncer de cuello uterino que explotan el concepto de la naturaleza defectuosa del G
fase S de control 1 /. En general, se observó una asociación estadísticamente significativa entre la expresión elevada de pWee1 y γ-H2AX y la reducción de la tasa de PCR. Por lo tanto, proporcionamos primeros indicios de que la elevada expresión de biomarcadores en muestras de diagnóstico de DDR podría estar asociada con una eficacia subóptima de la quimioterapia, evaluado a través de PCR en los tumores resecados quirúrgicamente. También se observó una asociación positiva entre pWee1 y expresión pChk1 que sugiere G
2 activación efectiva puesto de control /M. Somos conscientes de que nuestros resultados son generadores de hipótesis en la naturaleza dado el diseño retrospectivo del estudio. . Sin embargo, más allá del enfoque analítico sencillo, nuestro estudio tiene algunas ventajas importantes
En primer lugar, el tratamiento neoadyuvante ofrece múltiples ventajas para la identificación y el desarrollo de biomarcadores de cáncer: i) el análisis de los posibles marcadores en un fondo molecular no "contaminado" por la exposición de los tratamientos contra el cáncer anteriores, ii) la identificación de marcadores predictivos para seleccionar pacientes que es más probable que se benefician de la quimioterapia, iii) la identificación de biomarcadores que también tienen importancia pronóstica, a pesar de la evidencia sobre la asociación entre la pCR y los resultados de supervivencia a largo plazo en el cáncer cervical no es tan robusto como lo es en cáncer de mama [7, 8].
en segundo lugar, hasta ahora, en el cáncer cervical la búsqueda de biomarcadores predictivos vinculados a la mayor capacidad de cáncer células para proteger su genoma cuando fueron estimulados con la quimioterapia o la radioterapia se ha centrado exclusivamente en las proteínas de reparación por escisión de nucleótidos (NER), y, en particular, en la reparación por escisión de grupo1 transversal complementación de proteínas (ERCC1) [9-13]. NER se delegó para corregir lesiones hélice distorsionan voluminosos, tales como los infligido al ADN por la terapia a base de platino. Sin embargo, en el contexto de la DDR, NER es una de las muchas efectores distales asignadas a mantener la integridad del genoma. Un número de redes moleculares salvaguardar el genoma, aunque su compromiso depende del tipo de lesión. vías de reparación del ADN también incluyen la reparación por escisión de base (BER), reparación de apareamientos erróneos (MMR), la reparación directa, y la reparación de recombinación de doble filamento romper (OSD). Este último abarca la reparación libre de errores recombinación homóloga (HRR) y la propenso a errores de extremos no homólogos a participar (NHEJ) [1]. Por lo tanto, el nivel de complejidad biológica de la DDR podría ser subestimada al considerar exclusivamente uno, o unos pocos, los componentes de emplazamiento común en una red de reparación específica. Por otra parte, se expresó preocupación por la fiabilidad, y la importancia biológica, los métodos de detección ERCC1 [14, 15]. Por el contrario, nuestro estudio se centró en los componentes de DDR maestros, cuya activación se sabe que es particularmente eficaz en el cáncer cervical.
A continuación, la hipótesis de que los niveles endógenos de daño en el ADN, reflejado por γ-H2AX, deberían haber sido paralelo aumento de la expresión de pWee1 y pChk1.Even aunque el eje de ATR-Chk1-Wee1 se activa principalmente por estirado de los ADN de cadena sencilla, estas estructuras anormales pueden generar DSBs sobre colapso replicación tenedor [16]. Por otra parte, razonó que la activación de la G
2 /M puesto de control debe ser particularmente competentes en la presencia de altos niveles basales de daños de ADN endógenas, lo que representa un mecanismo de adaptación a través del cual las células cancerosas contrarrestar el estrés replicación oncogén inducida por [16] . De hecho, se sabe que ATR y Chk1 suprimen la respuesta apoptótica tras el estrés replicación del ADN [17], y que los tumores caracterizados por niveles elevados de estrés replicativo, tales como cánceres MYC-Driven, son extremadamente vulnerables a los ataques farmacológica de G
2 /M control-quinasas [18-23]. No se observó ninguna asociación entre pWee1 y γ-H2AX, sino que estos criterios de valoración se asociaron independientemente con PCR. Podemos especular que los dos vías de reparación independientes, particularmente eficientes en el cáncer de cuello de útero, fueron capturados en este estudio. Un candidato adecuado es la ataxia-telangiectasia mutada vía (ATM) -Checkpoint quinasa 2 (Chk2), que se activa principalmente por las DSB [16]. Existe una amplia cooperación entre la vía ATM-Chk2 y la señalización ATR-Chk1-Wee1, y ATM también fosforila H2AX [16].
Otro aspecto que emerge de este estudio se refiere a la asociación entre pWee1 y expresión pChk1. Wee1 se coloca aguas abajo Chk1 [3], y la fosforilación de Wee1 en Ser642 aumenta su estabilidad en el núcleo y promueve la detención del ciclo celular en el G
transición 2 /M [24, 25]. Sin embargo, para nuestra prueba formal conocimiento de que este mecanismo de regulación, es decir, la fosforilación impulsado por Chk1 de Wee1 en Ser642, opera en células de mamíferos que aún falta. La evidencia actual deriva principalmente de los estudios utilizando
Xenopus
extractos y
Schizosaccharomyces pombe
como sistemas modelo [26, 27]. A pesar de que nuestro estudio no fue diseñado para generar conocimientos sobre mecánica en la dinámica que rige la activación Wee1, sus resultados proporcionan una sugerencia para futuras investigaciones preclínicas.
Un último punto que merece una consideración se refiere a la función protectora de G
2 /activación puesto de control de M en el contexto de las células madre del cáncer [28]. La activación del eje se ha asociado con la resistencia terapéutica en diferentes modelos de células madre de cáncer, incluyendo el cerebro, pulmón y cánceres de colon [29-31]. Multiplicando los esfuerzos para establecer un conjunto de células madre del cáncer de cuello de útero derivados del paciente para la caracterización molecular global es una estrategia que debe seguirse para diseccionar aún más la relación existente entre G
2 /M puesto de control y activación de funciones chemoresistant. La relevancia de este enfoque es aún más evidente cuando se considera la necesidad de modelos celulares y animales más precisos en función del número de inhibidores de Chk1 y Wee1 que entraron en desarrollo clínico [3, 32]. Por ejemplo, un estudio de fase I con el primero de su clase Wee1 inhibidor de AZD1775 (MK1775) en asociación con la terapia con cisplatino y radiación está en curso (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT01958658), y una fase I /II de prueba en combinación con topotecan /resultados de cisplatino como completado (ClinicalTrials.gov identificador: NCT01076400). Por otra parte, un I-II de un ensayo de fase de AZD1775 en combinación con quimioterapia se ha iniciado en pacientes con ovario epitelial mutado-TP53, las trompas de Falopio o cáncer peritoneal primario [33].
Conclusiones
en resumen, la expresión pWee1 andγ-H2AX en muestras pre-quimioterapia mostró capacidad de prever pCR en pacientes con cáncer de cuello uterino tratados con paclitaxel neoadyuvante, ifosfamida y cisplatino. Con base en los resultados presentados en este documento extremadamente prometedores prospectivo de validación o, de forma alternativa, los análisis moleculares auxiliares en el contexto de ensayos prospectivos tienen cobertura para caracterizar mejor la capacidad predictiva de estos biomarcadores.
Reconocimientos
Agradecemos Tania Merlino para la asistencia técnica.