Extracto
Fondo
cisplatino es un medicamento contra el cáncer potente, pero su aplicación clínica se ha limitado debido a sus características físico-químicas indeseables y efectos secundarios graves. son muy deseados mejores formulaciones de fármacos para el cisplatino.
Metodología /Principales conclusiones
En este documento, hemos desarrollado una formulación de nanopartículas de cisplatino con alta eficiencia de encapsulación y la reducción de la toxicidad mediante el uso de cisplatino-reticulado carboximetilcelulosa ( nanopartículas CMC) núcleo hecho a partir de poli (lactida-co-glicolida) (polietilenglicol -monomethoxy-poli) copolímeros (PLGA-mPEG). Las nanopartículas tienen un diámetro medio de aproximadamente 80 nm medido por microscopio electrónico de transmisión (TEM). La eficiencia de encapsulación del cisplatino en las nanopartículas es de hasta un 72%. Mientras tanto, también hemos observado una liberación controlada de cisplatino en forma sostenida y la eficacia del tratamiento depende de la dosis de nanopartículas cargadas con cisplatino frente a células IGROV1-CP. Por otra parte, la dosis letal media (LD
50) de las nanopartículas cargadas con cisplatino fue más de 100 mg /kg por administración intravenosa, que era mucho mayor que la del cisplatino libre.
Conclusión
Esta nanopartícula cisplatino-cargado desarrollado es una formulación prometedor para el suministro de cisplatino, que será un régimen terapéutico eficaz del cáncer de ovario sin efectos secundarios severos y toxicidad acumulativa
Visto:. Cheng L, Jin C , Lv W, Q Ding, Han X (2011) desarrollo de un altamente estable de nanopartículas PLGA-mPEG Cargado con cisplatino para la quimioterapia del cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (9): e25433. doi: 10.1371 /journal.pone.0025433
Editor: Martin W. Brechbiel, National Institutes of Health, Estados Unidos de América
Recibido: 28 de abril de 2011; Aceptado: 5 Septiembre 2011; Publicado: 26 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Cheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores reconocer el apoyo de la Fundación china para la Cooperación Internacional de Ciencia y Tecnología (2007DFC30306, http://www.cistc.gov.cn/), y la Fundación de la provincia de Zhejiang Proyecto de Tecnología (2009C11122, http://www.zjkjt.gov.cn/html /index.htm). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
basada en cisplatino regímenes terapéuticos se han establecido como la quimioterapia estándar de primera línea para los pacientes con cáncer de ovario desde mediados de la década de 1980 [1] - [3]. Sin embargo, su aplicación se ha limitado debido a los efectos secundarios severos y toxicidad acumulativa en los principales órganos como el hígado, riñón, corazón y sistema nervioso por administración intravenosa [4] - [7]. En los últimos años, numerosos vehículos de fármaco de tamaño nanométrico se han desarrollado para minimizar los efectos secundarios del cisplatino y mejorar su eficacia antitumoral a través de las formas de micelas tales como poli (ácido aspártico) -poli (etilenglicol) micelas, liposomas, tales como liposomas pegilados y nanopartículas lipídicas sólidas durante la terapia del cáncer [8] - [13]. conjugados solubles polímero-fármaco también se han desarrollado para aumentar la solubilidad del cisplatino. Tales conjugados incluyen complejos de cisplatino con policarboxilatos, poli (amidoaminas), dendrímeros de poliamidoamina y cadenas poliacrílico. Estos sistemas pueden reducir la toxicidad y conseguir una eficacia ideal de quimioterapia [14] - [16].
poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) micropartículas también se han utilizado para el atrapamiento de cisplatino debido a su biocompatible y propiedades biodegradables [17], [18]. Avgoustakis K et al. han demostrado que la administración intravenosa de nanopartículas PLGA-mPEG cargado con resultados cisplatino en una prolongación significativa de la presencia de cisplatino en la sangre de los ratones [19]. Sin embargo, la eficiencia de encapsulación de cisplatino sigue siendo pobre durante la preparación de nanopartículas PLGA-mPEG cargados con cisplatino. Gryparis CE et al. [20] han encontrado que la aplicación de nanopartículas tiene la posibilidad de mantener concentraciones adecuadas o más de cisplatino durante 2 semanas, pero el contenido de PEG relativamente baja de PLGA-mPEG puede inducir el aumento de tamaño de las nanopartículas. Además, es deseable conseguir una liberación sostenible y concentración suficiente de cisplatino en la práctica clínica debido a la administración de dosis baja continua de cisplatino es más eficaz en la inducción de apoptosis de una sola exposición de altas dosis de cisplatino [21], [22].
el principal objetivo del presente trabajo es desarrollar una nanopartícula innovadora con una alta eficiencia de encapsulación y liberación sostenible de cisplatino. En este sistema de liberación de nanopartículas, d-alfa tocoferil polietilenglicol 1000 succinato (TPGS) como un nuevo emulsionante eficiente beneficioso para la salud humana se ha utilizado y se han desarrollado los biodegradables nanopartículas PLGA-MPEG con núcleos de CMC. Mientras tanto, también se ha determinado la eficacia de carga y la encapsulación de cisplatino. Por otra parte, la eficacia antitumoral de las nanopartículas cargadas con cisplatino en el modelo de cáncer de ovario del ratón ha sido evaluado. En conclusión, el sistema de administración de cisplatino mejorada ofrece un diseño racional para la aplicación terapéutica potencial de cisplatino en cáncer de ovario.
Resultados
Diseño racional de CMC y TPGS para preparar nanopartículas de PLGA-MPEG con cisplatino
es un reto para preparar nanopartículas cargadas con cisplatino mediante el uso de copolímeros de PLGA-mPEG debido a sus propiedades físico-químicas y condiciones de preparación. En este estudio, se realizó un diseño racional de nanopartículas que contienen cisplatino mediante la adaptación de la composición, tamaño y forma. En primer lugar, los copolímeros PLGA-mPEG se sintetizaron a partir de lactida y glicólido en presencia de mPEG
5000, cuyo grupo hidroxilo puede iniciar la polimerización de apertura de anillo de lactida y glicolida. La estructura del copolímero sintetizado fue detectado por
1H NMR en CDCl $
3, como se muestra en la Figura 1. Los picos a 1,65 y 5,10 ppm pertenecía a los protones de metino (CH) y metilo (-CH
3) grupos de segmentos de PLGA, mientras que los picos de protones methene (-CH
2-) en los segmentos de PEG localizadas en 3.65 ppm, y los picos de protones methene (-COCH
2O-) situados en 4,78 ppm eran la representación de segmentos conjugados de PLGA y mPEG de modo que no se detectaron otros picos. El único pico en el espectro de GPC (Figura 2) reveló la síntesis exitosa de copolímeros PLGA-MPEG con alta pureza. El índice de polidispersidad (PI) como una medida de la amplitud de la distribución de pesos moleculares fue de 1,78. Sobre la base de cromatografía de permeación en gel (GPC) y la relación de
áreas de los picos 1H entre 5,10 y 3,65 ppm, el peso molecular promedio de copolímeros sintetizados se calculó que era 37.062, como se muestra en la figura 2. El porcentaje en peso de mPEG fue 13,5%.
los picos a 1,65 y 5,10 ppm pertenecían a los protones de metino (CH) y metilo (-CH
3) grupos de segmentos de PLGA, los picos de protones methene (-CH
2-) en los segmentos de PEG localizadas en 3.65 ppm, y los picos de protones methene (-COCH
2O-) situados en 4,78 ppm representados segmentos conjugados de PLGA y mPEG.
el pico representa el peso molecular medio de copolímeros sintetizados se calculó que era 37062.
en segundo lugar, un método de evaporación del disolvente modificado basado en la fase orgánica con agua-agua (W /O /W) emulsiones múltiples incluyendo un proceso de preparación relativamente simple se utiliza para mejorar la eficiencia de encapsulación de cisplatino en nanopartículas. Las características observadas de las nanopartículas pueden variar en gran medida dependiendo de la concentración de CMC, la concentración TPGS y los procesos variables incluyendo el interruptor de fin adición de disolvente. Con el fin de conseguir la concentración óptima de CMC para una alta eficiencia de encapsulación, se exploraron diferentes cantidades de adición de CMC en la fase acuosa interna del sistema de emulsión doble. La encapsulación efectiva de cisplatino en nanopartículas fue mayor que ninguna cantidad de CMC, que revelaron la tasa de carga y la eficiencia de encapsulación de cisplatino fueron 3,88 y 70,9% (w /w), respectivamente, como se muestra en la Tabla 1. Totalmente 1,7 mg CMC combinarse con 4 cisplatino mg fueron seleccionados como la fase acuosa interna óptimo y la concentración óptima para TPGS se proyectó para ser 0,035% (w /v).
como se muestra en la Tabla 2, el tamaño medio de las nanopartículas preparadas cargado con cisplatino osciló desde 180 hasta 210 nm, y la tasa de carga de cisplatino fue de 3.5 a 4.2% (w /w). El PI se determinó que era de aproximadamente 0,3, que exhibió una distribución homogénea de diámetro. polímeros de CMC y PLGA-mPEG confirieron un ζ-potencial negativo con un valor medio de -10,1 y -9,5 mV en nanopartículas en blanco y nanopartículas cisplatino-cargado, respectivamente. No se observó diferencia significativa en el tamaño y ζ-potencial de las nanopartículas con o sin cisplatino. Figura 3 mostró las imágenes representativas de la estructura externa de las nanopartículas examinadas por TEM. La mayoría de las nanopartículas eran de forma esférica con un diámetro más pequeño que el diámetro determinados por dispersión de luz dinámica. La morfología de las nanopartículas con o sin cisplatino reveló estructuras similares o indistinguibles
(A) nanopartículas en blanco.; (B) nanopartículas cisplatino cargado. Las muestras se tiñeron con ácido fosfotúngstico al 1% (50.000 ×).
Por último, el perfil de liberación acumulativa de cisplatino a partir de nanopartículas se midió por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), como se muestra en la figura 4. Este método de ensayo fue bastante sensible para medir el cisplatino en un intervalo de concentración de ancho, con un límite de detección de 0,31 ng /mL. Una curva de calibración se estableció en cada experimento. La cinética de liberación de cisplatino a partir de nanopartículas revelaron una velocidad de liberación controlada constante a medida que la función del tiempo. Sin embargo, su versión estable podría verse afectada por la conjugación CMC-cisplatino y copolímeros PLGA-mPEG biodegradables. Del mismo modo, como se muestra en la Figura 4, el atrapamiento de cisplatino en nanopartículas podría retardar significativamente la velocidad de liberación de cisplatino y en consecuencia conducir a una liberación bastante constante en el tiempo.
cisplatino liberado de nanopartículas como una función del tiempo de incubación en /L de solución de cloruro sódico 100 mmol a 37 ° C.
la toxicidad aguda de las nanopartículas núcleo CMC
con el fin de evaluar la citotoxicidad de las nanopartículas sin carga de drogas, la citotoxicidad de nanopartículas a las dosis de 0,005, 0,02, 0,04 y 0,08 mg /ml se pusieron a prueba mediante el uso de microplacas de 96 pocillos sembrada con células a una densidad de 3000 células /pocillo. Las curvas de crecimiento celular de las nanopartículas grupos tratados con el control y fueron similares, lo que sugiere que las nanopartículas a las concentraciones ensayadas no mostraron toxicidad evidente en las células, como se muestra en la Figura 5 (A). Además, la cantidad máxima de nanopartículas (0,08 mg /ml) y la densidad de 3000 células /pocillo fueron también las condiciones óptimas para evaluar el efecto de las nanopartículas cargadas con cisplatino sobre el crecimiento celular
in vitro
.
(a) la viabilidad celular relativa de las células IGROV1-CP expuestos a nanopartículas en blanco durante 72 horas con varias dosis. la inhibición del crecimiento (B) de la célula después de la exposición a cisplatino libre (histograma gris) y nanopartículas de cisplatino-cargado (histograma negro) durante 72 horas. Los datos representan como media ± desviación estándar.
La actividad contra el cáncer de cisplatino libre y nanopartículas cargadas con cisplatino en las células IGROV1-CP
in vitro se determinó
. Como se muestra en la Figura 5 (B), no se observó diferencia significativa en la citotoxicidad entre nanopartículas cisplatino-cargado y cisplatino libre a las concentraciones ensayadas (
p
& gt; 0,05). La citotoxicidad del cisplatino libre y nanopartículas cisplatino cargado era dependiente de la dosis. Por lo tanto, las nanopartículas PLGA-mPEG pueden contribuir a la velocidad de liberación controlada de cisplatino, mientras que se preserva la eficacia contra el cáncer de cisplatino
.
A fin de evaluar los potenciales riesgos de toxicidad, ratones ICR fueron inyectados por vía intravenosa con nanopartículas cisplatino cargado a diversas dosis y se examinó el cambio en la tasa de supervivencia de los ratones. En todas las dosis probadas, las tasas de mortalidad entre los grupos reveló una diferencia significativa durante un período de espera de 2 semanas de duración (
p Hotel & lt; 0,05). La mortalidad de las nanopartículas cargadas con cisplatino a una dosis de 100 mg /kg (sobre la base de cisplatino) fue 40,0%, pero la tasa de mortalidad en el grupo de tratamiento con cisplatino 10 mg /kg alcanzó hasta 62,5%. No se observó deterioro de la salud en los ratones tratados con nanopartículas en blanco durante el período de observación, y el comportamiento general de los ratones tratados con nanopartículas cisplatino cargado o nanopartículas en blanco no mostró una diferencia obvia. El LD
50 era 8,6 mg /kg para el cisplatino libre y 103,4 mg /kg para las nanopartículas cargadas con cisplatino, como se muestra en la Tabla 3. Por lo tanto, en comparación con cisplatino libre, las nanopartículas cargadas con cisplatino puede proporcionar una mayor seguridad en la aplicación clínica .
perfil de seguridad de las nanopartículas núcleo CMC en IGROV1-CP ratones desnudos xenoinjertados
con el fin de observar la toxicidad en los órganos en diferido en los ratones dentro de un cierto período de tratamiento, los principales órganos incluyendo el corazón , hígado, pulmón, riñón y bazo de ratones BALB /c desnudos se administra con cisplatino libre y nanopartículas cisplatino cargado se seccionaron y se tiñeron con HE. Ningún cambio histopatológico obvio se observó en corazón, pulmón y el bazo de las nanopartículas cargadas con cisplatino ratones tratados, como se muestra en la Figura 6. Sin embargo, no se observaron necrosis hepática y atrofia patológica de riñón en ratones tratados con cisplatino libre. Del mismo modo, la administración de nanopartículas cargadas con cisplatino hasta 3 mg /kg para 5 dosis consecutivos no provocó una diferencia patológico significativo en el hígado y el riñón.
ratones atímicos desnudos portadores de xenoinjertos IGROV1-CP fueron tratados con solución salina ( control), nanopartículas (NP en blanco en blanco), cisplatino y cisplatino nanopartículas cargadas (NP-cp) en cinco dosis cada 4 días. Los órganos incluyendo corazón, pulmón, bazo, hígado y riñón de los ratones tratados con solución salina se muestran en la primera fila. Los órganos de los ratones tratados con nanopartículas en blanco se muestran en la segunda fila. Los órganos de los ratones tratados con cisplatino libre se muestran en la tercera fila. Los órganos de los ratones tratados con nanopartículas cisplatino cargado se muestran en la cuarta fila.
Con el fin de evaluar el efecto de las nanopartículas cisplatino cargado sobre la apoptosis, las secciones de tejidos tumorales se tiñeron con TUNEL para evaluar la fragmentación del ADN. La enumeración de los núcleos apoptóticos (se contaron alrededor de 200 células) se realizó en portaobjetos elegidos al azar por dos experimentadores independientes. Un grupo de cuerpos apoptóticos se administra en una sola cuenta, y el recuento de apoptosis en diferentes grupos de tratamiento se muestra en la Figura 7 (A). Xenoinjertos tratados con cisplatino nanopartículas cargadas con revelaron niveles de apoptosis más altos que los controles (solución salina y blanco nanopartículas,
p Hotel & lt; 0,05). Aunque el recuento total de células apoptóticas en los tumores tratados con nanopartículas cisplatino cargado fueron ligeramente superiores a los de los tumores tratados con cisplatino convencional, no se observó diferencia significativa en el recuento total de células apoptóticas en ambos grupos de tratamiento, como se muestra en la Figura 7 (B) (
p Hotel & gt; 0,05)
(A) La evaluación microscópica de la apoptosis tumoral mediante la tinción de TUNEL.. ratones atímicos que llevan xenoinjertos IGROV1-CP fueron tratados con solución salina (control), nanopartículas (NP en blanco en blanco), cisplatino y cisplatino cargado nanopartículas (NP-cP) a cinco dosis. (B) Los recuentos promedio de células apoptóticas se calcularon sobre la base de la tinción de TUNEL. los ratones atímicos que llevan xenoinjertos IGROV1-CP se trataron como se ha descrito en (A).
Tratamiento eficacia
in vivo
estudios
La eficacia del tratamiento de las nanopartículas cargadas con cisplatino para el xenotrasplante de células IGROV1-CP en ratones BALB /c se evaluó ratones desnudos. Después de que el volumen medio de los tumores era de hasta 100 a 130 mm
3, los ratones portadores de tumores se dividieron en cuatro grupos (n = 8) con una diferencia mínima en el peso y tamaño de los tumores entre los grupos. Además, los ratones fueron tratados con regímenes siguientes incluyendo solución salina, las nanopartículas sin cisplatino, el cisplatino libre, y las nanopartículas cargadas con cisplatino cada cuatro días. La dosis de los tratamientos basados en cisplatino fue de 3 mg /kg de peso corporal.
El tamaño del tumor, el peso corporal y la tasa de supervivencia de los ratones fueron monitorizados durante 21 días siguientes al inicio del tratamiento. El volumen medio del tumor al final del período de tratamiento fue de 209 ± 25 mm
3 en el grupo tratado con solución salina, y 213 ± 19 mm
3 en el grupo de nanopartículas tratadas en blanco, como se muestra en la Figura 8 (A) . Sin embargo, en el grupo tratado con cisplatino, el volumen tumoral promedio final fue de 166 ± 16 mm
3, que fue significativamente menor que en los grupos tratados con solución salina por análisis ANOVA de intervalo de confianza del 95%. En comparación con el grupo tratado con cisplatino, una ligera reducción del volumen tumoral en nanopartículas cisplatino cargado grupo tratado con el tamaño tumoral medio de 146 ± 19 mm
3 al final del período de tratamiento. Una posible razón es que el suministro intracelular subsiguiente de cisplatino puede ser obstaculizada por la modificación mPEG de nanopartículas, que no exhiben una contribución significativa en la reducción del tumor. Al final del período de tratamiento (días 21), las tasas de supervivencia de los ratones del grupo de nanopartículas tratadas con cisplatino-cargado, grupo tratados con cisplatino, en blanco grupo de nanopartículas tratados y el grupo tratado con solución salina fueron 87.5, 62.5, 75 y 75 %, respectivamente, como se muestra en la Figura 8 (B). La diferencia en las tasas de supervivencia de cuatro grupos sugiere que las nanopartículas cargadas con cisplatino eran mucho más seguro que el cisplatino libre. Los pesos corporales de los ratones mostraron una disminución gradual a partir de la segunda dosis aunque no se observó diferencia significativa en cuatro grupos, como se muestra en la Figura 8 (C).
(A) Efecto de cisplatino libre (3 mg /kg) y nanopartículas de cisplatino-cargado (NPS-CP, 3 mg /kg sobre la base de cisplatino) en el crecimiento tumoral en ratones atímicos que llevan con xenoinjertos de células IGROV1-CP. Los ratones se les administró con formulaciones preparadas a intervalos de 4 días en el período de tratamiento total de 21 días. La solución salina se utilizó como grupo de control, y el efecto de las nanopartículas en blanco (PN en blanco) también se confirmó. Los datos se presentan como media ± SD (n = 8 en el comienzo del experimento). (B) La tasa de supervivencia de los ratones atímicos portadores de tumor tratados con cisplatino (3 mg /kg), PN-cp (3 mg /kg sobre la base de cisplatino), NPs en blanco y solución salina (control). (C) del cuerpo de cambio de peso como el tiempo de tratamiento de los ratones portadores de tumores IGROV1-CP. Barras indican las desviaciones estándar.
Discusión
características fisicoquímicas del cisplatino, como la mala solubilidad en agua (1 mg /ml), de alta afinidad de unión a las proteínas plasmáticas y degradabilidad, puede limitar la eficacia terapéutica de cisplatino. obstáculos basados en cisplatino en su aplicación clínica pueden ser resueltos mediante el uso de nanopartículas poliméricas biodisponibles. En la actualidad, algunos tipos de nanopartículas preparadas a partir de poli (lactida)--monomethoxy poli (etilenglicol) copolímeros (PLA-mPEG) y PLGA-mPEG han ganado una creciente atención. La razón fundamental de este estudio es aumentar la eficiencia de carga y la encapsulación de cisplatino por nanopartículas, mejorando así la estabilidad del cisplatino. TPGS también puede proporcionar una alternativa segura de alcohol de polivinilo (PVA) o de otros aditivos para mejorar la preparación de nanopartículas uniformes de lote a lote.
Uso modificado W O método de emulsión //W doble desarrollado por Gryparis CE et al . [20], hemos desarrollado un novedoso concepto de "núcleo-CMC-cisplatino-reticulación" que puede mejorar en gran medida la eficiencia de carga de cisplatino. Durante la reticulación de CMC, ion cloruro en cisplatino puede intercambiar iones de hidrógeno con CMC en agua para formar un complejo. Debido a la retención del complejo en la fase de emulsión primaria, el cisplatino se puede cargar en las nanopartículas hechas de PLGA hidrófobo con metoxi hidrófilo cadenas de polietilenglicol. La eficiencia de carga de cisplatino ha mejorado a 3,9 ± 0,3% (w /w) y la eficacia de encapsulación es de hasta 70,9 ± 2,6%. Además, no hay informes relacionados con la aplicación de polímeros de CMC como una estrategia para mejorar la eficiencia de carga de cisplatino. Por lo tanto, las nanopartículas cargadas con cisplatino deben ser los portadores de administración de fármacos eficaces para el cisplatino
in vivo
estudio.
La alta eficiencia de encapsulación de cisplatino es también en parte debido a la aplicación de TPGS emulsionante en coordinación- la formación de nanopartículas inducida. TPGS es diferente de PVA se informó anteriormente, colato de sodio u otros emulsionantes [17], [20]. TPGS, un derivado soluble en agua de la vitamina E natural, se utiliza comúnmente en las formulaciones farmacéuticas y nutracéuticas. En este estudio, hemos generado con éxito nanopartículas homogéneas con la ayuda de TPGS. No escombros y la agregación en las nanopartículas homogéneas fueron observadas por TEM. gotitas de emulsión monodispersas favorece la coalescencia sin TPGS, y las nanopartículas son difíciles de formar. Aquí, TPGS se utiliza con una esperanza para desplazar emulsionantes mencionados anteriormente y evitar su problema de eliminación.
Durante la evaluación de la viabilidad celular y la eficacia del tratamiento de las nanopartículas cargadas con cisplatino preparados, la viabilidad de las células IGROV1-CP incubaron con cisplatino libre en el intervalo de concentración de 8-24 mM durante tres días exhibió una disminución de 79,6% a 14,8%, mientras que la viabilidad de las células tratadas con nanopartículas de cisplatino encapsulado reveló una reducción de 76,9% a 10,8%. Por otra parte, las nanopartículas cargadas con cisplatino inhibían eficazmente el crecimiento del tumor en ratones desnudos en comparación con cisplatino libre a la misma dosis, lo que sugiere que las nanopartículas no interrumpieron eficacia contra el cáncer de cisplatino
in vivo
. ensayo de TUNEL también confirmó la eficacia mejorada de nanopartículas cargadas con cisplatino en la inhibición de tumores. Mientras tanto, el examen histopatológico reveló necrosis hepática y la atrofia en el riñón en el grupo tratado con cisplatino libre, pero este tipo de cambios histopatológicos no se observaron en los grupos tratados con nanopartículas cisplatino cargado. Además, otros órganos importantes como el corazón, el bazo y el pulmón no revelaron anomalías tampoco. Por lo tanto, las nanopartículas núcleo-CMC-cisplatino-reticulados deben ser mucho más seguro y de mayor eficacia que el cisplatino libre durante el tratamiento del cáncer
.
Con el fin de entender mejor los efectos secundarios de las nanopartículas cargadas con cisplatino, el potencial de toxicidad aguda de cisplatino también se evaluó nanopartículas RESORTE. ratones ICR fueron inyectados por vía intravenosa con 0,8 ml de nanopartículas cisplatino cargado en las concentraciones de cisplatino de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 y 3,0 mg /ml, respectivamente, y se examinó la tasa de supervivencia de los ratones. Como era de esperar, la LD
50 de las nanopartículas cargadas con cisplatino reveló 12 veces mayor que la de cisplatino libre. La comparación de la tasa de supervivencia global, los ratones BALB /c mostraron una mayor tolerancia a las nanopartículas cargadas con cisplatino que el cisplatino libre, lo que indica que las nanopartículas cargadas con cisplatino tuvieron una mayor seguridad que el cisplatino libre en la condición de la dosis relativamente alta administración.
en general, las nanopartículas cargadas con cisplatino se han diseñado y preparado con éxito. Las partículas esféricas y estrecha distribución de tamaños se han caracterizado. la liberación sostenida de cisplatino durante cinco días a partir de nanopartículas de PLGA-mPEG
in vitro se observó
. Por lo tanto, podemos concluir que las nanopartículas tienen una contribución significativa a la liberación controlada de cisplatino y no dañan la efectividad del tratamiento de cisplatino. Nuestros resultados proporcionan una nueva evaluación de las nanopartículas cargadas con cisplatino como tratamiento contra el cáncer novela. Sin embargo, con el fin de maximizar el efecto antitumoral de las nanopartículas cargadas con cisplatino, es necesario para optimizar aún más la dosis de administración y el régimen de inyección.
Las estrategias actuales, especialmente para la fabricación de tales nanopartículas, la preparación de múltiples pasos involucrados. Como resultado, el procedimiento es un sistema inherentemente ineficiente, que puede no ser fácilmente escalable y puede resultar en la variación de lote a lote. En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un nuevo método para la preparación de nanopartículas con la uniformidad de lote a lote. Se trata de un sistema simple, escalable, eficiente y controlable con nuestra estrategia de formulación bien diseñado. Nuestra prueba de concepto
e in vitro
in vivo
evaluación muestra que formulación de nanopartículas PLGA-MPEG es un sistema de administración de cisplatino potencial para el tratamiento del cáncer de ovario.
Materiales y métodos
Materiales
El cisplatino se adquirió de Shandong Bo fuente Chemical Co Ltd (Jinan, china). CMC se adquirió de Aladdin Reactivo Co. Ltd. (Shanghai, China). mPEG (M
W 5 kDa) y TPGS se obtuvieron de Jiangsu Xixin Vitamin Co. Ltd. La columna de fase inversa (ZORBAX-NH
2, 250 × 4,6 mm, 5 micras) se adquirió de Agilent Technologies Co . Ltd. (EE.UU.). Toda el agua reactivo utilizado en el laboratorio se trató previamente con el Sistema Plus Milli-Q (Millipore Corporation, EE.UU.). Todas las muestras de mPEG se deshidrataron mediante destilación azeotrópica con tolueno, y después se seca al vacío a 50 ° C durante 12 h antes de su uso. células IGROV1-CP fueron amablemente proporcionados por el Dr. Stephen Collins en la UCSD (CA, EE.UU.).
Animales
Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Ética Animal Institucional (IACE) del Centro de Investigación de Laboratorio de Ciencia Animal de la Universidad de Medicina de Zhejiang china (Hangzhou, china). Los números de los permisos son Syxk (Zhe) 2008-0115. ratones ICR y ratones BALB /c (4-6 semanas de edad y un peso de 18 a 22 g) se mantuvieron en el centro animal. nanopartículas cisplatino cargado se administraron con la inyección intravenosa. Al final de los períodos de tratamiento, los tejidos del hígado, riñón, corazón, bazo y pulmón fueron recolectados como por la aprobación de la AICE.
Síntesis y caracterización de copolímero PLGA-mPEG
PLGA-mPEG copolímeros se preparan mediante un proceso de polimerización en estado fundido bajo vacío usando estannoso-2-etilhexanoato como catalizador [23]. El PLGA (30) -mPEG (5) se sintetizó con la composición LA:GA:EO = 3:01:01, Mw (peso molecular promedio en peso) = 3,7 × 10
4, PI = 1,8 (LA, GA y EO de pie para el ácido láctico, ácido glicólico y componentes de óxido de etileno, respectivamente). El copolímero se caracteriza por
1 H-RMN y GPC.
Preparación y caracterización de nanopartículas cargadas con cisplatino
PLGA-mPEG nanopartículas cargadas con cisplatino se prepararon con W /O /W emulsión método de evaporación del disolvente desarrollado por Gryparis CE [20], con modificaciones específicas. Brevemente, 5,71 mg /ml de cisplatino disuelto en solución acuosa 30 mM CMC se emulsionó en una fase orgánica mediante el uso de sonicación (Bioruptor, modelo UCD-200 TM-EX) a 100 W durante 45 segundos. La fase orgánica se compone principalmente de cloroformo y acetona que contenía 50 mg de PLGA-mPEG. Se añadió agua-en-orgánico emulsión de fase a una solución acuosa de TPGS (0,035%, w /v).
El resultante W /O /W emulsión fue entonces microfludized con una presión mínima de 12.000 PSI, y agitado por un agitador magnético durante 3 h a temperatura ambiente hasta la completa evaporación de cloroformo y acetona. Finalmente, la suspensión de nanopartículas se liofilizó y se almacenó a 4 ° C hasta su uso futuro. Con el fin de aumentar el atrapamiento de cisplatino en nanopartículas, CMC en la fase acuosa interna de W /O /W se conjugó con cisplatino en 1 ml de agua durante 3 horas con agitación suave continua. nanopartículas en blanco también se prepararon con el mismo método sin cisplatino.
El tamaño de partícula y potencial zeta se midieron mediante el uso de instrumento Malvern Zetasizer (13 carreras por muestra, NETASIZER NANO S90). Se observó el examen morfológico de las nanopartículas bajo TEM (JEM-1230, JEOL, Japón). Una gota de suspensión de nanopartículas se coloca en una rejilla de cobre cubierta con una membrana de nitrocelulosa y se seca al aire libre antes de la tinción negativa con solución de sodio fosfotúngstico (1% w /v).
Determinación de la eficiencia de carga y
vitro
velocidad de liberación de cisplatino en
La eficiencia de carga de cisplatino en nanopartículas se determinó mediante el uso de un procedimiento directo [24]. Totalmente Se disolvieron 5 mg de nanopartículas liofilizadas en 1 ml de NaOH (0,1 N) y durante la noche agitada en un agitador magnético a temperatura ambiente. La suspensión se centrifugó a 18.000 g durante 10 min, y se usó 90 l de sobrenadante de cuantificar el contenido de cisplatino mediante HPLC. La eficiencia de encapsulación se calculó como la cantidad de cisplatino se recuperó de las nanopartículas con respecto a la cantidad inicial de cisplatino usada para cada preparación. Además, con el fin de cuantificar la cinética de liberación de cisplatino a partir de nanopartículas, nanopartículas cisplatino-cargado (5 mg) se suspendieron en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). La suspensión se colocó en un tubo de microcentrífuga y luego poner en un baño de agua agitación orbital a 120 rpm a 37 ° C. Los tubos se centrifugaron a intervalos de tiempo designados. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se recogieron para la determinación de cisplatino. Después de probar nuestros sobrenadantes, el medio de incubación fue sustituido por PBS fresco y los tubos se coloca de nuevo en la incubadora. El contenido de cisplatino de estas soluciones se determinó midiendo la absorbancia a 310 nm con una fase móvil no de gradiente que consiste en 0,9% de NaCl y metanol (v /v, 25/75) a un caudal constante de 1,0 ml /min.
in vitro
citotoxicidad estudio
el ensayo MTT se utilizó para evaluar la toxicidad de las nanopartículas en blanco, las nanopartículas cargadas con cisplatino y cisplatino libre contra las células cancerosas de ovario IGROV1-CP [25 ]. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos de plástico a 3 × 10
3 células por pocillo. se añadieron Veinticuatro horas después de la siembra, cisplatino, nanopartículas en blanco y nanopartículas cisplatino-cargado (tanto en suspensión en medio de cultivo) a diversas concentraciones a los pocillos. Se añadió un total de 50 l de solución de MTT (5 mg /ml en PBS, pH 7,4) en cada pocillo y se incubó a 37 ° C durante 3 horas. La solución fue retirada y, a continuación 200 l de isopropanol acidificado se añadió (0,33 ml de HCl en 100 ml de isopropanol) y se agita a fondo para disolver los cristales de formazán. La solución se leyó inmediatamente en un lector de microplacas (TECAN INFINIT M200, EE.UU.) a una longitud de onda de 490 nm. Los experimentos se realizaron de forma independiente en tres ocasiones. La citotoxicidad se expresa como porcentaje de inhibición de la viabilidad celular.
Evaluación in vivo Red de toxicidad aguda
Se usaron ratones ICR para evaluar la toxicidad relativa después de la administración intravenosa de nanopartículas cargadas con cisplatino .