Extracto
Micro ARN (miARN) regulan la expresión de los genes diana posttranscriptionally por el emparejamiento de forma incompleta con el ARNm de una manera específica de la secuencia. Alrededor del 30% de los genes humanos están regulados por miRNAs, y un solo miARN es capaz de reducir la producción de cientos de proteínas por medio de emparejamiento incompleto tras la unión de los genes miARN-mRNA. Últimamente, ha surgido evidencia que implica miRNAs en el desarrollo de los cánceres de pulmón. En particular, el miR-19a, que está altamente expresado en células de cáncer de pulmón malignos, que se considera la clave miARN para la tumorigénesis. Sin embargo, sus objetivos directos siguen siendo reportado. En el presente estudio, nos centramos en seis genes diana de miR-19a potenciales seleccionados por el software de predicción de genes miARN objetivo. Para evaluar estos genes como los genes diana de miR-19a directos, se realizó la luciferasa, desplegable, y ensayos de Western blot. Se observó la actividad de luciferasa de plásmidos con cada sitio de miR-19a de unión a disminuir, mientras que se observó aumento de la actividad de luciferasa en la presencia de anti-miR-19a de ácido nucleico cerrado (LNA). El desplegable ensayo mostró biotinilado miR-19a para unirse a la proteína AGO2 y para cuatro de los seis ARNm diana potenciales. El análisis de transferencia Western mostró que los niveles de expresión de los cuatro genes modificados en función de tratamiento con imitador miR-19a o anti-miR-19a-LNA. Por último,
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, y
TUSC2
fueron identificados como objetivos de miR-19a. Para examinar la función de estos cuatro genes diana en células de cáncer de pulmón, se utilizaron LK79 (que tiene una alta expresión de miR-19a) y A549 (que tiene baja expresión de miR-19a). La expresión de las cuatro proteínas diana fue mayor en A549 que en las células LK79. Los vectores de cuatro miR-19a de expresión de ADNc diana suprimidas viabilidad celular, la formación de colonias, la migración y la invasión de las células A549 y LK79, pero las células transfectadas con LK79
FOXP1
y
TP53INP1
ADNc no mostraron diferencias en comparación con las células de control en el ensayo de invasión
Visto:. Yamamoto K, S Ito, Hanafusa H, K Shimizu, Ouchida M (2015) el descubrimiento de blancos directos de miR-19a implicado en la progresión del cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (9): e0137887. doi: 10.1371 /journal.pone.0137887
Editor: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, Estados Unidos |
Recibido: 18 Junio, 2015; Aceptado: August 24, 2015; Publicado: 14 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Yamamoto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (Nº 24591905 de MES). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Micro ARN (miRNAs) son ~ 22 pb no codificante ARN pequeños que posttranscriptionally regulan la expresión génica de una manera específica de la secuencia [1]. miRNAs están codificados por cualquiera de sus propios genes o incrustadas en los intrones de los genes "host" y son transcritos por la ARN polimerasa II como parte de un transcrito largo tapado y poliadenilado (pri-miARN) [2]. Pri-miRNAs grado de elaboración que incluye la escisión de una estructura de horquilla, junto con secuencias de acompañamiento por un miembro de la familia RNAsa III Drosha para crear pre-miARN [3-4]. Pre-miRNAs se exportan al citoplasma por Exportin-5 en el que se escinden más por Dicer que elimina el bucle terminal de la creación de un ARN dúplex imperfecta [3-5]. Una de las hebras está preferentemente vinculado por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que contiene Argonaute (AGO) proteínas de la familia. Aunque ambas cadenas pueden llegar a ser de forma estable asociada con las proteínas de la familia (AGO carga paso) sólo una hebra (hebra guía; miARN) es retenido por la proteína anterior, mientras que la otra hebra (hebra de pasajeros; miARN *) se degrada. Los AGO proteínas humanas (Ago1 a 4) se caracterizan por un dominio PIWI conservada que es estructuralmente similar al dominio ARNasa H. El PIWI interactúa con el extremo 5 'de los genes miARN maduro y está implicado en la escisión del ARNm diana. Los cuatro Ago proteínas humanas muestran preferencias muy similares estructurales para dúplex de ARN pequeños desajustes: centrales (posición guía 8-11) promueven RISC de carga, y los desajustes en la semilla (posición de la guía 2-7) o 3'-mediados regiones (posición de la guía 12-15) son necesarios para desenrollar [6]. Es difícil para los pequeños ARN dúplex que llevan los desajustes en la región de semillas para cargar en proteínas AGO [6-12]. Por otra parte, el reconocimiento de un miARN con ARNm diana requiere partidos completa o casi completa con la región de la semilla. Más de 2.500 miRNAs son reportados en los seres humanos (GRCh38, http://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl?org=has), y se consideran 30% de los genes humanos para ser regulados por miRNAs [13] .
cáncer
pulmón es responsable de 19,4% de todas las muertes relacionadas con el cáncer, que constituía aproximadamente 1,59 millones de muertes en el mundo en 2012 (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/) . la progresión del cáncer de pulmón está asociado con múltiples cambios genéticos y epigenéticos que afectan a la expresión de genes de una amplia variedad de genes. En particular, las alteraciones en la expresión de más de dos docenas de miARN se ha reportado en pacientes con cáncer de pulmón [14], incluyendo la sobreexpresión informó recientemente de la agrupación de miR-17-92 (oncomiR-1) que codifica, entre otros, el miR-19a y 19b [14]. OncomiR-1 está implicada en la regulación de la supervivencia celular, la proliferación, la diferenciación, y la angiogénesis [15, 16]. Algunos genes, como
STAT3
y
MAPK14
, que están implicados en la tumorigénesis, han informado que los genes diana de miR-17-92 en células de cáncer de pulmón [17]. MiR-19a, que está altamente expresado en células de cáncer de pulmón malignos, se considera la clave miARN en la tumorigénesis [18]. tasa de crecimiento celular y la viabilidad diferir entre los linfomas transfectadas con miR-19a salvaje o mutado; Por lo tanto, el miR-19a también puede estar asociada con el crecimiento celular [18]. Por otra parte, el miR-19a activa la vía de la Akt-mTOR por la represión de la supresor de tumores
PTEN
[18, 19]. Por otra parte,
SOCS-1 | [20],
THBS1
[21],
IMPDH1
,
NPEPL1
[22], y
TNF -α
se conocen también como objetivos de miR-19a [23].
Sin embargo, como los genes miARN-mRNA de unión depende de las secuencias de semillas y el emparejamiento imperfecto de sus hilos, el miR-19a debe tener aún sin identificar orientar genes que influyen en la aparición y progresión de cáncer de pulmón. En el presente estudio, hemos identificado los genes nuevo objetivo de miR-19a y demostramos la capacidad de supresión de los genes diana sobre el crecimiento, la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Selección de miR-19a genes candidatos objetivo
los posibles genes diana de miR-19a se predijo usando el software siguiente miARN objetivo de predicción: PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu), TargetScan ( http://targetscan.org), Miranda (http://cbio.mskcc.org), y miGTS (Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. de Tokio, Japón). La predicción produjo 3.398 genes. Para reducir el rango de posibles objetivos de miR-19a, genes implicados en el cáncer fueron extraídos por el refinamiento de búsqueda mediante la inclusión de más de dos palabras relacionadas con el cáncer (tumores, supresor, y la apoptosis) en la búsqueda preliminar de la literatura. Aunque más de 10 genes candidatos se mantuvieron como diana de miR-19a, seis genes (con exclusión de los genes ya reportados como objetivos de miR-19a), a saber, caja forkhead P1 (
FOXP1
), inducible por daño nuclear dependiente de p53 la proteína 1 (
TP53INP1
), TNF-α inducida por la proteína 3 (
TNFAIP3
), supresor tumoral candidato 2 (
TUSC2
), SIVA factor inductor de apoptosis-1 (
SIVA1
), y necrosis tumoral superfamilia de receptores del factor 12A (
TNFRSF12A
), fueron seleccionados para este estudio.
cultivo de células
humano fibroblasto pulmonar normal línea de células WI-38 y la línea celular de riñón embrionario humano normal HEK293 fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC). de pulmón humano líneas celulares de carcinoma de células pequeñas SBC-5 y LK-79 y de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células PC3 líneas humana, PC14, LK2, NCI-H23, NCI-H460, NCI-H520, SQ5, Lu65A, LU- 99c, RERF-LCMS, y A549 se han utilizado en nuestro laboratorio [24]. HEK293, SBC-5, Lu-65A, PC3, PC14, LK2, NCI-H23, NCI-H460, NCI-H520, SQ5, Lu-99c, y RERF-CLEM se cultivaron en DMEM (Life Technologies, Foster City, CA , EE.UU.) o RPMI-1640 (Wako, Osaka, Japón). LK-79 y A549 se cultivaron en mezcla DMEM y RPMI-1640 (1: 1) suplementado con 10% de FBS (Life Technologies), 100 unidades /ml de penicilina G, y 100 mg /ml de estreptomicina (Meiji Seika, Tokyo, Japón). Todas las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.
experimentos de transfección exógena miARN se realizaron con mímica miR-19a (1, 5, y 10 nM) (CosmoBio, Tokio, Japón) usando HiPerFect reactivo de transfección (Qiagen, Venlo, Países Bajos). Las secuencias fueron los siguientes: imitador de miR-19a, el sentido 5'-p-AUC CGC GCG AUA GUA CGU AUU-3 'y antisentido 5'-P-GUA UAC CUA UCG CGC GGA UUU-3'; miARN al azar (control miARN), el sentido 5'-p-UGÚ GCA UCA CUA UGC AAA ACU GA-3 'y antisentido 5'-p-UUA UUG GUU CAU AGU UGC AC-3'. La expresión de miR-19a fue derribado por transfección con anti-miR-19a de ácido nucleico cerrado (LNA) (30 nM; 5'-TCA GTT TTG CAT AGA TTT GCA CA-3 ') o un oligonucleótido de control-LNA focalización GFP (5' -ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG C 3 ') (gen Design Inc., Osaka, Japón) utilizando HiPerFect reactivo de transfección (Qiagen). Los miR-19a ADNc diana plásmidos de expresión se transfectaron en las células utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Las células transfectadas se sometieron a ensayos de viabilidad celular y la extracción de RNA 24 h después de la transfección, y la extracción de la proteína 72 h después de la transfección. La viabilidad celular se determinó usando un ensayo de sal de tetrazolio soluble en agua, a saber, la 2- [-4-nitrofenil 2-metoxi] -3- [4-nitrofenil] -5- [2,4-disulfofenil] monosódico 2H-tetrazolio ensayo de sal (WST-1; Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania).
Colonia ensayo de formación de
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, y
TUSC2
cDNA plásmidos de expresión se transfectaron en células A549 y LK79 utilizando Lipofectamine 2000 y seleccionados por G418 (100-400 mg /ml) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU. ) en placas de 6 pocillos. Después de 3 semanas, las colonias que constan de más de 200 células fueron teñidas con cristal violeta. a continuación, se contó el número de colonias, y los valores medios se calcularon en pocillos por triplicado.
El crecimiento celular
células A549 o LK79 transfectadas con
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, o em> TUSC2
expresión de ADNc de vector plásmido se seleccionaron por G418 para obtener células con expresión estable
Migración de ensayo
Las células fueron cultivadas a 95% de confluencia en una placa de 60 mm y se rascó con una punta de pipeta. Las células flotantes se eliminaron por lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se obtuvieron imágenes microscópicas de las heridas a las 24 h.
ensayo de invasión
Un Corning Matrigel invasión de cámara (24- así placa 8,0 micras; Corning, Nueva York, EE.UU.) se utilizó para el ensayo de invasión. A549 (1 × 10
5) o LK79 (2,5 × 10
4) las células se cultivaron con DMEM libre de suero en la cámara superior separada de las cámaras inferiores, que se suministra con DMEM con 10% de FBS por permeable membranas de PET transparente. Después de 24 h, las células se fijaron y se tiñeron con Quick cito A y la solución B (Muto Pure Chemicals, Tokio, Japón). Las células no invasivas en el lado superior de la membrana se retiraron suavemente limpiando, y las células en el lado inferior se tiñeron y se observaron mediante un microscopio. Se contó el número de células invasoras, y los valores medios se calcularon en siete campos por cámara.
Tire hacia abajo el ensayo de ARNm diana de miR-19a
HEK293 células semi-confluentes en 90- placas de cultivo mm se lavaron con PBS frío, se recogieron por un raspador, y se trataron con 0,5 ml de 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), KCl 70 mM, EDTA 2,5 mM, 0,05% NP-40, 80 U /ml de RNasa inhibidor (Life Technologies), y 1 × cóctel inhibidor de la proteasa (Sigma-Aldrich) en hielo durante 20 min y se centrifuga a 12,000
× g
durante 15 min a 4 ° C. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. Biotina ARN de doble cadena (8 nmoles) de miR-19a (sentido 5'-p-UGÚ GCA UCA CUA UGC AAA ACU GA-biotina-3 'y antisentido 5'-p-AGU UUU GCA UAG AUU UGC AUA AG-3') o el control ARN aleatorio (sentido 5'-p-AUC CGC GCG AUA GUA CGU AUU-biotina-3 'y antisentido 5'-p-UAC GUA CUA UCG CGC GGA UUU-3') se añadió al sobrenadante (500 l) y se incubaron a 4 ° C durante 30 minutos con 8-rpm agitación y luego a 30 ° C durante 1 h con 30-rpm de agitación. El extracto se incubó a 4 ° C durante 1 h con 10 l de estreptavidina Muteína Matrix (Roche Applied Science), que se trató previamente con tampón de extracción [250 mg de BSA libre de RNasa y 100 g tRNA de levadura en 500 l de 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), KCl 70 mM, EDTA 2,5 mM, y 0,05% NP-40] por 3 h y se lavó con el mismo tampón dos veces. El complejo /mRNA estreptavidina /biotina-miARN se recogió después de un giro en el 5000
× g
durante 30 s y se lavó 5 veces a 4 ° C durante 5 min con 8-rpm agitación usando 20 mM Tris-HCl ( pH 7,4), KCl 400 mM, y 0,5% NP-40. El complejo /mRNA biotina-miARN se eluyó con 250 l de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), KCl 400 mM, 0,5% NP-40, biotina 5 mM, y 80 inhibidor U /ml RNasa a 42 ° C durante 5 min. El
PTEN
gen, notificado a ser un objetivo de miR-19a, se utilizó como control positivo, y
DAPK1
, cuya secuencia no coincide con las secuencias de semillas de miR-19a en el extremo 3 'no traducida se utilizó región (UTR) de su ARNm, como control negativo.
los plásmidos
el ADNc de
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, y
TUSC2
fueron amplificados mediante PCR con cebadores específicos de genes y ADNc humana normal transcrito de forma inversa a partir HEK293 ARNm utilizando el kit ReverTra As-α (Toyobo, Osaka, Japón). Los ADNc se clonaron en pBluescript y se confirmaron mediante secuenciación de ADN usando el secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). secuencias de etiqueta FLAG fueron fusionados en el extremo 5 'del ADNc en el marco, y se insertaron en el vector pIRES2-EGFP (Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.) con
Nhe I y
Sal sitios de restricción
. Estas secuencias fueron confirmadas por secuenciación del ADN.
reportero de luciferasa ensayo
Los fragmentos 3'-UTR que contienen una posible región de miR-19a-vinculante en los genes candidatos fueron sintetizados como oligonucleótidos para ambas cadenas, las cuales puede producir
Xba I
extremos cohesivos después del recocido. Las hebras dobles hibridados fueron clonados en el 3'-UTR
Xba I
sitio de
Renilla
luciferasa en el vector pTK-HRG, que era un vector phRG-B (Promega, Madison, WI, EE.UU.) que lleva ADNc de luciferasa corriente abajo del promotor de la timidina quinasa del herpes que habíamos insertado. Los fragmentos insertados se secuenciaron, y se determinaron su orientación y el fragmento número. Para el ensayo de la luciferasa, la pTK-HRG construye (180 ng) fueron co-transfectadas con el plásmido informador de luciferasa poa-SRα-luciferasa de luciérnaga (20 ng) como control interno en las células HEK293. La pTK-HRG construir con no se utilizó ningún inserto como control. La actividad de luciferasa se midió 48 h después de la transfección usando un sistema de ensayo de indicador de luciferasa dual (Promega) en un instrumento Luminoskan Labosystems RT (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA EE.UU.). La actividad luciferasa relativa se calculó por la normalización de
Renilla
luminiscencia de luminiscencia luciérnaga. Para cada ensayo experimental, cada muestra se ensayó por duplicado. El
p-valor
se calculó utilizando el dos colas
t-test
. Para el otro ensayo de luciferasa, las construcciones de pTK-HRG fueron co-transfectadas con LNA anti-miR-19a o LNA control (100 nM) en las mismas condiciones. La PTK-HRG construir teniendo una falta de correspondencia con la región central de secuencias de semillas de miR-19a se utilizó como control negativo.
Quantitative PCR de transcripción inversa
La tirada hacia abajo biotina-miARN /complejo mRNA se trató con la de guanidinio-fenol procedimiento de extracción de cloroformo con ISOGEN-LS (Nippon gene, Tokio, Japón), seguido de DNasa I (Sigma-Aldrich) y el tratamiento ISOGEN-LS. El ARNm se transcribe inversa en un volumen total de 20 l utilizando el kit ReverTra Ace-α. El cDNA del complejo /mRNA biotina-miARN se amplificó por PCR en un volumen de 20 l que contiene 0,2 l de cada reacción de transcripción inversa y 10 l de la TaqMan 2 × PCR Universal Master Mix (Life Technologies) en un Real- Fast 7300 Sistema de PCR de tiempo (40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 58 ° C durante 5 min). Cebadores para detectar ADNc candidatos objetivo de miR-19a se diseñaron flanqueando una posible región de miR-19a-vinculante en el ARNm diana (Tabla S1). Las secuencias de la sonda TaqMan con 5'-FAM y TAMRA 3 'de etiquetado para PCR en tiempo real se muestran en la Tabla S2. El nivel de expresión, es decir, el umbral de ciclo de valor (CT), de cada mRNA diana en la muestra desplegable con miR-19a-biotina se comparó con el valor de CT de que en la muestra desplegable con miR-random-biotina y se muestra como la proporción relativa. Cada PCR se realizó en cuatro ocasiones, y el
p-valor
se calculó utilizando el dos colas
t-test
.
Para el análisis de la expresión de miR-19a, celular total El ARN se extrajo utilizando ISOGEN (Nippon gene). El análisis en tiempo real PCR cuantitativa de miR-19a se realizó con un microARN TaqMan transcripción reversa kit, 2 × TaqMan PCR Universal Master Mix y TaqMan MicroARN de ensayo (Life Technologies). El ARN total (10 ng) fue inverso-transcrito en un volumen total de 15 l usando un kit TaqMan MicroARN transcripción inversa. Las alícuotas de cada reacción de transcripción inversa se amplificaron por PCR en un volumen total de 20 l que contiene 10 l de la TaqMan 2 × PCR Universal Master Mix. La PCR se realizó en un Sistema de PCR 7300 rápida en tiempo real con 50 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 60 s. El nivel de expresión (valor TC) de miR-19a se normalizó con el valor de TC de un ARN nuclear pequeño, U6B, que fue co-amplificado como control endógeno. El Ct se calculó como la diferencia en los valores de TC entre miR-19a y de la U6B control interno en una muestra. Las comparaciones de los niveles de expresión de genes miARN se llevaron a cabo utilizando el método de ΔΔCT, donde ΔΔCT fue la diferencia en los valores de Ct de una muestra de ensayo en comparación con la de la muestra de control, y 2
-ΔΔCT representa el cambio veces en la expresión de los genes miARN.
En tiempo real, análisis de PCR cuantitativa de los genes diana de miR-19a,
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, y
mRNA celular se transcribe de forma inversa con el kit de ReverTra Ace Primera Strand cDNA Synthesis (Toyobo), y el cDNA fue amplificado por PCR en un volumen total de 20 l que contiene 0,2 l de cada reacción de transcripción inversa y 10 l de la TaqMan 2 × universal Master Mix PCR (Life Technologies) en un Sistema de PCR Fast real-Time 7300 con 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 58 ° C durante 5 min. Los cebadores y sondas utilizados para detectar estos ADNc fueron los mismos que aquellos para la detección de ADNc del complejo de biotina-miARN /mRNA descrito anteriormente. La CT se calculó como la diferencia en los valores de TC entre cada gen diana miR-19a y el gen de la β-actina en una muestra. Los niveles de expresión de los ARNm diana también se midieron usando el método ΔΔCT.
Western Blot análisis
Para la confirmación de la proteína de unión a AGO2 con la biotina-miRNA /ARNm en
in vitro
desplegable, el complejo se combinó con tampón de carga de gel, se calentó a 95 ° C durante 10 min, y después se separa el 12% en geles de SDS-poliacrilamida y se electrotransfirieron a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Life Technologies). Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 ° C en 3% de BSA /PBS y después se incubaron durante 4 h a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal anti-AGO2 (No.016-20861, Wako, Osaka, Japón). Los filtros se lavaron con PBS /0,05% de Tween-20 y después se incubaron con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina. La señal de la proteína se visualizó usando FLA-3000 (Fujifilm, Tokio, Japón)
.
Para obtener el efecto de miR-19a en la expresión de la proteína, a las 72 h después de la transfección de células HEK293 y A549 con el sinóptico de miR-19a o anti-miR-19a-LNA, las muestras de proteína (25 mg) se separaron en 8% o 12% en geles de SDS-poliacrilamida, electrotransfirió a membranas de PVDF, y se incubó durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos: anti-TP53INP1 (T -17; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.), anti-FOXP1 (ab16645; Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-TNFAIP3 (ab74037; Abcam), anti-TUSC2 (ab70182; Abcam), anti-SIVA1 (ab67620 ; Abcam), y anti-TNFRSF12A (TEMA-4; Santa Cruz Biotechnology). Anti-β-actina (AC-15; Sigma-Aldrich). Se utilizó como control de carga
El análisis estadístico
Las proporciones relativas de luciferasa, la expresión del ARN, la viabilidad celular, el crecimiento celular, formación de colonias, y la invasión experimentos se expresan como los valores medios ± desviación estándar y se analizaron por el de dos colas
t-test
. Un valor de
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Evaluación de miR-19a genes candidatos objetivo por el ensayo indicador de luciferasa
Nos centramos en seis miR-19a candidatos de genes diana,
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
,
TUSC2
,
SIVA1
, y
TNFRSF12A
, que tenían sido seleccionados utilizando software de predicción de genes miARN objetivo. Las secuencias de nucleótidos de la posible sitio de unión de los genes miARN en el 3'-UTR de sus ARNm se obtuvieron de software miARN predicción de destino (Fig 1A). Para comprobar si los sitios de unión de miARN-son regulados por miR-19a
in vivo
, se construyeron plásmidos informadores de luciferasa con cada sitio de unión en la 3'-UTR del
Renilla luciferasa
miR-19a gen (Fig 1B). plásmidos informadores de luciferasa con las secuencias no coincidentes con la región de semilla de miR-19a comprenden el control negativo. Estamos transfectadas
Renilla luciferasa
plásmidos informadores que llevan los posibles sitios de miR-19a-unión de miR-19a candidatos a blancos y el control interno de la luciérnaga plásmidos de luciferasa en células HEK293 en la que se confirmó la expresión de miR-19a. Los plásmidos fueron examinados para la actividad de la luciferasa por el sistema dual-luciferasa. La actividad de la luciferasa de todos los plásmidos con los sitios de unión de los genes miARN-fue significativamente menor que la del control vector vacío (Fig 1C), lo que sugiere que la unión miR-19a-secuencias en cada ARNm candidatos objetivo miR-19a son reconocidos correctamente por endógena miR 19a en células HEK293. Además, se analizó la actividad luciferasa de los plásmidos que llevan los sitios de unión de miARN-bajo miR-19a desmontables mediante co-transfección con LNA anti-miR-19a. La actividad de la luciferasa de todos los plásmidos con los sitios de unión a miRNA aumentó significativamente en las células tratadas con LNA anti-miR-19a en comparación con la de las células tratadas con LNA control (Fig 1D). Estos resultados sugieren la posibilidad de que estos genes son genes diana miR-19a. A continuación realizó otros experimentos para evaluar la posibilidad de que estos son los genes diana de miR-19a.
(A) Descripción general de miR-19a ARNm diana candidatos. Los sitios de miR-19a de unión identificados usando el software PicTar, TargetScan, o Miranda se muestran en la región 3 'no traducida (UTR) de miR-19a ARNm diana candidatos. (B) Construcción de vectores de luciferasa. Los sitios de miR-19a-unión de los genes candidatos y las secuencias de control negativo (negativo Ctrl) fueron clonados aguas abajo de la ORF de la luciferasa en el
Xba
sitio de restricción I del vector PTK-HRG. Sentido (
superior) y antisentido (
menor
) hebras de secuencias complementarias indican el sitio de destino miARN de las secuencias de mRNA 3'-UTR y miR-19a, respectivamente. Subrayados indican secuencias de semillas de miR-19a. El plásmido de control negativo tiene desajustes en el centro de secuencias de semillas de miR-19a. (C) La actividad de la luciferasa de construcciones con sitios de miR-19a de unión se comparó con la del vector vacío, que no tenía ningún inserto en el
Xba I
sitio (n-Insert Ctrl), y se analizó estadísticamente . (D) los plásmidos de luciferasa con el sitio de miR-19a-unión y el plásmido de control negativo fueron transfectadas con anti-miR-19a-LNA o control-LNA (Ctrl). La actividad luciferasa de las células tratadas con anti-miR-19a-LNA se comparó con la de las células tratadas con el control-LNA. *,
p Hotel & lt; 0,05 y **,
p Hotel & lt; 0.005 El uso de dos colas
t-pruebas
.
Evaluación de genes candidatos por un
desplegable de ensayo in vitro utilizando biotina miR-19a
miRNA genes diana fueron recientemente recuperados por un procedimiento de dos pasos en el que el complejo mRNA /miRNA /FLAG-AGO2 fue retirado primero hacia abajo con un anticuerpo anti-FLAG y, a continuación, el complejo /biotinilado miARN ARNm se purificó por perlas de estreptavidina en el extracto de las células transfectadas con los genes miARN biotinilado y el vector de expresión de ADNc de FLAG-AGO2 [25]. Por lo tanto, para evaluar nuestros genes candidatos como objetivos de miR-19a, adoptamos la mejora de
in vitro
desplegable de ensayo en la (Fig 2A). En primer lugar, el extracto celular fue ligeramente preparado a partir de células HEK293 en los que se detectó expresión suficiente de cada mRNA candidato (Fig 2B). El miR-19a de doble cadena biotinilado o controlar ARN aleatorio se incubó en extracto celular para producir un complejo de la biotinilado miRNA sola hebra con RISC y mRNA. El biotinilado complejo miRNA /ARNm /RISC se incubó con perlas de estreptavidina en el extracto, recogidas por centrifugación corta, y se eluyó con tampón de elución que contiene biotina a partir de perlas de estreptavidina 5 mM. El biotinilado complejo miARN /mRNA se trató por extracción con fenol-cloroformo, DNasa I, y transcripción inversa. Antes del análisis RT-PCR de los genes candidatos objetivo, se confirmó si el complejo miR-19a /mRNA biotinilado contiene el componente AGO2 RISC por el Western Blot. El complejo desplegable con biotinilado miR-19a exhibió la señal de la proteína AGO2 (Fig 2C, carril 1), mientras que no se observó señal para el complejo desplegable con ARN aleatorio biotinilado (Fig 2C, carril 2), lo que sugiere que biotina miR-19a, ARNm objetivo, y AGO2 podría formar un complejo en este ensayo desplegable. A continuación, se comparó la cantidad de ARNm diana candidatas en los complejos tirado hacia abajo con biotina miR-19a y controlar ARN al azar por cuantitativos PCR en tiempo real. cebadores de PCR para los genes diana candidatos fueron diseñados para amplificar la región (100 ~ 300 pb) que contiene la unión de miR-19a-sitios en su 3'-UTR (S1 Tabla). Entre los seis candidatos,
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, y
TUSC2
niveles de mRNA fueron significativamente mayores en el complejo tirado hacia abajo con el miR biotinilado -19a que las del control (Fig 2D). Para la confirmación de este sistema desplegable, se examinaron un gen diana de miR-19a control positivo,
PTEN
, así como un gen de control negativo, cuya secuencia no coincide con las secuencias de semillas de miR-19a. Se detectó un aumento del nivel de
PTEN
mRNA y disminución del nivel de ARNm del gen de control negativo en el complejo desplegable mediante el uso de biotina miR-19a. Por lo tanto, nos centramos en la evaluación de
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, y
TUSC2
genes como objetivos de miR-19a.
(a) Descripción general de la
desplegable de ensayo in vitro. El miR-19a de doble cadena biotinilado o controlar ARN aleatorio se incubó en extracto de células (etapa 1) para producir un complejo de la biotinilado miRNA sola hebra con el ARNm diana y RISC (paso 2). El /diana complejo ARNm biotinilado miARN se incubó con perlas de estreptavidina y tiró hacia abajo (paso 3). El complejo fue tratado por DNasa I y transcrito de forma inversa (paso 4). (B) La expresión de miR-19a ARNm diana candidatas en células HEK293.
PTEN
, conocido como uno de los genes diana miR-19a, se utilizó como control positivo. El gen, cuya secuencia no coincide con las secuencias de semillas miR-19a, se utilizó como control negativo. (C) La confirmación de la proteína en el complejo ARNm AGO2 /los genes miARN objetivo biotinilado por el Western Blot con el anticuerpo AGO2. Biotinilado miR-19a (carril 1), control biotinilado ARN aleatorio (carril 2), y biotina (carril 3) se utilizaron para el ensayo de pull-down y se sometieron a SDS-poliacrilamida electroforesis en gel y transferencia Western. extracto celular total se utilizó como control positivo (carril 4). (D) La detección de ARNm diana en biotina complejo ARNm miARN /target por tiempo real de RT-PCR. El nivel relativo de cada ARNm diana en el complejo tira hacia abajo mediante el uso de biotina miR-19a se comparó con la del complejo empujado hacia abajo por utilizando el ARN aleatorio de control biotinilado. **,
p Hotel & lt; 0.005 El uso de dos colas
t-pruebas
.
Evaluación de cuatro genes candidatos por Western Blot
Los genes
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, y
TUSC2
fueron evaluados como objetivos de miR-19a utilizando otro análisis para examinar la regulación postranscripcional por miR-19a en las células. En un primer momento, imitador de miR-19a o controlar miARN al azar se transfectaron en células HEK293 para examinar si el miR-19a redujo la expresión de las cuatro proteínas diana de miR-19a. Mediante transferencia Western a las 72 h después de la transfección, se observó una disminución de expresión de las cuatro proteínas diana en las células-mímica tratada miR-19a en comparación con la de las células miARN tratados de control (Fig 3A). En segundo lugar, LNA anti-miR-19a o el control de LNA se transfectó en células HEK293 para derribar endógena de miR-19a, y la expresión de las cuatro proteínas candidatas se analizó por Western Blot. se observó aumento de la expresión de las cuatro proteínas diana en las células de LNA tratados con anti-miR-19a en comparación con la de las células de LNA tratados con control (Figura 3B). Tomados en conjunto,
FOXP1
,
TP53INP1
,
TNFAIP3
, y
TUSC2
se confirmó que eran los genes diana de miR-19a. El análisis de expresión no se observó ningún cambio en SIVA1 o TNFRSF12A expresión en células de LNA tratados con anti-miR-19a en comparación a la de control de las células tratadas con LNA (S1 FIG)
.
(A) de proteínas candidatas por el oeste blot utilizando proteínas de las células HEK293 transfectadas con mímica miR-19a o el control oligo RNA.-, control de ARN oligo; +, Imitador de miR-19a. (B) Análisis de la expresión de proteínas candidatas por Western blot utilizando las proteínas de las células HEK293 transfectadas con LNA anti-miR-19a o LNA.- control, control LNA;