Extracto
En general, la mayoría de cáncer de ovario no se puede detectar hasta gran escala y la metástasis a distancia se produce, que es la principal causa de la alta mortalidad en el cáncer de ovario. Por lo tanto, es urgente descubrir biomarcadores relacionados con la metástasis para la detección de cáncer de ovario en fase de metástasis ocultas. glicosilación alterada es una característica universal de malignidad y ciertos tipos de estructuras de glicanos son marcadores conocidos para progresiones tumorales. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo revelar cambios específicos de
N
-glycans en secretoma del cáncer de ovario metastásico. Se empleó un enfoque glycomics cuantitativo basado en el etiquetado de isótopos estables metabólica para comparar el diferencial
N
-glycosylation de secretoma entre una línea celular de cáncer de ovario SKOV3 y su alto derivado SKOV3-ip metastásico. Curiosamente, entre total de 17
N
-glycans identificado, el
N
-glycans con GlcNAc de bisección se redujeron significativamente en todos los SKOV3-ip en comparación con SKOV3. Esta alteración en bisectriz glicoformas GlcNAc, así como su correspondiente asociación con el comportamiento metastásico cáncer de ovario fue validado a nivel glycotransferase con múltiples técnicas que incluyen la PCR en tiempo real, transferencia Western, ensayo transwell, transferencia de lectina y análisis de inmunohistoquímica. Este estudio ilustra
N
alteraciones relacionadas -glycan metástasis en el cáncer de ovario secretoma
in vitro
por primera vez, que es una fuente valiosa para el descubrimiento de biomarcadores también. Por otra parte,
N
-glycans con GlcNAc de bisección arrojar luz sobre la detección de cáncer de ovario en estadio temprano metástasis peritoneal, que en consecuencia puede mejorar el pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario
Visto:. Zhang X, Wang Y, Qian Y, Wu X, Zhang Z, Liu X, et al. (2014) Descubrimiento de metástasis específica relacionada con
N
-Glycan Las alteraciones en epitelial de los ovarios cáncer en base a Glicómica cuantitativa. PLoS ONE 9 (2): e87978. doi: 10.1371 /journal.pone.0087978
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Septiembre 2013; Aceptado: 2 Enero 2014; Publicado: 6 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Programa Nacional de Investigación básica de China (973 programas) (2012CB8221004, 2013CB910503), de alta tecnología del Plan Nacional de I & amp; D del Programa (Programa 863) (2012AA020203) y el Fondo Nacional de ciencias naturales (31100586, 31010103906, 30930025, 31170766, 81272879, 81302258), el líder del proyecto de Shanghai disciplina académica (B117), y el proyecto de énfasis de la investigación fundamental Shanghai (11JC1401502). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es la neoplasia ginecológica más letal en todo el mundo [1], [2]. De acuerdo con un reciente informe de la Sociedad Americana del Cáncer, aproximadamente 22.240 nuevos casos serán diagnosticados con cáncer de ovario en 2013, mientras que casi 14.030 sucumbirán a la enfermedad [3]. Actualmente, la ecografía de la pelvis y la prueba de CA125 en suero sirven como principales rutinas de detección de [4], [5], [6], [7], que son eficaces en algunos casos. Sin embargo, la mayoría de cáncer de ovario puede todavía no ser diagnosticado hasta que el tumor ha progresado a una etapa avanzada, que presentaban a gran escala o metástasis a distancia. En la clínica, el patrón metastásico más común de cáncer de ovario se reconoce como la implantación peritoneal [8]. Debido al hecho de que los primeros lugares de metástasis peritoneales son generalmente demasiado pequeño para ser detectado macroscópicamente [4], [9], la tasa de supervivencia de cinco años siempre sufre este diagnóstico terminal pobre y es testigo de una disminución dramática cuando se produce la metástasis peritoneal a gran escala, desde alrededor de 90% en la fase I de 2 a 80% en la etapa II-IV [4], [10], [11]. Por lo tanto, es necesario descubrir biomarcadores relacionados con la metástasis, que podría ayudar en la detección de cáncer de ovario tan pronto como sea posible en lugar de hasta la amplia propagación de tumor fuera de los ovarios.
La glicosilación es una de las poste más prevalente modificaciones -translational que produce varios tipos de glicanos que se unen con frecuencia a las proteínas. Glicanos participan en grandes eventos fisiopatología durante progresiones tumorales [12], [13], [14]. glicosilación alterada es una característica universal de malignidad, y algunas de estas alteraciones contribuyen a los procesos metastásicos [12], [15]. Por ejemplo, aumento de la actividad o la expresión de
N
V -acetylglucosaminyltransferase (MGAT5) y β-1, 6-GlcNAc ramificado
N
-glycans se ha encontrado en tumores altamente metastásicos, como el de colon , cánceres hepáticos y de mama [16], [17], [18], [19], [20]. Además, la alteración de la sialilación se ha informado que contribuye a la metástasis en estas células tumorales así como [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]. Por otra parte, otros patrones de glicosilación aberrante incluyendo núcleo-fucosa, bisectriz GlcNAc
N
-glycans han sido conocidos por estar asociados con la metástasis de muchas células malignas [28], [29], [30], [31], [32]. En consecuencia, las aberraciones asociadas con el cáncer en las estructuras de glicano proporcionan una justificación convincente para el nuevo descubrimiento de biomarcadores [33].
En el caso del cáncer de ovario, glicosilación aberrante ha sido descrita en varios estudios, incluyendo principalmente el aumento de silylaiton y fucosilación de
S
-vinculada glicanos, los niveles más altos de biantenario
N = Conectado
glicanos, fucosilación central elevada, y que divide en dos
N
glicosilación -vinculada [34]. Actualmente, el papel de la glicosilación de juego modificación en la metástasis del cáncer de ovario también se ha indicado en varios estudios. Por ejemplo, la mesotelina-MUC16 de unión que facilita la metástasis peritoneal de los cánceres de ovario se ha demostrado
N
-glycan dependiente [35]. La capacidad de células de adhesión a hialuronano en líneas celulares de carcinoma de ovario puede ser alterado mediante la eliminación de restos de carbohidratos de las superficies de las células [36]. Estos estudios sugirieron la implicación de glicanos en los procesos de metástasis, mientras exacta
N
cambios -glycan asociados con la metástasis en el cáncer de ovario sigue siendo poco clara, como las que en la superficie celular y las glicoproteínas de células secretadas. Dado que los cambios en la estructura de glicano específicas en secretoma de células de cáncer pueden ser potenciales biomarcadores para el diagnóstico no invasivo [37], en este estudio, nos hemos centrado en revelar la metástasis asociada a
N
alteración -glycosylation en glicoproteínas secretadas por los ovarios las células cancerosas.
glycomics cuantitativo basado en la espectrometría de masas (MS) se ha demostrado ser una herramienta prometedora y de gran alcance para identificar alteraciones globales de glicanos entre diferentes muestras biológicas [38], [39], [40], que incluye estrategias de libre de etiquetas y estrategias de etiquetado de isótopos estables. El primero es mucho más simple, mientras que el último es más robusto. Un método glycomics cuantitativo basado en la incorporación metabólica de etiquetas de isótopos estables (detección isotópica de aminoazúcares con glutamina, IDAWG) se ha informado recientemente [41]. En este método, las células marcadas diferencialmente se pueden mezclar juntos temprano en el flujo de trabajo, que reduzcan al mínimo cualquier posible sesgo introducido durante el procesamiento de la muestra y ofrecen un método fiable cuantificación [39], [42]. En nuestro estudio, diferente de análisis cuantitativo de glycomics glicoproteínas de la superficie celular utilizando IDAWG informó anteriormente, se empleó el método glycomics cuantitativos basados en la incorporación metabólica de las etiquetas de isótopos estables a la diferencia de
N
-glycosylation análisis de secretoma entre dos células de cáncer de ovario líneas, SKOV3 y su alto derivado SKOV3-ip metastásico. Posteriormente, asociados a metástasis
N
cambios -glycan en cáncer de ovario descubierta por este método glycomics fueron validados a nivel glycotransferase con diferentes técnicas de biología molecular, incluyendo PCR en tiempo real, transferencia de Western, transferencia de lectina, transwell ensayo y análisis de inmunohistoquímica. El flujo de trabajo total en nuestro estudio se muestra en la Figura 1. Para nuestro conocimiento, este es el primer intento de revelar imagen global de los
N
alteraciones relacionadas -glycan metástasis en el cáncer de ovario secretoma celular. Además, entre estos cambios, disminución en bisectriz modificación GlcNAc y su correspondiente glycotransferase (manosilo (Beta-1,4 -) - glicoproteína Beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa, MGAT3) expresión se demostró estar relacionado con un mayor potencial metastásico. Este estudio proporcionó información sobre el descubrimiento de biomarcadores asociados a metástasis, lo que podría ayudar en la detección de metástasis peritoneal precoz del cáncer de ovario, y, finalmente, mejorar el diagnóstico de cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y metabólico de isótopos estables de etiquetado
seroso línea celular de cáncer de ovario SKOV3 y su alto derivado SKOV3-ip metastásico se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Estas dos líneas celulares de cáncer de ovario se cultivaron en medio celular RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen). línea celular 293T se obtuvo del Instituto de Biología Celular Académico Sínica (Shanghai, China). Las células 293T se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10%. Todas las células se cultivaron con 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora. Para experimentos de marcaje de isótopos estables, las células fueron cultivadas durante al menos seis duplicaciones en el medio RPMI1640 con suero bovino fetal al 10%, que contiene 20 mM de L-glutamina (ya sea
14N o amida
15N-Gln) para lograr completa incorporación de la etiqueta
N
-glycans [41]. Amida
15N-Gln (98% de pureza) se adquirió de Cambridge Isótopos, Inc. (Andover, MA, EE.UU.).
sobrenadante Adquisición
Seis millones de células marcadas se sembraron en 55-cm
2 placas de cultivo celular y mantenido durante la noche para la fijación celular en el medio RPMI1640 suplementado con suero bovino fetal 10%, 20 mM de L-glutamina (ya sea
14N o amida
15N-Gln). Después de 12 h, se eliminó el medio de cultivo y se lavaron las células 3 veces con solución salina tamponada con fosfato. Y después se añadieron 10 ml de suero libre, fenol medio RPMI 1640 libre de rojo con L-glutamina (ya sea
14N o amida
15N) 20 mM a cada plato. Después de la incubación durante 48 h, se recogió el medio acondicionado y se filtró a través de un m Durapore PVDF Membrana 0.22 (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Antes, durante y después de la privación de suero, la viabilidad de las células cancerosas se evaluó mediante el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano. Las concentraciones de proteína de medio acondicionado se determinaron utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL). El medio condicionado con la misma cantidad de proteína obtenida de SKOV3 y SKOV3-ip se mezclaron. Posteriormente, las mezclas se concentraron por Amicon Ultra-15, 3000 corte de peso molecular (MWCO) unidades de filtro centrífugo (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) con la eliminación de exceso de sal para glycomics cuantitativos. Todas las muestras fueron almacenadas a -80 ° C hasta su uso posterior.
Soltar y purificación de N-glicanos de la Secretada del Proteoma
El
N
liberación de glucanos -vinculada y purificación eran realizado como se ha descrito previamente con modificaciones menores [43]. Las alícuotas de solución de proteína mixta (100 l) se diluyeron con un volumen igual de tampón compuesto por NH 200 mM
4HCO
3 (Sigma-Aldrich, Alemania) que contiene mdithiothreitol 20 mM (Sigma-Aldrich, Alemania) desnaturalización. Las muestras se calentaron durante 10 min en 95 ° C baño de agua. Después de que las muestras desnaturalizadas se enfrió a la temperatura ambiente, se añadió 1 l de PNGasa F (New England Biolabs, Inc., EE.UU.) a cada muestra, seguido de incubación durante la noche a 37 ° C. Posteriormente, las proteínas desglicosiladas se precipitaron mediante la adición de 600 l de etanol enfriado almacenadas a -80 ° C durante 2 h. Después de centrifugación a 14.000 x g, durante 30 min a 4 ° C, se recogió el sobrenadante y se secó a través de centrifugación al vacío. Los glicanos liberados fueron nuevamente purificada y desalaron utilizando una extracción en fase sólida de carbón poroso gráfico (PGC-SPE). Con este fin, las microcolumnas PGC estaban llenas de polvo de carbono gráfico porosa y se prepararon usando las puntas GELoader como se describe antes [44]. Las microcolumnas se preacondicionaron con 6 volúmenes de columna de 0,1% (v /v) de ácido trifluoroacético (TFA) en 80% de acetonitrilo (ACN) /H (v /v)
2O y equilibrada con un volumen igual de agua. Después, las muestras se aplicaron a las columnas repetidamente 5 veces para lograr la adsorción glicanos completa. Posteriormente, las microcolumnas se lavaron con volúmenes aproximadamente 10 de columna de agua para eliminar las sales y tampón. Los glicanos se eluyeron con 25% (v /v) de ACN que contenía 0,05% (v /v) de TFA. Cada muestra se dividió en dos alícuotas iguales y se liofilizó en un liofilizador de vacío (Martin Cristo GmbH, Osterode, Alemania). Una parte alícuota igual de cada muestra se almacenó a -80 ° C hasta su posterior análisis. Se permetiló otra alícuota igual de cada muestra.
permetilación de
N
-glycans
N
-glycans fueron permetilados usando un procedimiento publicado previamente con menor modificaciones [45]. En pocas palabras, se secó
N
-glycans se suspendieron en 200 l de dimetilsulfóxido (DMSO), y se añadieron aproximadamente 20 mg de polvo de NaOH. Después de que la suspensión se mezcló vigorosamente, 100 l de CH
3I se añadió y el después de la incubación se llevó a cabo en un baño de ultrasonidos durante 30 min. La reacción se inactivó mediante la adición de 1 ml de agua, y el exceso de CH
3I se eliminó bajo una corriente de nitrógeno. Posteriormente, se añadió 1 ml de cloroformo con agitación fuerte. Después de la separación de fases, la fase acuosa se desechó mientras que la fase inferior de cloroformo se lavó 10 veces con 1 ml de H
2O y se seca bajo un flujo de nitrógeno en una campana de matriz asistida por láser de desorción /espectrometría de masas de ionización (MALDI MS) análisis.
MALDI MS análisis
análisis de espectrometría de masas MALDI se realizó en AXIMA Resonancia MALDI TOF MS QIT (Shimadzu Corp., Kyoto, Japón) con un láser de nitrógeno 337 nm. Todas las muestras se analizaron en un voltaje de aceleración de 20 kV en el modo de iones y reflectrón positivo. CID se realizó a una energía de colisión de 4 keV utilizando argón como gas de colisión. El instrumento se calibró externamente por TOFMix ™ (LaserBio Labs, Francia) que contiene ocho péptidos patrón de calibración. Antes del análisis MS, glicanos unpermethylated se reconstituyeron en una alícuota de 5 l de 0,1% (volumen /volumen, v /v) de TFA en 50% ACN /H
(v /v) 2O y permetilados glicanos se reconstituyeron en una 5-l alícuota de 50% de metanol. Cada muestra (1 l) fue vista sobre una diana de MALDI y se dejó secar al aire a temperatura ambiente. Después, (v /v) que contiene 0,1% se añadió 1 l de 2,5 dihidroxibenzoico-matriz de ácido (DHB, Sigma-Aldrich, Alemania) a la concentración de 12,5 mg mL
-1 en 50% de ACN en agua TFA sobre la capa de la muestra y se seca en condiciones ambientales. Cada muestra fue descubierto por triplicado. Dos disparos de láser se establecieron para generar un perfil y 200 perfiles se acumularon desde diferentes puntos de irradiación láser en un solo archivo para cada punto de la muestra. Para la comparación de
N
-glycans de secretomas de las dos células de cáncer de ovario, una mezcla 01:01 de
14N- y
muestras marcada con 15N se obtuvo inicialmente a través de la mezcla de igual cantidad proteínas de partida. Y se analizó la mezcla (tres repeticiones) para determinar los cambios relativos en las abundancias de
N
-glycans entre línea celular de cáncer de ovario SKOV3 y su derivado alta SKOV3-ip metastásico. Todas las estructuras propuestas de glicanos identificados se interpretan con base en sus manualmente
m /z
valores de acuerdo con Serveral literaturas publicados anteriormente [46], [47], GlycoWorkbench [48], glicanos del espectro de masas de base de datos [49] como así como GlycoBase (Versión 2, http://glycobase.nibrt.ie/glycobase.html).
cuantitativo PCR en tiempo real para el análisis de la expresión de ARNm
Un total de ARN se extrajeron de cáncer de ovario líneas de células con el reactivo TRIzol ™ (Invitrogen) y 2 g de ARN total fue de transcripción inversa utilizando el kit de RT Master Mix (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó en ABI 7500 sistema de PCR rápida en tiempo real (Applied Biosystems). Las condiciones del ciclo de PCR consistió en una única etapa de incubación a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 5 s a 95 ° C, y 34 s a 60 ° C. Todas las reacciones de PCR se realizaron con SYBR verde Premix en tiempo real PCR kit (Takara) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Imprimaciones secuencias utilizadas en el análisis de PCR fueron las siguientes: MGAT3 humano hacia adelante (5'-CAGGGCACAGGATTGAAGAGTT-3 ') y MGAT3 inversa humana (5'-AGCTTGGTTTCCCTTCATATTGAG-3'); MGAT5 humana hacia adelante (5'-GACCTGCAGTTCCTTCTTCG-3 ') y reversa MGAT5 humana (5'-CCATGGCAGAAGTCCTGTTT-3'); deshidrogenasa humana gliceraldehído-3-fosfato (GADPH) hacia adelante (5'-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 ') y reversa GAPDH humano (5'-TGAGCGATGTGGCTCGGCT-3'). ARNm de GAPDH humano sirvió como control endógeno para la normalización. Análisis en tiempo real PCR se llevó a cabo por triplicado.
Los plásmidos y Gene sobreexpresión
células
SKOV3-ip y SKOV3 se transfectaron utilizando X-tremeGENE HP DNATransfection de reactivos (Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania ) con plásmidos pcDNA3.1-MGAT5, respectivamente (proporcionados por un investigador en nuestro laboratorio), según las instrucciones del fabricante pcDNA3.1-MGAT3 o. Y vector pcDNA3.1 se utilizó como control negativo. A las 48 h después de la transfección, la sobreexpresión de MGAT3 y MGAT5 fueron confirmados por Western blot.
pequeños ARN de interferencia y Derribo de MGAT3
SKOV3 fueron transfectadas con siRNA MGAT3 reactivo de transfección Complejo, (Santa Cruz Biotech, Inc., sc-44469), que se preparó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Revueltos siRNA se utilizó como control negativo. A las 48 h después de la transfección, lisados de células se prepararon para análisis de transferencia Western para determinar gen eficacia de abatimiento.
Western Blot y análisis de transferencia de lectina
A fin de obtener proteínas de células enteras, las células se recogieron , se lavó con solución de tampón fosfato (PBS) y después se lisaron en SDS tampón de lisis [50]. Las concentraciones totales de proteína se determinaron mediante el ensayo de BCA (Pierce, Rockford, IL). Cantidades iguales de lisados totales de proteína de cada línea celular se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida sulfato de dodecil de sodio 10% (SDS-PAGE) y después se transfirieron a membranas de PVDF (Roche Applied Science). yo. El análisis de transferencia Western: Tras el bloqueo con 5% de leche desnatada en solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween 20 (TBST) durante 2 h a temperatura ambiente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpo monoclonal de ratón contra MGAT3 (1/1000 diluido, sigma) o MGAT5 (1/1000 diluido, Sigma) y después un anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, las membranas se detectaron por un aumento de quimioluminiscencia kit de ensayo (ECL). ii. Lectina análisis de transferencia: Después de bloquear con BSA al 5% en TBST, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con biotina
Phaseolus vulgaris erythroagglutinin gratis (E-PHA) (1/5000 diluido, Vector Labs) o
Phaseolus vulgaris leucoaglutinina gratis (L-PHA) (1/5000 diluido, vector Labs). A continuación, las membranas se lavaron cuatro veces con TBST, seguido de incubación con estreptavidina peroxidasa de rábano picante (Vector Labs) durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se lavaron cuatro veces con TBST y se detectaron por kit de ensayo de ECL.
Transwell migración Ensayo
Para evaluar la capacidad migratoria, la migración celular se realizó utilizando cámaras de formato de 24 pocillos Transwell ( filtro de poro 8 micras, Corning, Canton, NY). Brevemente, las células fueron transfectadas con SKOV3 MGAT3 siRNA o plásmido MGAT5, y las células SKOV3-ip se transfectaron con el plásmido MGAT3 durante 36 h, respectivamente. Después de eso, las células se tripsinizaron, recogieron, se contaron, y luego se suspendieron en medio RPMI 1640 libre de suero. 2 × 10
4 células en 100 l de medio RPMI 1640 libre de suero se entretejieron para cada inserto de la cámara superior. Mientras tanto, se añadieron 600 l de medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS a cada cámara inferior. Posteriormente, las células se incubaron durante 12 horas a 37 ° C. Después de la eliminación de las células en la superficie de la membrana superior, las células en la superficie inferior de la membrana se fijaron y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, las células que habían pasado a través del filtro a la cámara inferior se contaron microscópicamente en 6 regiones al azar por filtro. El número de células que atravesaron la membrana reveló la capacidad migratoria de las células de la prueba.
Análisis inmunohistoquímico
Un total de 24 tejidos de cáncer de ovario fueron fijadas en formol al 4% y embebidos en parafina. Las secciones de tejido se sometieron primero a hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción para el diagnóstico histopatológico. Entonces, la tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-MGAT3 (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) se realizó como se describió anteriormente [51]. La intensidad de la tinción MGAT3 fue escalado de 0 a 3, donde 0 representa la tinción negativa, 1, 2, 3 representan tinción débil, moderada y fuerte, respectivamente. tejidos de cáncer de ovario se obtuvieron del Hospital de Obstetricia y Ginecología de la Universidad de Fudan, Shanghai, China. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética del hospital. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. La información clínica de estos pacientes se muestran en la Tabla S1.
Tratamiento de datos y análisis estadístico
MALDI MS y la espectrometría de masas en tándem (MS /MS) datos fueron adquiridos y procesados en el software de ejecución (Shimadzu Biotech , Kyoto, Japón). Los parámetros de procesamiento pico: método de suavizado: Gauss; método de detección de pico: umbral 25% centroide; umbral de offset: 0.500 mV. El
m /z
valores e intensidades fueron exportados como archivos ASCII e intensidades de los picos se escalan con el pico más alto como 100%. La cuantificación relativa de los detectados
N
-glycans estaba de acuerdo con los protocolos se informó anteriormente [42]. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 5). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces. Los datos se expresaron como la media ± error estándar de la media (SEM). Student de
t-test
se utilizó para determinar la significación de las diferencias entre los dos grupos. Prueba de los rangos con signo de Wilcoxon se utilizó para comparar los datos de inmunohistoquímica de los dos grupos. Un
p-valor
de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Cuantitativa /Análisis Comparativo Glicómica de sobrenadante entre SKOV3 y Cell SKOV3-ip
Para descubrir la metástasis relacionada con
N
alteración -glycan en secretoma de células de cáncer de ovario, el conjunto total de
N
mezcla -glycan, liberado por la enzima péptido
N
-glycosidase F de la mezcla de secretoma SKOV3 (amida
15N-Gln etiquetado) y las células SKOV3-ip (amida
14N-Gln etiquetada), se analizó por MALDI-TOF MS QIT-( Figura 2). Un total de 17
se identificaron N
-glycans, incluidos los de alta manosa, híbrido, triantenario, estructuras tetra-antenario y bisectrices glicoformas GlcNAc. Todo el identificada
N
-glycans con estructura propuesta se muestra en la Figura 2 y se resumen en la Tabla 1.
N = Conectado
glicanos de una mezcla 01:01 de SKOV3 -ip (Gln-14 etiquetados) y SKOV3 (Gln-15 marcado) sobrenadante. Las estructuras fueron interpretados de forma manual en base a sus
m /z
valores de acuerdo con varias literaturas publicados anteriormente [46], [47], [48] GlycoWorkbench así como glicanos del espectro de masas de base de datos [49]. Gln-14 indica amida
14N-Gln; Gln-15 indica amida
15N-gln. círculo verde indica manosa; círculo amarillo indica galactosa; cuadrado azul indica
N
acetilglucosamina; triángulo rojo indica fucosa.
El análisis cuantitativo de
N
-glycans de la mezcla de secretoma SKOV3 y células SKOV3-ip se basó en la intensidad de la señal. Las relaciones de intensidad (SKOV3-ip /SKOV3) de 0,83 y 1,2 se establecieron como el umbral para estimar el intermedio o regulación de la
N
niveles -glycan en células SKOV3-ip, en comparación con las células SKOV3 , ya que el coeficiente máximo de variación (CV) (n = 9) estaba por debajo de 20% en este estudio [43]. la cuantificación relativa de todos detectada
N
-glycans entre SKOV3-ip y las células SKOV3 se resume en la Tabla 1. Los resultados demostraron que tres de cada cuatro estructuras altas en manosa fueron hasta reguladas en las células SKOV3-ip.
N
-glycans contienen híbrido, triantenario y estructuras tetra-antenarios con o sin fucosa fueron elevados en las células SKOV3-ip. Se observó la tendencia similar en tres glicanos con estructuras biantenarios complejos. Entre todos la alteración en
N
-glycans, todo el
N
-glycans con bisectriz GlcNAc resultaron ser aparentemente disminuyó en las células SKOV3 en IP, con sus coeficientes de SKOV3-NI /SKOV3 que van desde 0,73 a la 0,12, mientras que todo el β-1,6-GlcNAc ramificado
N
-glycans fueron elevados en las células SKOV3-ip. Entre estos alterados
N
-glycans, nos centramos en la
N
-glycans con GlcNAc de bisección, en parte porque todos ellos disminuyó y eran los más obviamente alterado
N
-glycans. Por otra parte, un creciente cuerpo de evidencia ha indicado que los glicanos bisectrices pueden afectar a la progresión tumoral y la metástasis [52] .Las estructuras que contienen GlcNAc de bisección se ve confirmado por espectrometría de masas en tándem (MS /MS). Representante tándem MS espectros de
m /z 2012.7
[M + Na]
+ y
m /z 2377.8
[M + Na]
+ se muestra en las figuras S1A -B.
es de destacar que los ácidos siálicos, por lo general se presentan como monosacáridos terminales en el resto glicano de muchas glicoproteínas, juegan un papel esencial en muchos procesos fisiológicos y patológicos. glicanos Sialylated son lábiles y fácil de perderse durante el análisis de espectrometría de masas directa de no derivadas
N
-glycans. Como permetilación puede estabilizar los residuos de ácido siálico mediante la conversión de OH altamente polar y COO
- grupos de los diferentes monosacáridos en no polar,
también fueron analizados [38] N
-glycans después permetilación. Los resultados demostraron que se observaron más
N
-glycans con diferente grado de sialilación en comparación con los resultados del análisis sin permetilación. A pesar de que la señal de un
N
-glycan cortadas en su punto GlcNAc podría descentralizarse a varias señales de
N
-glycans con diferente grado de sialilación, la tendencia de alteración en todas las estructuras de GlcNAc de bisección fueron los mismo sin importar permetilada o no (véase la figura S2). La intensidad de la señal de la bisectriz
N
-glycan sin permetilación (Figura S2A,
m /z 2012.6
por ejemplo) fue mayor que la de permetilada
N
-glycans en
m /z 2489.4
,
m /z 2850.3
y
m /z 3211.4
que contiene 0, 1 y 2 ácidos siálicos, respectivamente (Figura S2 B). Es, posiblemente, debido a que parte de la intensidad de la señal original de bisectriz (Figura S2A) fue aportado a los correspondientes fragmentos de los glicanos con la misma estructura, mientras que contiene ácidos adicionales 1 y 2 siálico (Figura S2B). Además, los perfiles de glicano con permetilación eran más complejas (es decir, tienen más picos). De esta manera, se sugiere que la etapa de permetilación probablemente podría ser omitido en el análisis cuantitativo de estos glycomics neutros
N
-glycans que es irrelative a los ácidos siálicos, como bisectriz GlcNAc glicoforma en este estudio.
Expresión diferencial de MGAT3 en SKOV3-ip y líneas celulares SKOV3
a medida que divide en dos residuos de GlcNAc fue sintetizado por glycosytransferase específica (MGAT3), el cambio en el
N
-glycans con GlcNAc de bisección podría correlacionarse con la modificación correspondiente en MGAT3. Por lo tanto, el análisis de PCR en tiempo real se llevó a cabo para comparar los niveles de expresión de ARNm de MGAT3 entre SKOV3 y líneas celulares SKOV3-ip. Los resultados demostraron que MGAT3 se expresó diferencialmente entre las dos líneas celulares. El nivel de mRNA de MGAT3 fue significativamente mayor en las células SKOV3 que en las células SKOV3 IP (61 veces,
p
& lt; 0,001, Figura 3A). Entonces la expresión de MGAT3 en estas dos líneas celulares fue evaluado a nivel de proteínas por Western blot. Se observó la menor abundancia de MGAT3 para las células SKOV3-ip en contraste con las células SKOV3 (Figura 3B). Por lo tanto, una disminución de expresión MGAT3 en ambos niveles de ARNm y proteínas en las células SKOV3-ip estaban de acuerdo con la disminución de la bisectriz modificación GluNAc en el sobrenadante de células SKOV3-ip manifestado por el análisis cuantitativo glycomics.
(A) Los niveles de expresión de mRNA MGAT3 en líneas celulares SKOV3 SKOV3-ip y. Los niveles de mRNA de MGAT3 se normalizaron con los niveles de GAPDH. La media de los cambios veces se calcularon con el 2
-ΔΔCt método. (B) Los niveles de expresión de proteínas de MGAT3 en líneas celulares SKOV3 SKOV3-ip y. Los lisados celulares se aislaron en un 10% SDS-PAGE para el Western Blot utilizando anticuerpos contra MGAT3. beta-actina humana sirvió como control endógeno. línea celular 293T se utilizó como control positivo. Los datos se expresan como la media ± SEM. Cada ensayo se realizó al menos tres veces. Un
p-valor
inferior a 0,05 indica significación estadística de Student utilizando
t-test
.
Efectos de MGAT3 sobre Migración capacidad de las células de un cáncer ovárico
los datos anteriores muestran que los niveles de MGAT3 y su catalysate,
N
-glycans contienen GlcNAc de bisección, fueron significativamente más bajos en las células SKOV3-ip comparación con la de las células SKOV3. Dado que las células SKOV3-ip son los derivados altamente metastásico de células SKOV3, estos resultados sugieren un posible papel de MGAT3 y su catalysate, que divide en dos glicanos, en la motilidad de las células de cáncer de ovario. Para probar esto, gen MGAT3 se sobreexpresa en las células SKOV3-ip por transfección. El análisis de transferencia Western demostró un aumento significativo en la expresión MGAT3 después de la transfección, en comparación con células de control ip SKOV3 (Figura 4A). El nivel de glicanos bisectrices también fueron elevados en consecuencia (Figura 4B). Para confirmar si la sobreexpresión de MGAT3 afecta a la capacidad de migración, se realizaron ensayos de migración trans pocillos. Como se muestra en la Figura 4C y 4D, la capacidad de migración en MGAT3 transfectaron células fue significativamente disminuido a 52% de la de las células de control. Mientras tanto, desmontables de MGAT3 en las células SKOV3 se realizó por MGAT3 de metas de siRNA transfección. El análisis de transferencia Western demostró la depresión eficiente de expresión MGAT3 en SKOV3 después de la transfección (Figura 5A). El nivel de glicanos bisectrices se redujeron regulado en consecuencia (Figura 5B).