Extracto
En la última década, una alta incidencia de ADN mitocondrial somática (ADNmt) de mutaciones se ha observado, sobre todo basado en una fracción de la molécula, en diversos tejidos cancerosos; sin embargo, algunos de ellos se les preguntó por problemas de calidad de datos. Obviamente, sin un entendimiento completo del perfil mutacional ADNmt en el tejido canceroso de un paciente específico, es poco probable que revelar la verdadera relación entre las mutaciones somáticas del ADNmt y la tumorigénesis. Para lograr este objetivo, la forma más sencilla es la comparación directa de todo el genoma de ADNmt variación entre los tres tejidos (es decir, el tejido canceroso, para-canceroso del tejido, y el tejido normal distante) del mismo paciente. Teniendo en cuenta el hecho de que la mayoría de los estudios anteriores sobre el papel de ADNmt en el tumor colorrectal centrado simplemente en el D-loop o segmento parcial de la molécula, en el presente estudio hemos recogido (tejidos cancerosos, para-cancerosas y normales) tres tejidos reclutado, respectivamente, de 20 pacientes con tumor colorrectal y secuenciado completamente el genoma mitocondrial de cada tejido. Nuestros resultados muestran una incidencia relativamente baja de las mutaciones somáticas en estos pacientes; Curiosamente, todas las mutaciones somáticas están en estado de heteroplasmic. Sorprendentemente, las mutaciones somáticas observados no están restringidos a los tejidos de cáncer, para los tejidos para-cáncer y tejidos normales distantes también albergar mutaciones somáticas ADNmt con una frecuencia inferior a los tejidos cancerosos, pero más alta que la observada en la población general. Nuestros resultados sugieren que las mutaciones somáticas ADNmt en tejidos cancerosos no podrían explicarse simplemente como consecuencia de la tumorigénesis; Mientras tanto, las mutaciones somáticas ADNmt en tejidos normales podría reflejar un entorno fisiológico alterado en pacientes con cáncer
Visto:. Wang C-Y, Li H, Hao X-D, Liu J, Wang J-X, Wang W-Z, et al. (2011) Descubrir el perfil de mutaciones somáticas ADNmt en pacientes con cáncer colorrectal chinos. PLoS ONE 6 (6): e21613. doi: 10.1371 /journal.pone.0021613
Editor: Janine Santos, Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Marzo, 2011; Aceptado: June 3, 2011; Publicado: 28 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Comité de Tecnología de la provincia de Yunnan (2007C103M) Ciencia y, y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en la última década, el papel de las mutaciones del ADN mitocondrial (ADNmt) en la tumorigénesis ha recibido mucha atención. Una alta incidencia de mutaciones somáticas del ADNmt, la mayoría en homoplastia, se ha identificado en casi todos los tipos de tejidos cancerosos [1], [2]. No obstante, la relación de mutaciones somáticas del ADNmt y la tumorigénesis ha sido muy debatido. Algunos estudios sugieren que las mutaciones somáticas probable resultado ADNmt de la especie elevados de oxígeno reactivo (ROS) en células tumorales [3], [4], [5], ya que la mayoría de estas mutaciones son T a C y G a A transiciones de base [ ,,,0],1], [2], similar al patrón de mutación de descomposición oxidativa en el ADN [6], [7]. También se sugirió que algunos cambios en el ADNmt podrían desactivar la función de la cadena respiratoria mitocondrial y contribuir así a la procesión del tumor [8], [9], [10], [11]. Por ejemplo, un estudio reciente sugiere que las mutaciones de ADNmt que producen la deficiencia en la actividad del complejo I respiratoria podrían contribuir a la progresión del tumor por la mejora del potencial metastásico de las células tumorales [12]. Por el contrario, algunos estudios sugieren que la mutación somática en el tejido tumoral podría simplemente surgir por casualidad en células progenitoras tumor sin ninguna ventaja fisiológica o requisito tumorigénico [13], [14]. De hecho, Vega y sus colegas encontraron que una gran cantidad de mutaciones de ADNmt en tumores detectados eran, de hecho, los polimorfismos comunes o hotspots mutacionales que prevalecen en poblaciones generales humanos, lo que lleva a los autores a proponer que estas mutaciones somáticas son más propensos a ser neutral [15]. Del mismo modo, el papel funcional de algunas de las mutaciones somáticas ADNmt identificados se les preguntó en gran parte debido a los problemas de calidad de datos [16], [17], [18]. Obviamente, se necesita más evidencia para dilucidar el papel exacto que las mutaciones somáticas ADNmt tienen juego en la tumorigénesis.
En el presente estudio, hemos realizado todo el genoma mitocondrial de cribado para la mutación somática en los tejidos cancerosos y no cancerosos pares de 20 pacientes con cáncer colorrectal. Mediante el uso de las mismas medidas de control de calidad como se aprobó en nuestros estudios anteriores en la secuenciación del ADN mitocondrial completo [19], [20], [21], [22], se pretende obtener una visión más profunda en el perfil de las mutaciones somáticas en el ADNmt colorrectal cáncer. La comparación directa de la totalidad de las secuencias de ADNmt de los tejidos primarios cancerosos, emparejados para-cancerosos normales y distantes normales del mismo paciente, acompañada con el estricto control de calidad de datos, se adopta para revelar un perfil detallado de ADNmt mutaciones somáticas en tanto normales y los tejidos tumorales en el mismo paciente. Nuestros resultados revelaron que las mutaciones somáticas observadas en nuestras muestras son mucho menos frecuentes que los estudios anteriores. Sorprendentemente, todas las mutaciones somáticas son observados en el estado heteroplasmic, una observación bastante diferente de los estudios previos.
Resultado
Un total de 59 secuencias del genoma mitocondrial completo de tres pares de tejidos de 20 cáncer colorrectal los pacientes se obtuvieron en este estudio, y todas las secuencias se han depositado en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) con números de acceso GU392048-GU392106. Todos los sitios variables de ADNmt de cada tejido se han mostrado en un árbol esquemático (Figura 1), que podría proporcionar una comparación directa de toda la variación del genoma de ADNmt entre tres tejidos del mismo paciente y así permitir la localización de la mutación somática (s) en un paciente convenientemente. Como se demuestra en la Figura 1, seis de los 20 pacientes llevaron ADNmt mutaciones somáticas en sus tejidos cancerosos, que ocupa una proporción mucho menor (6/20; 30%) que muchos informes anteriores. Por ejemplo, Tan et al. encontrado 27 mutaciones somáticas en 14/19 (74%) de los pacientes de mama [23]; Zhu et al. encontrado 45 mutaciones somáticas en la posición de nucleótido 35 en 14/15 pacientes (93%) de cáncer de mama [24]; en Polyak et al. (1998), 7/10 (70%) casos de tumores colorrectales se demostraron para llevar uno a tres mutaciones.: Nombres
Haplogroup se insertan a lo largo de las ramas que determinan las ubicaciones de los haplotipos ancestrales correspondientes. Variantes (reconstruidos más parsimoniosa) en las ramas ininterrumpidas se enumeran de forma arbitraria en orden ascendente. Sufijos "A, C y T" indican transversiones, "ins" indica la inserción de un nucleótido; "C /T, A /C, y A /G" sugieren mutaciones heteroplasmic, "d" indica una deleción. variantes recurrentes están subrayados. variación de la longitud de las vías C-posiciona alrededor de 310 y 16189 no está indicado en la figura. Sufijos "C, CP y CN" en los nombres de las muestras indican "tejido canceroso, para-tejido canceroso y el tejido normal", respectivamente.
En total, hay 18 se detectaron mutaciones somáticas en el 59 muestras de tejido en estudio (Figura 1 y Tabla S1), y todas las mutaciones somáticas se producen únicamente en las ramas terminales del árbol filogenético, y no se observó haplotipo-turno. Con la excepción de los genes de ARN codificante (incluyendo sRNA y tRNA), estos sitios de mutación somática se dispersan a través de todo el genoma de ADNmt, lo que parece bastante diferente de la mutación del espectro observado en pacientes con enfermedades mitocondriales [25], [26]. En concreto, siete mutaciones se localizan en la región D-loop, mientras que los 11 restantes localice en las regiones codificantes de proteínas. Entre las mutaciones somáticas 11-región de codificación, sólo dos (es decir, G4532A y A9275G) son sinónimo transiciones que se producen en dos sitios inestables; mientras que el resto nueve mutaciones todos son sustituciones no sinónimas que localizan en las posiciones 6718, 14288, 15332, 15447, y 15276, la mayoría de los cuales están muy conservadas evolutivamente después en comparación con los genomas mitocondriales de 13 diferentes especies de vertebrados (Tabla S1). Al evaluar aún más la conservación de estos cinco sitios de mutación entre un total de 3.635 publicado secuencias del genoma mitocondrial completo de las poblaciones humanas en general, nuestros resultados revelaron que los cinco sitios son altamente conservadas entre las poblaciones humanas generales, así (Tabla S1). Sorprendentemente, a pesar de la alta conservación de sitio de 6718, la variación heteroplasmic 6718A /G presenta tanto en el cáncer y el para-cáncer de los tejidos normales del paciente 1, aumentando la posibilidad de que el tejido normal, el para-cáncer probable ha sido invadido por las células cancerosas . De hecho, un patrón similar se observa en el paciente 3, en la que sus tejidos de cáncer y para-cáncer comparten el mismo heteroplasmic variación 16365C /T. Esta observación, de nuevo, hace hincapié en la necesidad particular de la inclusión del tejido normal distante para su análisis.
Curiosamente, como se muestra en la Figura 1, las mutaciones somáticas del ADNmt identificado no se restringen sólo a los tejidos tumorales, por lo hicimos han observado algunas mutaciones somáticas en los tejidos normales de los pacientes 1, 3, 8, 14, y 20. en concreto, 14.288 transición parece ser un sitio de mutación recurrente, ya que aparece en tres pacientes que pertenecen a diferentes haplogrupos. Esta mutación no sinónimo presenta sólo en los tejidos normales de los pacientes. El sitio de 14288 en sí no se conserva a través de diferentes especies, pero parece estar muy conservada entre las poblaciones humanas; si esta mutación tiene un efecto funcional es desconocida.
En el Paciente número 14, 16093 sitio en el tejido canceroso es homoplastia C, mientras que en el tejido normal normal y distante para-cancerosos este sitio se desplaza a ser heteroplasmic como C /T. Este patrón fue confirmada por el resultado del ensayo DHPLC: en el tejido canceroso sitio de C14 16093 muestra un solo pico, mientras que en los tejidos normales normales y distantes para-cancerosos que muestra el doble pico (Figura 2). Es de destacar que el sitio en sí 16093 es un punto caliente en la población general y la mutación en este sitio también se ha encontrado en el tejido normal de los pacientes de cáncer en otros estudios [27]. fenómeno similar también pasó a 20 paciente, en el que sólo el tejido normal distante albergaba mutación somática (viz., A9275G). Estas mutaciones somáticas ADNmt podrían ser irrelevantes para la tumorigénesis teniendo en cuenta su aparición en los tejidos normales.
La secuenciación directa demuestran que el sitio de nucleótidos 16093 muestra un homoplastia C en el tejido canceroso, mientras que en para-el cáncer de tejido normal normal y distante este sitio se encuentra en estado de heteroplasmic de T /C. DHPLC ensayo confirmó el resultado de secuenciación: C14 en el tejido que muestra un solo pico, mientras que en la CP14 y CN14 muestra pico doble
Discusión
Hasta ahora, la mayoría de los estudios anteriores sobre. el papel de ADNmt en el tumor colorrectal centrado simplemente en el D-loop o segmento parcial de la molécula [28], [29], [30], [31], sólo unos pocos informes se han centrado en el perfil mutacional sobre la totalidad de su genoma (Polyak et al. 1998). Para obtener más conocimientos sobre la relación entre el ADN mitocondrial y el tumor colorrectal, en el presente estudio hemos contratado a tres tejidos (tejidos cancerosos, para-cancerosas y normales) en la muestra de 20 pacientes con tumor colorrectal; mediante la secuenciación de todo el genoma de ADNmt a partir de cada tejido y la comparación de la diferencia mutacional entre tres tejidos de la misma paciente, nuestro estudio reveló una frecuencia relativamente baja y el estado mutacional heteroplasmic de todas las mutaciones somáticas observados. Estas observaciones son muy diferentes de los estudios previos, haciendo hincapié en la complejidad en la etiología de tumor colorrectal.
Dado que la mayoría de los pacientes (12/20) en estudio no albergan ninguna mutación somática ADNmt en sus tejidos cancerosos, una explicación podría ser que se trata de la modificación en el genoma nuclear que ha contribuido a la tumorigénesis en las muestras sin que ello suponga ningún cambio de ADNmt. La frecuencia de mutaciones somáticas del ADNmt (6/20; 30%) observada en nuestro estudio actual, que es comparable a los resultados previos en cáncer de mama (2/10; 20% [22]), pero es significativamente más baja (p & lt; 0,05 ) de las observaciones anteriores, especialmente los de tumor colorrectal. Por ejemplo, Polyak et al. encontraron que 7/10 (70%) pacientes de tumor colorrectal llevan de uno a tres mutaciones [32]. Es posible que la frecuencia de mutación somática puede variar entre las diferentes poblaciones étnicas o se correlacionan con las etapas del cáncer; probar esta posibilidad requeriría un diseño sistemático del estudio en un futuro próximo. Por otra parte, la incidencia mucho menor de mutaciones somáticas observada en nuestro estudio se atribuye más plausible para el control de calidad riguroso que fue adoptada durante la generación y análisis de datos. De hecho, cuando los problemas potenciales identificado en los estudios anteriores mediante el uso de un enfoque filogenético [18] fueron excluidos, la frecuencia de mutaciones somáticas entonces a disminuir considerablemente.
Curiosamente, todas las mutaciones somáticas identificadas aquí están en heteroplasmic, que es bastante diferente de las observaciones anteriores. Especialmente, algunos de la mutación somática heteroplasmic también presente en los tejidos normales de los pacientes con cáncer. Del mismo modo, Taylor y colegas también encontraron ADNmt mutaciones somáticas en el tejido normal en pacientes de tumor colorrectal, y la mayoría de estas mutaciones eran heteroplasmic [33]. Para evaluar si los heteroplasmic ADNmt mutaciones somáticas detectadas en los tejidos normales de los pacientes con cáncer es un fenómeno normal, se determinó la frecuencia de mutaciones somáticas heteroplasmic ADNmt en las poblaciones humanas generales (que abarcan un total de 4738 secuencias del genoma del ADNmt recuperados de la literatura). Nuestro resultado reveló que la frecuencia de los individuos que albergan heteroplasmic mutación (s) ADNmt somática es menos de 4%, lo que sugiere que heteroplasmia en el ADNmt de la población general es un fenómeno raro, al menos cuando se detecta por el método de secuenciación directa del ADN [34], [ ,,,0],35], [36]. A continuación, se revisaron a fondo los estudios anteriores sobre la mutación del ADNmt en diferentes tipos de tumores y se encontró que las mutaciones somáticas ADNmt heteroplasmic también se observaron en los tejidos normales de los pacientes con cáncer [9], [22], [27], [33], [37] , con una frecuencia significativamente mayor (38,6%) que en la población general (3,2%; p & lt; 0,001), pero aún menor que en el tejido canceroso (52,9%; p & lt; 0,05) (Tabla S2). Debido a que cada individuo se caracteriza por una mezcla de haplotipos mitocondriales relacionadas, y heteroplasmia generalizada en los ADN mitocondriales de diversos tejidos humanos normales no se han observado [27], [38], [39], [40]. Es probable que la diferencia observada en las frecuencias de las mutaciones heteroplásmicas entre el tejido normal de pacientes con tumores y de la población general (adoptar comúnmente la sangre periférica) se atribuye a la heteroplasmia entre diferentes tejidos. Alternativamente, el aumento de la frecuencia de mutación heteroplasmic, tanto en tejidos normales cancerosas y coincidentes en pacientes tumorales relativos a la población en general (Tabla S2), podría resultar de un entorno fisiológico alterado (tal vez el elevado nivel de ROS, o algunos otros mutágenos desconocidos). Por ejemplo, Goodwin et al. (2008) encontraron que tanto tumor y los tejidos normales emparejados de pacientes con cáncer de próstata presentan significativamente más alta expresión de espermina oxidasa [41], que se ha relacionado con el aumento de ROS y daño en el DNA [42], [43], en comparación con los tejidos de la próstata disease- pacientes libres.
en retrospectiva, estudios previos han demostrado que la mutación del ADNmt con un potencial efecto funcional podría contribuir a la procesión del tumor [8], [12]. En el presente estudio, las mutaciones somáticas ADNmt identificados en la región de todos ubicados en sitios altamente conservadas evolutivamente de codificación. Por lo tanto, parece posible que estas mutaciones somáticas, aunque todo en heteroplasmic, podrían haber jugado un papel en afectar la función de la cadena respiratoria y por lo tanto tener algún efecto funcional bioquímica a su célula huésped. Sin embargo, teniendo en cuenta que la mayoría de los pacientes no albergan mutaciones somáticas en los tejidos cancerosos, si el efecto funcional de estas mutaciones somáticas son necesarios para la célula huésped sigue siendo desconocido. En cuanto a las mutaciones somáticas ADNmt presentes en los tejidos normales, deben reflejar un microambiente alterado para el ADNmt. Si estas mutaciones, además de la interacción con el microambiente alterado, podría aumentar la susceptibilidad de una célula a la tumorigénesis es desconocido.
En total, la comprensión de la relación entre el ADNmt mutaciones somáticas y la tumorigénesis es una tarea difícil, debido a que las estrategias estimar directamente las células destinos o localizar el proceso detallado de ambos eventos son todavía poco práctico en vivo. Por la variación del genoma directa comparando el ADNmt en tres tejidos emparejados del mismo paciente, nuestro estudio podría proporcionar una extensa perfil de la mutación somática en el ADNmt paciente tumor. Una baja frecuencia de mutación somática ADNmt fue identificado en los pacientes con cáncer colorrectal y todas las mutaciones eran heteroplasmic. Mientras tanto, algunas mutaciones somáticas pueden estar presentes en el tejido normal que indica que estas mutaciones somáticas no son la consecuencia de la tumorigénesis, y podrían reflejar un entorno fisiológico cambiado para el ADNmt en paciente tumor.
Materiales y Métodos
las muestras clínicas
Un total de 59 muestras de tejido fueron recogidos en este estudio, incluyendo los tejidos cancerosos colorrectales primarios (C1-C10), tejidos cancerosos para-normales (CP1-CP10) y distante que corresponde tejidos normales (CN1-CN10), que fueron tomadas de 20 pacientes chinos con cáncer colorrectal durante la cirugía con el consentimiento informado. El tejido canceroso se confirmó mediante diapositivas teñidas con HE de la sección de congelados después de la cirugía, mientras que se obtuvo el tejido normal para-canceroso del tejido normal alrededor del cáncer y el tejido normal distante es de al menos 5 cm de distancia del borde de la el tejido de cáncer. Todos los pacientes fueron diagnosticados clínicamente con la etapa I (T1-T2, N0, M0) cáncer colorrectal de acuerdo con el estándar clínico para la categoría del cáncer [44]. Dado que el objetivo principal de nuestro estudio es determinar la sutil diferencia entre el cáncer y los tejidos normales emparejados desde el punto de vista del genoma mitocondrial, fueron, por tanto, toman sólo los tejidos normales colorrectales (incluidos los tejidos normales para-cancerosas y distantes) del mismo paciente en consideración. El tejido normal para-cancerosa no estaba disponible para el paciente 19. Se llevó a cabo el estudio de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
amplificación y secuenciación de ADN
El ADN genómico total se extrajo respectivamente del apartado tejido canceroso, tejido canceroso primario y el tejido normal distante utilizando el método de fenol /cloroformo estándar. Los genomas completos del ADN mitocondrial se amplificaron y secuenciaron como se describe plenamente en nuestros estudios anteriores [19], [20], [21], [22]. Los datos de secuenciación se editaron y se alinean mediante el uso del software DNASTAR (DNAStar Inc., Madison, Wisc.), y las mutaciones se puntuaron con respecto a la secuencia revisada Cambridge referencia (rCRS) [45]. El estado de cada filogenético ADNmt se determinó de acuerdo con la filogenia reconstruida Asia oriental ADNmt [20], [46], y sus relaciones se ilustra por medio de un árbol filogenético esquemática (Figura 1).
Control de calidad
Para evitar posibles problemas y errores observados en los estudios de enfermedades de ADNmt publicados [18], [47], [48], [49], un procedimiento de control de calidad estricto [19], [20], [21 ] se utilizó en el curso de la manipulación de la muestra y la generación de datos. Además, para evitar totalmente la recombinación artificial provocada por confusión de muestras o la contaminación [18], [50], cada muestra de tejido fue amplificado y secuenciado de forma individual como lo hemos hecho anteriormente [22].
Determinación de heteroplasmia por DHPLC
Para la mutación heteroplasmic observado durante la secuenciación directa del ADN, que confirmó además que mediante la desnaturalización de cromatografía líquida de alto rendimiento (DHPLC) (Figura 2).
información de apoyo sobre Table S1. mutaciones somáticas ADNmt
identificadas en 20 pacientes colorrectales
doi: 10.1371 /journal.pone.0021613.s001 gratis (DOC)
Tabla S2.
La comparación de la frecuencia de individuos con mutaciones de ADNmt heteroplasmic en población normal y en pacientes con cáncer
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021613.s002 gratis (DOC) guía
Agradecimientos
Agradecemos a todos los participantes en esta investigación. También nos gustaría reconocer Shi Fang Wu y Chun-Ling Zhu por su ayuda en los experimentos. Agradecemos a los revisores anónimos por sus útiles comentarios sobre la versión anterior del manuscrito.