Extracto
mal pronóstico del carcinoma hepatocelular (HCC) asociado con un diagnóstico tardío hace necesario el desarrollo de biomarcadores de diagnóstico precoz. Hemos delineado previamente el paisaje de la metilación del ADN en pacientes con HCC que pongan de relieve la importancia del promotor hipometilación en la activación de cáncer- y los genes de metástasis de conducción. El objetivo del presente estudio fue probar la viabilidad de que los genes que están en el CHC hypomethylated podrían servir como marcadores de diagnóstico candidatos. Utilizamos el análisis de fusión de alta resolución (HRM) como un simple método basado en PCR traducible para definir estados de metilación en muestras clínicas. Probamos siete regiones seleccionadas de la lista de genes hypomethylated en el CHC y demostramos que el análisis de gestión de recursos humanos de varias de ellas se distingue estados de metilación en muestras de cáncer de hígado a partir de hígado normal adyacente y la hepatitis crónica en el área de Shanghai. Estas regiones fueron identificadas dentro de los promotores de la membrana neuronal glicoproteína M6-B (GPM6B) y los genes de la familia A12 antígeno de melanoma (MAGEA12). Las diferencias en la gestión de recursos humanos en la inmunoglobulina superfamilia de receptores Fc (FCRL1) separados tumores invasivos de HCC menos invasiva. Los biomarcadores identificados diferenciadas HCC de la hepatitis crónica en otro conjunto de muestras de Dacca. Aunque el empuje principal en el diagnóstico de metilación del ADN en el cáncer está en genes hypermethylated, nuestro estudio por primera vez ilustra el uso potencial de genes hypomethylated como marcadores de tumores sólidos. Después de una validación adicional en una cohorte más amplia, el ADN identificado hypomethylated regiones pueden llegar a ser importantes biomarcadores candidatos para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de hígado, especialmente en poblaciones con alto riesgo de desarrollar HCC
Visto:. Stefanska B, Bouzelmat A, Huang J, Suderman M, Hallett M, Han ZG, et al. (2013) El descubrimiento y validación de ADN Hipometilación biomarcadores para el cáncer de hígado utilizando sondas de GRH-específico. PLoS ONE 8 (8): e68439. doi: 10.1371 /journal.pone.0068439
Editor: William B. Coleman, Universidad de Carolina del Norte Facultad de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Marzo, 2013; Aceptado: 29-may de 2013; Publicado: 7 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Stefanska et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por becas de Ministerio de Desarrollo Económica, de l'Innovación y de la Exportación programa (MDEIE) del gobierno de Quebec (N ° 215004, a MS), el Instituto canadiense de Investigación en Salud (RP-Nº 42411, a MS) y el Centro Internacional para la Investigación de Enfermedades diarreicas, Bangladesh (ICDDR, b). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las aberraciones en las modificaciones epigenéticas, en particular en los patrones de metilación del ADN, se han relacionado con el desarrollo y progresión del cáncer en muchos estudios en las últimas décadas [1], [2], [3]. La hipermetilación de genes supresores de tumor vinculado con el silenciamiento transcripcional, desmetilación del ADN global asociado con reordenamientos del genoma y la inestabilidad, y recientemente reportado promotor hipometilación ligada a la activación de oncogenes y genes prometastatic son características de casi todos los tipos de cáncer [2], [3], [ ,,,0],4], [5]. la hipermetilación del ADN de los genes supresores de tumores se ha demostrado que tiene potencial diagnóstico en varios tipos de cáncer [6], [7], [8], sin embargo, nuestra reciente desciframiento del amplio alcance de la hipometilación en el cáncer de hígado sugirió que los biomarcadores potenciales podrían encontrarse en hypomethylated genes que juegan un papel crítico en la conducción de cáncer y metástasis del cáncer [4]. La identificación de biomarcadores fiables de HCC es de particular importancia ya que la aparición tardía de los síntomas clínicos da cuenta de un diagnóstico tardío y la alta tasa de mortalidad. Se estima que la detección temprana del CHC aumenta la tasa de curación del 5% al 80% [9].
previamente utilizó un enfoque de todo el genoma para delinear los perfiles de metilación del promotor del ADN en los tumores de HCC y revelado cerca de 2.000 genes cuya promotores se hypomethylated en los tumores en comparación con el tejido normal adyacente emparejado [4]. Estos genes estaban implicados en los procesos biológicos y las vías cruciales para el desarrollo del cáncer y la invasión, lo que apunta a un importante papel funcional de las alteraciones observadas. Hipometilación se observó en varias familias de genes a través de los cromosomas. Se planteó la cuestión de si se va a marcar específicamente tumores y diferenciar muestras de tumores de tejido sano. En nuestro trabajo anterior, nos centramos en la comparación entre las diferencias en la metilación del ADN promedio en toda el promotor y los cambios anti-correlacionados en la expresión génica. Se analizaron en detalle 230 genes que fueron inducidos hypomethylated y en los tumores de HCC. La mayoría de estos genes cayó en una categoría de promotores con alto contenido de CpG. En el presente estudio sobre los biomarcadores hipometilación del ADN para el cáncer de hígado, se seleccionaron primero los genes que fueron fuertemente hypomethylated en muestras de HCC, en comparación con el tejido normal adyacente emparejado (modificar ≥2 veces en la metilación del promotor basado en el análisis de microarrays,
P
& lt; 10E-4). A continuación, este grupo de genes que se proyectó para la sonda más hypomethylated consistentemente (región de 200-400 pb, ≥1.5 veces el cambio,
P Hotel & lt; 10E-3) en todos los pacientes según lo determinado por el análisis de microarrays. Con el fin de aumentar la relevancia funcional de biomarcadores potenciales, nos limitamos posteriormente esta lista de 47 genes que fueron inducidos en los tumores de HCC como se mide por los vectores Affymetrix (modificar ≥1.5 veces,
P Hotel & lt; 0,05, Tabla S1 ). Teniendo en cuenta los cambios en la metilación del promotor, la expresión y el grado de desmetilación de las sondas específicas, hemos elegido siete genes que demostraron la mayor hipometilación promotor, las sondas más hypomethylated a través de los pacientes y de alta inducción de la expresión. Además, hemos limitado la lista de genes con funciones relacionadas con el cáncer en base a conjuntos de datos disponibles públicamente como se detalla a continuación. Se seleccionaron estos siete genes hypomethylated como se enumeran en la Tabla 1 para identificar y optimizar las sondas específicas cuya metilación diferencial sería diferenciar tumores de tejidos normales usando análisis de alta resolución de fusión (GRH). El análisis HRM es un simple método basado en PCR puede trasladarse fácilmente al entorno clínico para la detección de diferencias en los patrones de metilación del ADN [10]. Este método requiere el tratamiento del ADN con bisulfito que convierte los residuos de citosina en uracilo dejar residuos 5-metilcitosina no afectado. Después de la amplificación, resulta en cambios en la secuencia de ADN en uracilo se convierte a timidina y 5-metilcitosinas permanecen como citosinas. amplicón de ADN no metilado que contiene timidina en lugar de citosina dentro de las secuencias CpG exhibe diferentes propiedades de fusión que el ADN metilado. Tras la optimización de imprimación, tres sondas correspondientes a tres genes
la membrana neuronal GLICOPROTEÍNA M6-B Opiniones (
GPM6B
),
antígeno de melanoma FAMILIA A 12 gratis (
MAGEA12
) y
superfamilia de inmunoglobulinas receptor Fc gratis (
FCRL1
), se encontró que diferenciar HCC a partir de tejido normal adyacente y /o tumores invasivos de los tumores no invasivos en un conjunto de muestras como china así como HCC de la infección por hepatitis B crónica (CHB) en muestras procedentes de Bangladesh.
GPM6B
está implicado en el desarrollo y la regulación de la formación de hueso [11] neuronal, [12]. La expresión de este gen se muestra en la genoma amplia de perfiles de transcriptoma para servir como un predictor de tumores cerebrales [13], [14] y las leucemias linfoides [15]. Alta expresión de
MAGEA12
, un miembro de oncogénico
MAGE
familia, ha demostrado estar asociado con carcinoma de vejiga [16], el melanoma [17], el cáncer de mama [18] y oral de células escamosas carcinoma [19].
FCRL1
es una proteína de membrana de la superficie celular expresado preferentemente en las células B que regulan la activación de células B y la diferenciación [20]. Se observó alta expresión de este gen en los melanomas metastásicos [21] y en diferentes tipos de leucemias [20]. Ninguno de estos genes o de su estado de metilación fue previamente vinculado a HCC.
MAGEA12
se mostró antes de ser reprimidos en las células normales de la metilación del promotor y activa en las células cancerosas por desmetilación [22], [23], mientras que el papel de
GPM6B
y
FCRL1
metilación en la actividad promotora no ha sido probado con anterioridad. Nuestro presente estudio valida por primera vez la sobreexpresión de
GPM6B
,
MAGEA12
y
FCRL1 Hoteles en pacientes con CHC en relación con el tejido normal e investiga la metilación del ADN dentro de sus promotores como un potencial marcador de diagnóstico de cáncer de hígado. Dado que el diagnóstico precoz de HCC aumenta la tasa de curación y supervivencia, los biomarcadores candidatos identificados epigenéticos podrían tener un impacto en el resultado de la terapia del cáncer de hígado después de la validación en una cohorte más amplia.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por el Comité de Ética de las instituciones interesadas en ella, y (chino Centro Nacional del Genoma humano en Shanghai, china y Bangabandhu Sheikh Mujib Medical University (BSMMU), Dacca, Bangladesh) aprobó el estudio .
pacientes y muestras de tejidos
muestras de tejidos adyacentes normales y cancerosos se obtuvieron de 12 pacientes con HCC y 1 paciente con seudotumor inflamatorio (paciente del grupo control) en chino Nacional Centro de Genoma humano en Shanghai, china (Dr. Ze-Guang Han) (Tabla 2). Bangladesh cohorte consistió en 4 pacientes con HCC y 4 pacientes con HBC en Bangabandhu Sheikh Mujib Medical University (BSMMU), Dacca, Bangladesh (Tabla 2). Las muestras se obtuvieron a HCC ecografía guiada aspiración con aguja fina, mientras que las muestras se obtuvieron a CHB-cutánea por biopsia hepática utilizando aguja de biopsia de corte Tru. En ambos casos se utilizó anestesia local.
aislamiento del ADN y el tratamiento con bisulfito del ADN
ADN
a partir de muestras cancerosas, normales adyacentes, y CHB fue aislado utilizando la técnica estándar de extracción con fenol-cloroformo. conversión de bisulfito se realizó como se describe anteriormente [24]. Brevemente, 2 g de ADN se linealizó con EcoRI y se incubaron durante 3 horas a 37 ° C seguido de purificación utilizando el kit de purificación de limpieza rápida PCR (GenScript) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN purificado se desnaturalizó con NaOH 3 M y se incubó durante 15 minutos a 37 ° C. Recién preparada de bisulfito de sodio 3,6 M /1 mezcla de hidroquinona mM (pH 5,0) se añadió a ADN desnaturalizado y se incubaron durante 2 minutos a 95 ° C y luego 8 horas a 55 ° C seguido de 2 minutos a 95 ° C y 2 horas a 55 DO. Las muestras de ADN fueron luego desalada y purificada (kit de purificación de PCR rápida Clean, GenScript). El ADN purificado fue desnaturalizado de nuevo con NaOH 3 M y se incubó durante 15 minutos a 37 ° C. La solución se neutralizó mediante la adición de acetato de amonio a una concentración final de 10 M y el ADN se precipitó con 95% de etanol y el sedimento se resuspendió en 50 l de agua destilada.
amplificación por PCR de ADN de bisulfito convertida
Las reacciones de amplificación contenían 25 g de ADN genómico tratado con bisulfito, 0,4 M de avance y retroceso cebadores listados en la Tabla S2, 10 l de 10 × Light Cycler 480 SybrGreen I Master (Roche) en un volumen final de 20 l. La amplificación se realizó en un termociclador con las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, la amplificación durante 40 ciclos a 95 ° C durante 1 min, temperatura de hibridación de 2 min 30 s, 72 ° C durante 1 min, y extensión final a 72 ° C durante 5 min. Como se muestra en la Tabla S2, se utilizaron externos y anidados conjuntos de cebadores para varias sondas con el fin de mejorar la eficiencia de la amplificación. Después, el ADN amplificado se somete a la fusión de alta resolución (HRM).
análisis de fusión de alta resolución (HRM)
El ADN amplificado fue transferido a la Light Cycler 480 QPCR instrumento (Roche) que permite gestión de recursos humanos. Las muestras se calentaron gradualmente a partir de 40 ° C durante 1 min a 60 ° C durante 15 s y finalmente se fundió el ADN a 95 ° C durante 15 s. La fusión del producto de PCR induce una disminución de la fluorescencia de SybrGreen desde SybrGreen como un colorante intercalante de ADN está siendo liberado a partir de ADN de doble cadena después de la disociación. La señal de fluorescencia se adquiere durante la fase de fusión y se analizó mediante el software Light Cycler 480. La temperatura de un pico de fusión de amplicón de ADN se define por el punto medio de la fase de fusión en que la velocidad de los cambios en la fluorescencia es la más grande. Este punto de fusión depende de la secuencia y la longitud del amplicón y es específica para cada producto. Como siguiente ADN metilado conversión de bisulfito después de la amplificación contiene pares de bases CG, la temperatura de fusión de una versión no metilado que contiene pares de bases de AT es diferente. El amplicón metilado se funde a una temperatura más alta que cuando no metilado y muestras de diferente estado de metilación se puede separar mediante la comparación de los picos de la curva de fusión. Utilizando el 0% y el ADN metilado de control 100%, se demostró que las sondas probados revelan claras diferencias entre el ADN metilado y completamente metilado. 0% de control metilado se generó usando toda kit de amplificación del genoma (Sigma), mientras que el control 100% fue creado por
reacción de metilación in vitro
catalizada por LICE metiltransferasa en presencia de un donante de metilo S-adenosil-L-metionina ( SAM). Melting picos de curva en los tumores de HCC se compararon con la media de los picos de fusión en los tejidos adyacentes normales a partir de 7 individuos con HCC no invasiva. Esta curva promedio fue llamado aquí como referencia normal adyacente (NorAdjRef).
pirosecuenciación
bisulfito específico convierte secuencias promotoras fueron amplificados con Taq ADN polimerasa HotStar (Qiagen) usando cebadores biotinilados que figuran en la Tabla S2. Las hebras de ADN biotinilados se pyrosequenced en el instrumento PyroMarkTMQ24 (Biotage, Qiagen) como se describe anteriormente [25]. Los datos fueron analizados utilizando el software PyroMarkTMQ24.
extracción de RNA y Cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)
El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 1 g de ARN total servida como una plantilla para la síntesis de cDNA utilizando 20 U de transcriptasa inversa AMV (Roche Diagnostics), tal como se recomienda por el fabricante. La reacción QPCR se llevó a cabo en Light Cycler 480 de la máquina (Roche) usando 2 l de cDNA, 400 nM de avance y retroceso cebadores listados en la Tabla S2 y 10 l de Light Cycler 480 SybrGreen I Master (Roche) en un volumen final de 20 l . La amplificación se realizó usando las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, la amplificación durante 60 ciclos a 95 ° C durante 10 s, temperatura de hibridación durante 10 s, 72 ° C durante 10 s, y extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. La cuantificación se realizó utilizando una curva estándar y se analizó mediante el software Roche LightCycler 480.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando no pareada de dos caras
t-test o Mann
-Whitney
T
prueba. El Mann-Whitney
se utilizó la prueba U
para las comparaciones entre los dos grupos en los tamaños de las muestras eran pequeños y era, por tanto, difíciles de verificar hipótesis de distribución. En cada caso, la prueba se acompaña de un gráfico de dispersión que muestra todos los valores utilizados en la prueba. Los valores medios se dan ± S. D. Cuando sea necesario,
P
-valores son ajustados para múltiples pruebas utilizando la corrección de Bonferroni. Para las comparaciones de cuatro contra cuatro muestras (cohortes) de Bangladesh, que también se utiliza una permutación de prueba, donde los datos se barajan 10.000 veces y la estadística de prueba se volvió a calcular para cada aleatoria. El entorno de software de R estadística se utilizó para todos los análisis estadísticos, excepto la prueba de permutación, donde las estadísticas de remuestreo complemento para Excel software se utilizó (Stan en blanco, Charles Seiter, Peter Bruce y remuestreo Stats, Inc. 2000, el Instituto de Estadística educación, EE.UU.).
resultados
Pruebas e identificación del candidato hypomethylated regiones en el CHC mediante análisis de HRM
El objetivo de nuestro estudio fue identificar y optimizar las regiones hypomethylated en el CHC que podría diferenciar HCC del tejido normal usando gestión de recursos humanos. Se aplicaron varios criterios que predijimos que aumentará la probabilidad de que las sondas están ubicuamente diferencialmente metiladas en HCC. En primer lugar, se seleccionaron siete genes (que se enumeran en la Tabla 1) que fueron identificados en nuestra pantalla anterior de los genes en el cáncer de hígado hypomethylated mediante inmunoprecipitación metilada de ADN (MeDIP) y la hibridación de todo el genoma arrays de oligonucleótidos promotor. En segundo lugar, los promotores de genes contenían sondas con una reducción media veces en la metilación entre HCC y hepática normal mayor que o igual 2 y fueron estadísticamente muy significativa (
P
& lt; 10E-4). En tercer lugar, la hipometilación de sus promotores también se asoció con la sobreexpresión en casi todos los pacientes que fueron estudiados sugiere robustez y la relevancia funcional de estos cambios desmetilación del ADN en HCC (Figura 1A-C). En cuarto lugar, el análisis de sus funciones basa en conjuntos de datos disponibles públicamente, tales como ontología de genes (GO), KEGG, y NCBI revela procesos y vías biológicas que son cruciales para la carcinogénesis como la regulación del ciclo celular, la adhesión celular, la señalización célula-célula, la proliferación y la diferenciación (Tabla 1). En quinto lugar, los genes se asociaron previamente con los cánceres humanos, en particular
MAGEA12
[16], [17], [18], [19] sin embargo, sólo
DISCOS GRANDE (Drosophila) asociada a la proteína 5 gratis (
DLGAP5
) y
MATRIX metalopeptidasa 1 gratis (
MMP1
) han sido previamente informado de que hasta reguladas en los tumores de HCC [26], [27] . En sexto lugar, a partir de datos de microarrays de expresión disponibles públicamente (Oncomine), se demuestra que tres de los genes que contenían las sondas optimizadas para el análisis de gestión de recursos humanos (véase el párrafo siguiente) muestran una mayor expresión en muchos diferentes tipos de cáncer, como la leucemia, cáncer de ovario y cáncer de páncreas (
GPM6B
y
FCRL1
), cáncer colorrectal y renal (
GPM6B
y
MAGEA12
), HCC y el cáncer de mama (
MAGEA12 Opiniones y
FCRL1
), cáncer testicular y el melanoma (sobreexpresión significativa de
GPM6B Hoteles en ambos tipos de cáncer y
MAGEA12
en el melanoma) (Figura 1D-F). Los datos son consistentes con una función general de estas proteínas en muchos tipos diferentes de cáncer y sugieren su papel fundamental en la progresión del cáncer y /o metástasis.
(A) Un registro de mapa de calor que muestra
2 de metilación diferencial ( M) y la sonda de expresión (e) para las intensidades indicadas siete genes en muestras de pacientes con HCC cada medida por microarrays. (B, C) Los diagramas de caja de estas diferencias de metilación (B) y la expresión (C) en pacientes con HCC (log
2 [cáncer de lo normal]). diferencias de metilación negativos indican hipometilación en HCC y diferencias de expresión positivos reflejan la mayor expresión en las muestras de tumor en comparación con el tejido normal adyacente emparejado. (D, E, F) los niveles de expresión de genes del cáncer obtenidas a partir de los datos de microarrays para
GPM6B gratis (D),
MAGEA12 gratis (E), y
FCRL1 gratis (F). El normales frente a los datos de expresión de genes del tumor se obtuvieron de Oncomine y se presentan como la mediana de registro
2 transformado centrado por matriz, y SD-normalizado a 1 por matriz. Todos los cambios que se presentan son estadísticamente significativas (
P Hotel & lt; 0,05), excepto
MAGEA12
en el cáncer testicular y
FCRL1
en el cáncer testicular y el melanoma. (G, H, I) Curvas de fusión y los picos de la curva de fusión para el 0% y el 100% de control de ADN metilado amplificada por
GPM6B gratis (G),
MAGEA12 gratis (H) y
FCRL1 gratis (I) junto con un mapa de los promotores de los genes de la prueba que flanquean las sondas seleccionadas para el análisis de gestión de recursos humanos. Las flechas horizontales indican la posición de los cebadores utilizados para la gestión de recursos humanos. se muestran HRM para el 0% y el ADN metilado de control de 100%. sitios CpG que se encuentran dentro de la sonda amplificada están rodeados y numeradas. El factor de transcripción putativo sitios de unión se indican como se predijo por TransFac.
Tres sondas correspondientes a
GPM6B
,
MAGEA12
, y
FCRL1
optimizado para el análisis de la metilación diferencial de gestión de recursos humanos en el CHC
Varios conjuntos de iniciadores de metilación independiente fueron sometidos a análisis de optimización de gestión de recursos humanos (ver secuencias de los cebadores de la Tabla S2). ADN control que fue metilado en 0% y 100% (normas) se amplificó con los cebadores y se derretía en tiempo real. El patrón de fusión de los amplicones se estableció y se analizó. Las curvas de fusión de ambas normas se representaron en el mismo gráfico y exhibieron diferentes temperaturas de los picos de fusión (Figura 1G-H). a continuación, hemos examinado 12 HCC y 12 muestras normales del hígado de la cohorte de Shanghai para el estado de metilación dentro de los 7 sondas utilizando cebadores diseñados. Cuatro sondas mostraron una alta heterogeneidad del patrón de metilación en los tumores, lo que se reflejó en múltiples picos de fusión en el análisis de gestión de recursos humanos para una sola muestra. Otros tres sondas para
GPM6B
,
MAGEA12
, y
FCRL1
mostraron un patrón de fusión de un pico claro y se utilizaron para los análisis adicionales como marcadores de metilación de ADN candidato. La sobreexpresión de estos genes se muestra en otros tipos de cáncer, por ejemplo mayor expresión de
GPM6B
se asoció con tumores cerebrales [13], [14] como las leucemias linfoides [15],
MAGEA12
fue hasta -regulated en el carcinoma de vejiga [16], el melanoma [17], el cáncer de mama [18] y el carcinoma oral de células escamosas [19], mientras que
FCRL1
inducción se observó en los melanomas metastásicos [21] y en diferentes tipos de leucemias [20].
patrón diferencial gestión de recursos humanos de los amplificados en
GPM6B
,
MAGEA12
, y
FCRL1
distingue CHC de hígado normal
HRM de tumores (n = 12) y los tejidos normales adyacentes (n = 12). Las curvas de fusión se representaron gráficamente y se calculó la temperatura de un pico de fusión como se describe en los métodos. A medida que el amplicón de ADN metilado se funde a una temperatura más alta que amplicones de bisulfito no metilado convierten ADN, muestras de diferentes estados de metilación se pueden diferenciar mediante la comparación de los picos de la curva de fusión. Es una práctica común para comparar los tumores con tejido adyacente patológicamente normal del mismo paciente. Sin embargo, puede dar lugar a resultados falsos negativos desde la llamada normal del hígado puede ser transformado ya molecularmente y se muestra patrones de metilación del ADN alteradas sin exhibir cambios en histopatología, especialmente en pacientes con tumores altamente invasivos. Cinco pacientes del grupo de muestras fueron diagnosticados con HCC invasivo en el que se detectó un trombo tumoral de la vena porta (PVTT). Asumimos que el hígado normal adyacente se puede ya ha cambiado en estos pacientes. Por lo tanto, hemos creado una curva de referencia normal (NorAdjRef) promediando las curvas de fusión para todos los tejidos normales adyacentes excluidos los pacientes con PVTT. Sugerimos que una curva de dicha referencia podría mejorarse aún más mediante la inclusión de los resultados de gestión de recursos humanos de una amplia muestra de tejido hepático no canceroso y ser utilizado como una norma general para la comparación de nuevos casos particularmente cuando se sospecha de invasión en el tejido adyacente. De hecho, la metilación de
GPM6B
sonda en la muestra de tumor de paciente 5 era la misma que en su tejido normal adyacente, sin embargo, era diferente de NorAdjRef confirmando el uso de una normal de promedio como un estándar para la comparación (Figura 2A , la Figura 3A). Los pacientes con 1-6 PVTT exhibieron el mismo estado de metilación dentro de
FCRL1
sonda cuando sus tumores se compararon con el tejido normal adyacente emparejado pero de nuevo los perfiles de gestión de recursos humanos eran diferentes de NorAdjRef (Figura 2C). De este modo, mediante el uso de un estándar normal de un promedio hemos sido capaces de llamar a estas muestras como HCC, lo que habría sido imposible si se utilizó el tejido adyacente como referencia.
(A-C) picos de la curva de fusión de
GPM6B gratis (A),
MAGEA12 gratis (B) y amplicones
FCRL1 gratis (C) en 12 muestras de tumores y tejidos normales adyacentes 12 emparejados. Los picos de HCC con PVTT (PVTT-HCC), HCC sin PVTT (no PVTT-HCC), y los sujetos pseudotumor se compararon con la media de los tejidos adyacentes normales de pacientes no-PVTT (NorAdjRef). En el segundo panel, los picos de fusión para muestras de tumores de pacientes con HCC con PVTT se representaron gráficamente junto con el promedio de los tejidos normales adyacentes emparejados de estos pacientes, mientras que el quinto panel muestra la media de HCC con PVTT y HCC sin PVTT en comparación con NorAdjRef. Los valores de temperatura de los picos en cada paciente fusión se muestran en los gráficos de dispersión y en la Tabla 3.
(A-C) de fusión de la curva de picos de
GPM6B gratis (A),
MAGEA12
(B) y
FCRL1
(C) amplicones en las muestras tumorales en comparación con el tejido normal adyacente emparejado del mismo paciente. (D) La pirosecuenciación de
GPM6B
región para el paciente 9 (CHC) y el paciente 13 (seudotumor). La región cubierta se solapa con la secuencia analizada en la gestión de recursos humanos.
Hemos optimizado tres regiones específicas de ADN de 150 pb que podrían diferenciar HCC a partir de tejido no transformado mediante gestión de recursos humanos. Una región dentro de
GPM6B
promotor se hypomethylated en los tumores de todos los pacientes en comparación con NorAdjRef (Figura 2A). Todos los tumores fueron claramente separados e identificados como HCC basado en los valores de temperatura de los picos de fusión (Tabla 3,
P
= 3.97E-5, ajustado
P
= 1.17E-4, Mann-Whitney
T
prueba). Los sujetos con HCC no invasivo (no PVTT) eran más hypomethylated comparación con los tumores invasivos como la diferencia en picos de fusión entre el cáncer y NorAdjRef indica. Por lo tanto, el amplicón puede diferenciar también HCC sin PVTT de HCC con PVTT, al menos en el pequeño número de casos examinados aquí (Tabla 3, Figura 2A-gráficos 3 y 5,
P = 0,03
, ajustado
P
= 0,06, Mann-Whitney
T
prueba). análisis de gestión de recursos humanos de una región dentro de
MAGEA12
promotor diferenciado HCC todo sin PVTT y 2 de cada 5 HCC con PVTT de NorAdjRef (Figura 2B, Figura 3B,
P
= 1.7E-4, ajustado
P
= 5.1e-4, Mann-Whitney
T
prueba). muestras tumorales de pacientes 5, 6 y 7 que fueron diagnosticados con PVTT mostraron el mismo nivel de metilación como su emparejado tejido adyacente normal (Figura 2B-carta 2, Figura 3B) y no se distinguían ya sea desde NorAdjRef (Figura 2B-gráfico de 1) . El valor de la temperatura de fusión máxima promedio para el HCC sin PVTT era inferior a la del promedio de HCC con PVTT indicando hipometilación dentro de
MAGEA12
sonda en tumores no invasivos (Tabla 3, Figura 2B-gráfico 5), aunque el cambio no fue estadísticamente significativo en nuestro conjunto de muestras (
P
= 0,64, Mann-Whitney
T
prueba). Gestión de recursos humanos para la
FCRL1
sonda de diferencia con HCC PVTT de NorAdjRef (
P
= 2.5E-3, ajustado
P
= 7.5E-3, de Mann-Whitney
T
prueba), pero no sin HCC PVTT de NorAdjRef (
P
= 0,11, Mann-Whitney
T
test) (Figura 2C-gráfico 1). El
FCRL1
sonda está en hypomethylated invasiva en comparación con los tumores no invasivos (Tabla 3, Figura 2C-gráfico de 5,
P
= 2.5E-3, ajustado
P
= 7.5E-3, de Mann-Whitney
T
prueba) y, además, distingue estos dos tipos de tumores. Curiosamente, a pesar de que muy bien diferenciar muestras HRM PVTT de NorAdjRef, no había ninguna diferencia relevante cuando comparamos
FCRL1
estado de metilación en cada muestra de tumor PVTT con el tejido normal adyacente emparejado del mismo paciente excepto paciente 7 (Tabla 3, Figura 2C-chart2, Figura 3C). Esto sugiere que los cambios de metilación del ADN se produjeron ya en el tejido adyacente en estos hígados. Paciente de 13 años que fue diagnosticado con seudotumor hígado no mostró diferencias en el perfil de fusión HRM con su propio tejido adyacente y NorAdjRef en las tres sondas (Tabla 3, Figura 2-gráfico de 4,
P Hotel & gt; 0,05). Se confirmó esta observación por pirosecuenciación de
GPM6B
región para el CHC sujetos 9 y seudotumor paciente como se muestra en la figura 3D.
En resumen, una combinación de estos tres sondas de gestión de recursos humanos optimizado diferenciaría Los tumores de los no tumores (utilizando
GPM6B
sonda y
MAGEA12 Hoteles en combinación con
GPM6B
) y el CHC con PVTT de no PVTT HCC (utilizando
FCRL1
sonda).
La validación de biomarcadores epigenéticos identificados en muestras de biopsia de Bangladesh de HCC y la hepatitis B crónica (HBC)
pacientes
La cuestión fundamental en el diagnóstico de HCC es la identificación precoz de la conversión a CHB HCC. Por ello, pregunta si las sondas identificadas podían distinguir entre CHC y CHB en un conjunto independiente de los sujetos. Hemos probado 4 sujetos con CHC y 4 sujetos con CHB (Tabla 2 para las características clínicas). La
GPM6B
sonda que diferenciarse todo HCC de NorAdjRef en el grupo de Shanghai de los pacientes también mostraron diferentes patrones de fusión en HCC y CHB excepto un paciente con HCC que se agrupan con CHB basado en la temperatura de fusión pico (Tabla 3, Figura 4A,
P = 0,028
, ajustado
P = 0,084
, Mann-Whitney
T
prueba;
P Hotel & lt; 0,0001, prueba de permutación) . estado de metilación dentro de
MAGEA12
sonda separada todos los casos de CHC de CHB como se indica por una menor temperatura de fusión (Tabla 3, Figura 4B,
P = 0,028
, ajustado
P = 0,084
, Mann-Whitney
T
prueba;
P = 0,02
, la permutación de prueba). En los pacientes con HCC, se observó claramente dos picos de fusión que indican dos poblaciones de células con
MAGEA12
nivel bajo y alto de metilación. Una sonda dentro de
FCRL1
se hypomethylated en todos los tumores en comparación con el promedio de todos los pacientes con HBC (Tabla 3, Figura 4C,
P = 0,028
, ajustado
P =
0,084, Mann-Whitney
T
prueba;
P Hotel & lt; 0,0001, prueba de permutación). Cuando se agruparon los valores máximos de temperatura de fusión para todas las muestras de HCC y todas las muestras normales y CHB adyacentes, valor de la mediana para cada sonda de prueba fue menor en cáncer que en hipometilación que indica la normalidad en el cáncer (Figura 4D). Las diferencias fueron estadísticamente muy significativa para
GPM6B
y
MAGEA12
sondas (
P Hotel & lt; 0,001, ajustado
P Hotel & lt; 0,003, Mann-Whitney
T
prueba), así como para
FCRL1
pero después de excluir las muestras de HCC sin PVTT (
P Hotel & lt; 0,01, ajustado
P Hotel & lt; 0,03 , Mann-Whitney
T
prueba). La expresión de los genes de la prueba, medida por QPCR en el grupo de Bangladesh fue en promedio más alta en el CHC que en los sujetos con HBC (ver Figura 4E para los valores exactos en todos los pacientes) con los cambios más relevantes observados para
FCRL1 gratis (Figura 4E,
P = 0,028
, ajustado
P = 0,084
, Mann-Whitney
T
prueba;.
P = 0,028
, prueba de permutación)
picos de la curva de fusión de
GPM6B (A)
,
MAGEA12 gratis (B) y amplicones
FCRL1 gratis (C) en 4 CHC y 4 pacientes con HBC desde Bangladesh.