Extracto
Fondo & amp; Objetivos
incidencia de cáncer colorrectal y las muertes se reducen en la detección y eliminación de la etapa inicial, la neoplasia tratable pero carecemos de biomarcadores sensibles tanto para el cáncer y los adenomas pre-invasiva comprobada. Los objetivos de este estudio fueron determinar si los adenomas y cánceres exhiben patrones característicos de expresión de biomarcadores y para explorar si un biomarcador (y validado) descubierto el tejido se expresa de forma diferente en el plasma de pacientes con adenomas colorrectales o cáncer.
Métodos
biomarcadores de ARN candidatos se identificaron por análisis de microarrays de oligonucleótidos de especímenes de cáncer colorrectal (222 normales, 29 adenoma, adenocarcinoma 161 y 50 colitis) y validados en una cohorte previamente no probados de 68 muestras colorrectales utilizando un oligonucleótido de diseño personalizado microarray. Un biomarcador validado,
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, fue ensayada mediante QRT-PCR sobre ARN extraído de plasma de 20 controles sanos-confirmado colonoscopia, 20 pacientes con adenoma, y 20 con cáncer.
Resultados
Genoma en todo el análisis descubrió reproducibles firmas de expresión génica, tanto para los adenomas y cánceres en comparación con los controles. 386/489 (79%) del adenoma y 439/529 (83%) de los biomarcadores de adenocarcinoma fueron validados en los tejidos independientes. También se identificaron genes expresados diferencialmente en los adenomas en comparación con el cáncer.
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se seleccionó para su posterior análisis basado en la regulación consistente en la neoplasia, estudios previos y su interés como un gen sin caracterizar. Plasma
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los niveles de ARN fueron significativamente mayores en los pacientes con cáncer, ya sea o adenoma (31/40) en comparación con los controles libres de neoplasia (6/20).
Conclusiones
neoplasia colorrectal exhibe patrones característicos de la expresión génica.
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se expresa diferencialmente en los tejidos neoplásicos y
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transcripciones son más abundantes en el plasma de pacientes con cáncer o adenoma o bien en comparación con los controles
Visto:. LaPointe LC, Pedersen SK, Dunne R, Brown GS, Pimlott L, Gaur S, et al. (2012) El descubrimiento y validación de biomarcadores moleculares para colorrectal adenomas y cáncer con una aplicación para análisis de sangre. PLoS ONE 7 (1): e29059. doi: 10.1371 /journal.pone.0029059
Editor: Libing Song, Sun Yat-sen Universidad del Centro del Cáncer, China
Recibido: 30 de mayo de 2011; Aceptado: noviembre 20, 2011; Publicado: 19 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 LaPointe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue co-financiado por la Universidad de Flinders de Australia del Sur y la Comunidad Científica y Industrial Research Organisation (CSIRO) de Australia. Drs. Dunne, Molloy y Brown son empleados por CSIRO. Estos proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. La financiación también fue proporcionada por Clínica Genómica Pty Ltd., una empresa involucrada en el descubrimiento y comercialización de biomarcadores para el cáncer colorrectal. Drs. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy y Thomas son empleados por Clínica Genómica Pty Ltd y el Prof. Young es un consultor pagado de la Clínica Genómica Pty Ltd. Así, el proveedor de fondos jugó un papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, y la preparación del manuscrito. La señora y el Dr. Pimlott Wattchow tienen nada que revelar
Conflicto de intereses:. Este trabajo fue cofinanciado por el Clinical Genómica Pty Ltd, una compañía involucrada en el descubrimiento y comercialización de biomarcadores para el cáncer colorrectal. Drs. LaPointe, Pedersen, Gaur, McEvoy y Thomas son empleados por Clínica Genómica Pty Ltd. Prof. Young es un consultor pagado de la Clínica Genómica Pty Ltd. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
el cáncer colorrectal es tratable si se detecta y eliminado en una etapa temprana, con un 95% de los pacientes que sobreviven más de cinco años [1]. Hay evidencia creciente de que la eliminación de lesiones colorrectales pre-invasivos, es decir, adenomas, por polipectomía disminuye la incidencia de, y la mortalidad por cáncer colorrectal [2] - [4]. En consecuencia, la prevención del cáncer colorrectal mediante la eliminación de los adenomas detectados mediante cribado se está convirtiendo cada vez destacó como un objetivo importante de la detección del cáncer colorrectal. pruebas de detección simples disponibles en la actualidad, sin embargo, no son óptimas para la detección de adenomas, aunque las pruebas de inmunoquímica fecal de globina han mejorado mucho en comparación con las pruebas anteriores [5] - [7]. los programas de cribado de población pueden ser mejorados si un análisis de sangre estaban disponibles conveniente que es sensible y específica tanto para las etapas más tempranas y tratables de cáncer colorrectal y también sensible para los adenomas pre-invasivas. Dicho ensayo facilitaría un enfoque racional de cribado ya que nos permite dirigir los recursos de colonoscopia a aquellos sujetos que tienen probabilidades de obtener mayor beneficio del procedimiento invasivo [8].
patrones de expresión génica están mostrando cada vez más prometedor para la identificación de biomarcadores candidatos para el cáncer colorrectal, pero estos candidatos a menudo carecen de la validación adecuada y hay pocos datos disponibles para los biomarcadores que también son sensibles para los adenomas. biomarcadores putativos resultantes de la investigación basada en el descubrimiento deben ser rigurosamente validados para que puedan ser clínicamente útil [9] - [12]. Validación, es decir, la hipótesis de que los biomarcadores candidatos son indicadores genuinos de un fenotipo, idealmente hace uso de una cohorte de pacientes que es clínicamente independiente de la cohorte de descubrimiento. Además, la correlación entre los patrones de expresión de genes en el tejido y la detección de biomarcadores en la sangre no ha sido bien definida.
Los objetivos de este estudio fueron determinar si los adenomas y cánceres exhiben patrones característicos de expresión de biomarcadores y para explorar si un tejido -discovered (y validado) biomarcador se expresa diferencialmente en el plasma de pacientes con adenomas colorrectales o cáncer. Se presta especial atención a los patrones de expresión adenoma adenoma como biomarcadores en gran parte han sido ignoradas en la literatura.
Perseguimos nuestro objetivo de descubrir biomarcadores sensibles para ambas adenomas colorrectales y el cáncer siguiendo una estrategia de tres fases de descubrimiento, validación y las pruebas de ensayo clínico. En primer lugar, se analizaron los datos de microarrays de expresión génica de alta dimensión para descubrir biomarcadores candidatos en ambos cánceres y adenomas de colon y recto. Para entonces validar la expresión de genes candidatos, una micromatriz de oligonucleótido de diseño personalizado ( "Adenoma biomarcador de Gene Chip") fue diseñado y fabricado para contener una amplia selección de marcadores hipotéticos encontrados durante la fase de descubrimiento, así como marcadores seleccionados de la literatura. biomarcadores candidatos fueron validados utilizando el gen de la viruta Adenoma de biomarcadores en un conjunto independiente de las muestras neoplásicas. Por último, la utilidad clínica potencial de un biomarcador neoplasia colorrectal validado tejido prometedor se midió en el ARN extraído a partir del plasma de pacientes con adenoma y con cáncer colorrectal y controles sanos-confirmado colonoscopia. Este proceso secuencial sigue las dos primeras etapas de una evaluación de cinco etapas de biomarcadores propuesto por Pepe et al [13].
Resultados
Neoplásicas vs no neoplásico transcriptoma
de 44,928 probesets analizadas para la expresión génica diferencia, observamos 11.183 (24,9%) probesets que se expresan diferencialmente en los tejidos neoplásicos relativos a los tejidos no neoplásicos incluyendo especímenes colíticos. Para la comparación, se observó 2.701 (6,0%) probesets igualmente expresados diferencialmente entre normal (n = 222) y la colitis (n = 42) extractos de tejidos (Tabla 1). Estos datos de expresión también se analizaron en el genoma de nivel completo usando análisis de componentes principales (PCA) (Figura 1). La mayor fuente de expresión cambio observado en estos 454 microarrays (como lo demuestra tanto el cambio medio de expresión y la trama PCA) se correlacionó con la presencia o ausencia de neoplasia. Este efecto fenotípico era independiente de la colitis si los tejidos no tumorales exhiben y también independiente de si los tejidos neoplásicos fueron adenomatosa o cancerosa
(A) Descubrimiento de microarrays conjunto de datos:. 222 normal, negro; 42 colitis /IBD, verde; 29 adenomas, azul; y 161 adenocarcinomas, rojo. (B) Validación de microarrays conjunto de datos: 30 normales, negro; 19 adenomas, azul; y 19 adenocarcinomas, rojo.
Mediante la introducción de un requisito para un doble cambio en la intensidad de la señal entre los tejidos neoplásicos y no neoplásicos, el número de probesets expresados diferencialmente se redujo de 11.183 a 446 (Tabla 1). Así, sólo el 4,0% de los expresados diferencialmente probesets (1,0% del total) probesets demostró al menos de dos veces el cambio de expresión. Curiosamente, mientras que el número de probesets que muestran una respuesta diferencial de cualquier magnitud fue aproximadamente igualmente dividido entre probesets con una mayor expresión en los tejidos neoplásicos (6,227; 55%) y probesets con una disminución de la expresión (4.956; 44%), después de aplicar los dos veces criterio el número de probesets bajo-expresados con disminución de la intensidad en los tejidos neoplásicos era mucho mayor que el número de probesets con una mayor intensidad, 338 (76%) frente a 108 (24%), respectivamente. Se observó la tendencia en tanto no neoplásico en comparación con adenoma y no neoplásicas en comparación con las comparaciones con cáncer. Por otra parte, la comparación de las muestras normales y la colitis mostró aproximadamente el mismo número de genes con mayores (60) y menores niveles (73) de expresión entre fenotipos. Entre adenoma y cáncer, sin embargo, hubo muchos más genes regulados (145) en el cáncer de frente hacia abajo reguladas (43). Un resumen de los cambios de expresión diferencial mediante el fenotipo se muestra en la Tabla 1 y una lista de genes validados arriba y hacia abajo-regulada en los cánceres en comparación con los adenomas se muestran en las Tablas S1 y S2, respectivamente.
Probesets que reveló diferencial la expresión entre neoplásicos (adenomas y cánceres) y tejidos no neoplásicos (normales y colitis) fueron asignadas a los símbolos de genes putativos utilizando los más recientes archivos de anotación de microarrays. 108 probesets elevados en los tejidos neoplásicos en por lo menos dos veces fueron asignadas a 97 símbolos de genes y 338 disminuyeron probesets fueron asignadas a 264 símbolos de genes (Tabla S3).
genes-fenotipo específico
La conjuntos de genes expresados diferencialmente fueron analizados utilizando un nuevo método de análisis desarrollado por nosotros para predecir las transcripciones que pueden expresarse en un fenotipo (por ejemplo, neoplasia), pero no en otro (por ejemplo controles sanos). Mediante la aplicación de esta metodología, 23 de las metas probeset fueron identificados como candidatos putativos para la expresión génica neoplásico específico, es decir, hipotéticamente conmutación de encendido en los tejidos neoplásicos, pero desconectado en los controles no neoplásicas. Además, se identificaron 35 genes como candidatos para la expresión en sólo tejidos no tumorales, es decir, conmutación de encendido en tejidos no tumorales, pero desconectado en los tejidos neoplásicos. Un ejemplo de un probeset que exhibe un patrón de respuesta neoplásica específica prototípico se muestra en la Figura 2A, y la lista completa de probesets correspondientes a-switched en hipotéticamente y genes-off encendido se muestra en las Tablas S4 y S5, respectivamente.
(A) conjunto de datos Descubrimiento, 222 normal, negro; 42 EII, verde; 29 adenomas, azul; 161 adenocarcinomas, rojo. (B) conjunto de datos de validación: 30 normales, negro; 19 adenomas, azul; 19 adenocarcinomas, rojo. Eje Y:. Probeset intensidad normalizada (log2) guía empresas
Custom "Adenoma biomarcador" chip genético
La trama PCA de los datos de descubrimiento (figura 1A) muestra una fuerte frente a la neoplasia segregación no neoplasia que implica los dos primeros ejes de componentes principales, con los adenomas y cáncer agrupados. Para los datos de validación (Figura 1B), el primer componente principal confirma que la mayor fuente de varianza a través de estos probesets es la presencia o ausencia de neoplasia. El segundo componente principal, sin embargo, muestra que los adenomas se agrupan por separado de las muestras de cáncer.
La validación de biomarcadores candidatos para la neoplasia colorrectal
De los 108 probesets cuyos objetivos se planteó la hipótesis de que superar las expresado por al menos dos veces en los tejidos neoplásicos descubrimiento, 103 probesets (95%) estaban elevados en los tejidos neoplásicos de validación (
P
≤0.05, MHT), y de éstos, 92 (85%) fueron elevados por al menos 2 veces. Del mismo modo, 297 de los 338 (87%) probeset objetivos hipotéticos estar bajo-se expresa en los tejidos neoplásicos también estaban bajo-expresados en los experimentos de validación (
P
≤0.05, MHT); en muestras neoplásicas, 247 (73%) de estos genes mostraron la mitad o menos de la expresión observada en los tejidos de control normales. resultados de la validación por el contrario fenotipo se muestran en la Tabla 2. Una lista de arriba y validados se muestra abajo reguladas en las Tablas probesets S6 y S7, respectivamente.
ensayo de PCR cuantitativa para medir los niveles de ARN de biomarcadores en tejidos o plasma
Uno de los más regulados diferencialmente probesets arriba, tanto en el descubrimiento (figura 3A) y validación (figura 3B) detectó transcripciones de
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, un gen de función desconocida. En el conjunto de datos de validación, probeset-1008852 HuGene_st (
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) se expresó más de 25 veces mayor en la neoplasia colorrectal en relación con los controles no neoplásicas (Tabla S6). Estos resultados confirman informes anteriores, que encontró que
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ARNm pueden ser un biomarcador candidato para adenoma colorrectal [14]. Sobre la base de nuestra observación repetida de expresión diferencial en los tejidos neoplásicos, la evidencia previa de la expresión regulada hasta en tanto adenomas y cánceres y el hecho interesante que
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no se ha caracterizado previamente en términos de estructura o función, eligió
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para poner a prueba la idea de que los patrones de expresión de tejido se pueden reflejar en la sangre. Para explorar más el potencial biomarcador de
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se diseñó un ensayo de PCR en tiempo real para la detección de transcritos de ARN derivados de este locus.
(A)
midió KIAA1199 expresión
a través de 212942_s_at probeset en el conjunto de datos de descubrimiento de 454 muestras de tejido colorrectal (eje x indexado por fenotipo); Norma: 222 especímenes normales, negro; EII: 42 especímenes '' colitis, verde; ADE: 29 adenomas, azul; CA: 161 especímenes de cáncer, rojo. Eje Y: intensidad probeset normalizada (log2). (B)
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expresión medido a través de probeset-1008852 HuGene_st en el conjunto de datos de validación en 68 muestras de tejido colorrectal. Eje X; Norma: 30 muestras de tejido normal de colon, negro; ADE: 19 adenomas, azul; CA: 19 muestras de cáncer colorrectal, de color rojo. Eje Y: intensidad probeset normalizada (log2). (C) Un cuantitativa en tiempo real SYBR verde
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ensayo de PCR aplica a los extractos de ARN utilizados para la validación de datos de microarrays: 30 normales, negro; 21 adenomas, azul; 20 cáncer colorrectal, las muestras de color rojo. Los datos son los valores medios de los duplicados, normalizados contra HPRT1 y representados como valores delta-delta-Ct. Tenga en cuenta que tres muestras neoplásicas adicionales estaban disponibles para los experimentos de PCR que no fueron probados por costumbre de microarrays.
En primer lugar, una PCR basada en SYBR verde en tiempo real para
se utilizó KIAA1199
para confirmar los datos de microarrays de tejidos de validación; los resultados fueron en buen acuerdo con los datos de microarrays para este gen (Fig 3C). A continuación, los niveles de transcripción
KIAA1199 gratis (y
GAPDH
control) se midieron en el ARN extraído de la fracción de plasma de 40 pacientes con neoplasia colorrectal (adenoma o adenocarcinoma) y 20 controles sanos (que tiene todas las categorías sido confirmado por los hallazgos patológicos clínicos) utilizando comercialmente disponibles ensayos TaqMan qPCR.
GAPDH
transcripciones de ARN se detecta en todas las 60 muestras de plasma analizadas (Figura 4A) y moderadamente más alta
GAPDH
niveles de ARN se observaron en las muestras de plasma de pacientes con diagnóstico de adenomas colorrectales o de cáncer en comparación con donantes sanos (no significativa, los valores de p & gt; 0,05). Mayores concentraciones de
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transcripciones de ARN se detectan en el plasma de pacientes con neoplasia colorrectal que en el plasma de los controles sanos (figura 4B).
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ARN se detectó en el plasma de 31 de los 40 (77,5%) pacientes con neoplasia colorrectal y en 6 de los 20 (30%) pacientes sin neoplasia.
(A )
GAPDH
y (B)
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los niveles de ARN en plasma de 20 sujetos sanos (negros) y de 20 pacientes con adenomas de colon (azul) y 20 pacientes con CRC (rojo). Los datos son los valores de Ct medias (por triplicado) normalizadas por las diferencias de rendimiento de extracción y representadas como diferencias factor de cambio con respecto a la mediana de expresión medido en los 20 sujetos normales. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Mann-Whitney de dos colas.
Discusión
Este estudio confirma que las transcripciones de ARNm colorrectales son expresados diferencialmente en ambos tejidos adenoma y cáncer respecto a los controles , con algunas transcripciones siendo hasta reguladas en la neoplasia, mientras que otros son las reguladas. Se confirmó que 103 de 108 (95%) Probesets descubierto que son hasta reguladas en la neoplasia se expresaron asimismo diferencialmente durante las pruebas de validación. 87% (297/338) de los probesets reguladas por los también fueron confirmados durante la prueba de validación. patrones de covarianza de todo el genoma mostraron que la presencia o ausencia de neoplasia correlacionado con la mayor fuente de variación en todos los probesests y todas las matrices de los datos de expresión (Figura 1A). Aproximadamente se expresa de forma diferente el 25% de los objetivos de 44,928 descubrimiento probeset entre el tejido neoplásico y los controles no neoplásicas. Todos los demás contrastes fenotipo resultaron en un menor número de probesets que muestran una respuesta diferencial. Estos resultados demuestran que el estado neoplásico tiene una influencia mayor sobre la expresión de genes que, por ejemplo, colitis o incluso la diferencia entre tejido de adenoma pre-invasivo y cáncer maligno
.
Nuestros resultados están de acuerdo con una tendencia comúnmente observado en el cáncer colorrectal investigación de la expresión de genes que muestra un mayor número de genes se ha reducido regulado en los tejidos adenoma y cáncer en comparación con los controles no neoplásicas [15]. Este patrón de expresión puede reflejar niveles de hipermetilación asociados con la oncogénesis [16] aumentado.
Por otra parte, este estudio revela que más genes parecen ser hasta reguladas en la transición de adenoma a adenocarcinoma (Tabla S1) . Esta observación podría reflejar una mayor complejidad histológica subyacente de cáncer en comparación con tejido de adenoma o, más interesante, puede demostrar una relación entre el aumento de número de genes expresados y la progresión a un fenotipo invasivo y la metástasis. El grupo más numeroso (14%) de los genes hasta reguladas en el cáncer en comparación con los adenomas son de la familia de colágeno, pero la lista también incluye cuatro especies diferentes de metaloproteinasas de matriz que sugieren una mayor actividad de los genes con potencial de invasión (Tabla S1).
Además, este estudio implicó el diseño de un microarray personalizado que contenía un conjunto de genes que muestran que adenomas pueden ser separados de muestras de cáncer en base a los patrones de expresión de genes (Fig 1B). Estos resultados apoyan el concepto de que no sólo es la neoplásica firma la expresión de genes conservados entre el descubrimiento y validación de datos, sino también el adenoma vs. firma la expresión cáncer se conserva la misma manera. No tenemos conocimiento de ningún estudio de la expresión génica anteriores que han demostrado la capacidad de distinguir entre la falta de neoplasia, neoplasia pre-invasiva y fenotipos invasivos. Esta selección de genes abre el camino para la identificación de biomarcadores de uso en la detección sensible y específica de los adenomas.
El segundo objetivo de este estudio fue explorar si biomarcadores candidatos seleccionados descubiertos en el tejido fueron detectables y expresados diferencialmente en el plasma de pacientes con adenomas o cáncer colorrectal en comparación con plasma de control no neoplásica. Este paso es crucial para el traslado de los resultados de tejido en los puntos finales clínicamente útiles. De lo contrario, el descubrimiento marcador debe comenzar en muestras clínicas de diagnóstico (por ejemplo, sangre) que plantean mayores desafíos de comenzar con tejido fresco congelado relativamente ricos en ARN. Este informe describe un ensayo qPCR prueba de concepto basado en plasma que mide las transcripciones de ARNm de
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, un gen de función desconocida que confirmamos que se expresa de forma diferente tanto en el tejido y plasma de pacientes con cáncer y adenoma.
Los biomarcadores de neoplasia colorrectal
Existe una literatura grande y creciente de genes relacionados con los experimentos de expresión colorrectal-[17], [18]. El estudio que aquí se presenta se extiende y mejora con respecto a ese cuerpo de trabajo. Un comparativamente gran meta-análisis realizado por Chan et al. de los estudios de descubrimiento de la expresión de genes relacionados con el 25 de cáncer colorrectal identificado cinco genes que ser regulados hasta en siete o más independientes, incluyendo análisis
TGFBI
,
IFITM1
,
MYC
,
SPARC
,
GDF15
[17]. Los cinco de estos genes fueron confirmados a ser hasta reguladas en nuestro estudio.
Pocos estudios abordan las diferencias de expresión entre los adenomas colorrectales y el tejido colorrectal normal. Galamb et al. microarrays utilizado para identificar un conjunto de tres genes (
KIAA1199
,
foxq1
, y
CA7
) que son expresados diferencialmente en los adenomas relación con los controles normales, así como una conjunto de cinco genes (
FVW
,
IL8
,
CHI3L1
,
S100A8
, y
GREM1
), que pudieran suponer una discriminación cáncer tejidos de los controles normales [19]. De estos genes, nuestro estudio encontró que
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,
foxq1
y
IL8
son expresados diferencialmente en los adenomas (y en los cánceres) en relación con los controles normales.
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El presente estudio confirma informes anteriores que
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exhibe un elevado nivel de expresión de ARNm en los adenomas precancerosos, una regulación que persiste en el tejido canceroso [14]. Este gen también fue uno de los mejores marcadores identificados por el laboratorio de Marra como un objetivo previamente desconocido de la expresión inducida por Wnt y un posible nuevo marcador biológico para la neoplasia colorrectal. Sabates-Bellver et al. demostrado que
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expresión en la mucosa normal se limitaba a las células en la parte inferior de las criptas intestinales, mientras que elevados
se observó KIAA1199
expresión en todos los adenomas que estudiaron.
el papel de
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no se conoce, pero la evidencia de Wnt-inducibilidad sugiere que este gen puede ser parte de la cascada de aguas abajo de Tcf /LEF genes transcripcionalmente activados que son comúnmente perturbados en la neoplasia gastrointestinal [14] . adenocarcinomas gástricos que expresan altos niveles de
¿Cuáles son KIAA1199 correlaciona con peor supervivencia de cinco años resultados relativos a aquellos pacientes con baja
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expresión [20]. las células de cáncer de colon tratados con selectivos de la ciclooxigenasa-2 inhibidores muestran bajaron
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expresión [21], mientras que los altos niveles de
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ARNm se correlacionan positivamente con la mortalidad celular en fibroblastos humanos [22].
Un análisis de sangre prueba de concepto para los adenomas
a pesar del rápido crecimiento de la base de datos de biomarcadores de cáncer putativo, pocos candidatos prometedores durante la investigación inicial descubrimiento sobreviven las pruebas de validación posterior con tejidos independientes. Una fracción aún más pequeña de candidatos continúan mostrando promesa cuando esos genes son seleccionados para el desarrollo de ensayos y pruebas clínicas. Hemos identificado cientos de biomarcadores de neoplasia colorrectal que han sobrevivido a la validación en muestras clínicas independientes. Por un biomarcador tejido neoplásico convincente,
KIAA1199
, también hemos probado un ensayo qPCR de un solo gen que se muestra prometedor en la discriminación entre muestras de plasma de pacientes con neoplasia colorrectal y de individuos sanos. Este gen, que era uno de los muchos genes "validados", fue elegido para estudio adicional basado en el rendimiento biomarcador informó aquí, informes previos que mostraron
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a ser elevado en la neoplasia colorrectal y porque la función biológica de esta gen es desconocida. Plasma
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niveles fueron elevados en los pacientes con adenomas o cáncer confirmado-colonoscopia en relación al control de plasma de individuos libres de neoplasia, a pesar de la aparente sensibilidad de este único marcador fue mayor para el cáncer que para los adenomas.
Como un biomarcador con el potencial para el diagnóstico en muestras de pacientes no invasivos,
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ahora debe ser considerado para su incorporación en el ARNm (y posiblemente por la) y ensayos investigado en estudios clínicos y de cribado de mayor tamaño. De particular interés será la relación de
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expresión de las distintas vías genéticas de la oncogénesis colorrectal, como la vía
Wnt
señalización, que son comúnmente perturbado en los cánceres colorrectales y adenomas.
colorrectal neoplasia exhibe patrones característicos de la expresión génica.
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se expresa diferencialmente en los tejidos neoplásicos y
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transcripciones son más abundantes en el plasma de pacientes con cáncer o adenoma o bien en comparación con los controles.
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y otros biomarcadores validados descritos aquí merecen una mayor evaluación como pruebas de detección basados en la sangre de la neoplasia colorrectal. Un desafío clave para esta nueva evaluación será abordar también sensibilidades relativas de una prueba para los adenomas y cánceres dada la prevalencia mucho mayor de adenomas colorrectales neoplásicas benignas en comparación con el carcinoma colorrectal neoplásica maligna.
Materiales y Métodos
Todos los microarrays de datos utilizados en este estudio se documentó en conformidad con las normas MIAME para experimentos de microarrays.
Data Discovery
colorrectales utilizados para el descubrimiento de biomarcadores se recogieron por GeneLogic Inc. (Gaithersburg, MD, EE.UU.) de pacientes que dieron su consentimiento por escrito de acuerdo con las normas éticas establecidas por una junta de revisión independiente compuesta de científicos y expertos en bioética que no eran empleados de gene Logic. Cada institución que suministra muestras de tejido para GeneLogic obtuvo el consentimiento informado de cada donante o, en su caso, de su representante autorizado, y se encontró con los requisitos de la Junta de Revisión Institucional relevante y todas las leyes aplicables, perfiles de expresión génica de datos medidos en 548 muestras de tejido colorrectal utilizando Affymetrix HGU133A & amp; HGU133B chips de genes (44,928 probesets combinados) (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.) y datos clínicos que se acompañan se adquirió de GeneLogic Inc. experimental y se les proporcionó descriptores clínicos para todos los archivos de datos de chip, además de archivado digital de imágenes de microscopía de preparaciones histológicas. Antes de llevar a cabo la investigación de descubrimiento utilizando estos datos, las rigurosas pruebas de control de calidad se aplicó a estos datos. Un total de 454 microarrays cumplía con los requisitos de control de calidad y fueron juzgados adecuado para esta investigación para el descubrimiento. Más detalles de los procedimientos de control de calidad aplicados a estos datos re proporcionan en apoyo del análisis de control de calidad de información S1. Descripción de los fenotipos de tejidos para estos datos de detección se muestra en la Tabla 3 con desglose fenotipo del cáncer en la Tabla 4.
patrones de expresión-fenotipo específico
Además de diferencial estándar análisis de la expresión, se introdujo una técnica analítica diseñada para filtrar candidatos probeset expresados diferencialmente en las transcripciones que fueron cualitativamente que la hipótesis de "vuelta-on" en una clase de fenotipo y cualitativamente "-off convertido" en un fenotipo de comparación. Para este método, la identificación de genes "off" se basa en la suposición de que relativamente simple mayoría de los genes en un tejido dado fueron
no
ha expresado constitutivamente por encima de un nominal relativamente bajo nivel de fondo. En consecuencia, un microarray diseñado para hibridar con el transcriptoma humano pleno, por lo tanto no debe exhibir transcripción específicos de unión para la mayoría de los probesets en un experimento dado. Por el contrario, la intensidad de fluorescencia de probesets que hibrida con el equilibrio de las transcripciones no expresado debe reflejar "no específica" hibridación probeset-transcripción. La suposición de que una gran fracción de los probesets para cualquier experimento dado no eran señales de transcripción específicos previstos medios para estimar una teórica de encendido /apagado umbral para genes en experimentos el genoma completo tal como se utiliza aquí para el descubrimiento. El nivel de expresión medio para todos los 44,928 probesets en los 454 microarrays de descubrimiento se clasificaron y el valor correspondiente a la probeset 30
º percentil través de los datos fue elegido como el umbral para el silencio transcripcional. Este umbral representa una estimación conservadora del límite superior de la expresión no específica o de fondo
Validación de datos:. Las muestras de tejido
muestras de tejido fresco congelado
Para todos los experimentos de validación (es decir, pruebas de hipótesis), recogidos de forma independiente se obtuvieron a partir de un banco de tejidos del hospital terciario de referencia (Centro Médico Flinders, Adelaide, Australia SA). Una descripción de casos utilizados para las pruebas de validación se muestra en la Tabla 3. Este estudio fue aprobado por el Comité de Investigación y Ética del Hospital General de repatriación y el Comité de Ética del Centro Médico Flinders. Escrito el consentimiento informado del paciente fue recibida para cada tejido estudiado. Las muestras quirúrgicas se recogieron y procesaron como se describe anteriormente [23]
Validación de datos:. microarrays de diseño personalizado
Para probar los muchos biomarcadores hipotéticos genes identificados por análisis de descubrimiento, un microarray de diseño personalizado, el "Adenoma de biomarcadores de gene Chip", se fabricó (Affymetrix). La matriz Adenoma biomarcador de genes viruta incluyó a todos los probesets HGU133-A /B identificados durante el descubrimiento, así como a nivel de probesets exón que no estaban disponibles en el momento del ejercicio de descubrimiento original. Cada probeset HGU133 descubrimiento en el adenoma de biomarcadores de Gene chip fue anotado a uno o más símbolos humanos de genes basados en herramientas de anotación NCBI (NCBI36 /HG18) y estos símbolos de genes fueron luego revertir mapea al exón a nivel de probesets diseñados por Affymetrix para el HuGene ST 1.0 GeneChip. La costumbre de microarrays incluido probesets "perfecta coincidencia" única
Validación de datos:. La extracción de RNA
Una avería fenotípica de los tejidos utilizados para las pruebas de validación se muestra en la Tabla 3. Se extrajo ARN de tejido congelado muestras utilizando Trizol (Invitrogen, San Diego EE.UU.) según lo recomendado por el fabricante. En pocas palabras, los tejidos congelados se homogeneizaron en 300 l de reactivo Trizol utilizando un taladro Dremel modificado y manos de mortero desechables estériles. 200 l de reactivo Trizol se añadieron al homogenado y las muestras se incubaron a temperatura ambiente (RT: 25C) durante 10 minutos. 100 l de (% v /v) y luego se añadió cloroformo, las muestras se agitaron durante 15 segundos, y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 minutos. La fase acuosa que contiene RNA total se obtuvo por centrifugación a 12.000 x g durante 15 min, 4 ° C. a continuación, el ARN se precipitó mediante la incubación de las muestras a temperatura ambiente durante 10 min con 250 l de isopropanol.