Extracto
Los mitótico Kinesin-5 proteínas motoras de reticulación y deslice husillo aparte antiparalela microtúbulos, realizando así las funciones esenciales en la dinámica del huso mitótico. La inhibición específica de su función por pequeñas moléculas monastrol-como se ha examinado en ensayos clínicos como tratamiento contra el cáncer, con sólo un éxito parcial. Por lo tanto, se requieren estrategias que mejoren la eficiencia de los medicamentos contra el cáncer monastrol similar. En el presente estudio, hemos examinado la relación entre la sensibilidad a la monastrol y la ocurrencia de deslizamiento mitótico en varias líneas celulares humanas. Se encontró que el grado de sensibilidad a la monastrol, desde los más sensibles a menos sensible, es: AGS & gt; HepG2 & gt; Lovo & gt; Du145≥HT29. Mostramos correlación entre la sensibilidad de una línea celular particular, a monastrol y la tendencia de la misma línea celular que someterse a deslizamiento mitótico. También se encontró que en las células HT29 resistentes monastrol, tratamientos prolongados monastrol aumentan los niveles de ARNm y de proteína de la proteína survivina pasajeros cromosómica. En contraste, los niveles de survivina no se incrementan por este tratamiento en las células AGS monastrol-sensible. Además, muestran que la sobre expresión de survivina en las células AGS monastrol sensible reduce el deslizamiento mitótico y aumenta la resistencia a monastrol. Finalmente, se muestra que durante la exposición corto para monastrol, Si el silenciamiento de ARN de la expresión de survivina reduce la viabilidad celular en ambos AGS y células HT29. Nuestros datos sugieren que la eficacia del tratamiento contra el cáncer con inhibidores específicos kinesin-5 se puede mejorar mediante la modulación de los niveles de expresión de survivina
Visto:. Asraf H, Avunie-Masala R, Hershfinkel M, Gheber L ( 2015) el deslizamiento mitótico y expresión de survivina están vinculados a la sensibilidad diferencial del cáncer humano líneas celulares a la Kinesin-5 inhibidor Monastrol. PLoS ONE 10 (6): e0129255. doi: 10.1371 /journal.pone.0129255
Editor Académico: Qiliang Cai, de la Universidad de Fudan, CHINA
Recibido: 16 de mayo de 2014; Aceptado: May 6, 2015; Publicado: June 2, 2015
Derechos de Autor © 2015 Asraf et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo de inicio, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Ben-Gurion del Negev, adjudicado a MH y LG; por la Fundación de Ciencias de Israel subvención 165/2013 adjudicatarios de LG (http://www.isf.org.il/english/) y la Fundación de Ciencias de Israel concesión no. 891/2014 adjudicado a MH (http://www.isf.org.il/english/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las proteínas mitótico Kinesin-5 motores (BimC /Kif11 /Eg5 /N-2) realizar funciones conservadas en la dinámica del huso mitótico. Descubierto en la década de 1990, estos fueron los primeros Kinesins para el que los roles de la mitosis se han demostrado en una serie de organismos [1-5]. Kinesin-5 motores función como homotetrámeros con dos pares de motor dominios catalíticos situados en lados opuestos de un complejo tetrámero de pesa como [6, 7]. Mediante esta estructura bipolar, Kinesin-5 motores pueden entrecruzar y deslice los microtúbulos del huso aparte antiparalelas [8-11], realizando así sus funciones en el conjunto del husillo [1-5] y la anafase huso elongación [12-19].
El humano kinesin-5 HsEg5 se sobreexpresa en una variedad de tumores sólidos, lo que sugiere su papel en la tumorigénesis [20, 21]. Debido a las funciones mitóticas esenciales de kinesin-5 motores en la dinámica del huso, y debido a la mitosis es una fase del ciclo celular se hace la intervención contra el cáncer [22, 23], en general se cree que la inhibición específica de Kinesin-5 motores podría servir como un tratamiento potencial contra el cáncer. Monastrol fue el primero informó inhibidor específico de la quinesina-5 humano, identificado en una pantalla para las pequeñas moléculas que causaron detención mitótica sin afectar la dinámica de microtúbulos y otras funciones celulares [24]. Desde el descubrimiento de monastrol, se informó de varias decenas de moléculas como inhibidores alostéricos de HsEg5, con potencias variables [23, 25]. La mayoría de estas moléculas son específicas para la HsEg5 humana ya que se unen a un sitio alostérico, el bucle 5 en el dominio catalítico de motores relacionado con la quinesina (revisado en [23, 26, 27]), que varía en longitud y secuencia entre los kinesin homólogos [28, 29]. Las células humanas tratadas con monastrol y monastrol-como detención moléculas en mitosis con husos monopolares dañados [24, 30] y someterse a la muerte celular mitótica [31]. En algunos casos monastrol células tratadas se encuentran en una fase G1-como debido al deslizamiento mitótico [32]. El último fenómeno permite a las células para proceder a la siguiente fase G1 sin dividir su ADN en la presencia de daño husillo (revisado en [33, 34]). Tras el deslizamiento mitótico, las células pueden morir de la apoptosis causada por un puesto de control específica que controla el contenido de ADN de las células que mitosis salida, conocido como el "punto de control tetraploidia" [33, 35].
han entrado varios inhibidores específicos HsEg5 ensayos clínicos como agentes contra el cáncer [36-38]. A pesar del efecto citotóxico reproducible en cultivos de tejidos, estos ensayos clínicos ha mostrado un éxito limitado (revisado en [27, 39]). Una de las razones propuestas para esta ineficiencia es un conocimiento incompleto de las vías de detención de la mitosis y, como resultado, la incapacidad para identificar los componentes moleculares que pueden ser objetivo además de kinesin-5 inhibidores para mejorar su eficacia en el tratamiento contra el cáncer [27, 39] .
para hacer frente a este problema, en el presente estudio se analizó la sensibilidad a monastrol y la ocurrencia de deslizamiento mitótico en varias líneas celulares humanas. Se encontró que existe una correlación entre la sensibilidad de una línea celular particular, a monastrol y la tendencia de la misma línea celular que someterse a deslizamiento mitótico. Además, examinó la expresión de survivina, una proteína de pasajeros cromosómica anti-apoptótica que se ha demostrado que tiene múltiples funciones mitóticas (revisado en [40-43]). Se encontró que el tratamiento con monastrol induce aumento en la expresión de survivina en células monastrol resistentes, pero no en células que son sensibles a monastrol. Consistentemente, se muestra que la sobreexpresión de survivina en las células sensibles a monastrol reduce el deslizamiento mitótico y el aumento de monastrol-resistencia. Finalmente, se muestra que el silenciamiento de la expresión de survivina parcial por Si ARN reduce la viabilidad celular después de la exposición a corto monastrol. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la inhibición combinada de HsEg5 y la modulación de la expresión de survivina puede mejorar la potencia de tratamiento contra el cáncer por los inhibidores de quinesina-5.
Materiales y Métodos
Cultivo celular, la viabilidad, la transfección, y el tratamiento monastrol
AGS y células LoVo se cultivaron en DMEM /F-12 (HAM) 1: 1, las células HT29 en DMEM, DU145 células en RPMI 1640 suplementado con 1% de piruvato sódico, y las células HepG2 en MEM medio de águila- Earle. Todos los medios se complementaron con suero de ternera fetal al 10%, 2 mM de L-glutamina, y 1% de solución de antibiótico-antimicótico que contiene 10 unidades /l de penicilina, 10 mg /l de estreptomicina y 1250 unidades /ml de nistatina. reactivos de medios se adquirieron de Beit Haemek, Israel. La viabilidad celular se examinó utilizando sodio 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) sal 2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT, Sigma, Israel), siguiendo un procedimiento estándar [44] o por tripán azul de ensayo [30]. Para los experimentos de viabilidad, hasta 3 días utilizando el ensayo de XTT, ~ 4x10
3 se sembraron células por pocillo en placas de 96 pocillos. Número de células en presencia de monastrol se normalizó al número de células en presencia de solamente DMSO. Para los experimentos utilizando 12 y 24h monastrol tratamiento, ~ 1.5x10
5 células por pocillo en placas de 24 pocillos. El tratamiento con monastrol se llevó a cabo 24 horas después de chapado, momento en el cual se logró un 70-80% de confluencia. Los plásmidos que expresan GFP-etiquetados survivina y el vector GFP solamente fueron un regalo del Dr. Darío C. Altieri [45]. Transfección de células se realizó usando el reactivo de transfección JetPEI (transfección Polyplus, Tal Ron, Israel). La transfección estable se logra mediante las células que crecen en medio que contiene G418 3 mg /ml (Sigma, Israel) durante varias semanas hasta 80% de las células contenía señal de fluorescencia GFP. Monastrol (Tocris, Reino Unido), las concentraciones se indican para cada experimento. Para la comparación entre AGS monastrol-sensibles y las células HT29 monastrol resistentes, se utilizaron diferentes concentraciones de monastrol para lograr fenotipos comparables: 100μM y 150μM de monastrol de células AGS y HT29, respectivamente. Sobre la base de la figura 1, baja concentración de monastrol habría dado lugar a la falta de efecto sobre las células HT29, mientras que la alta concentración de monastrol habría dado lugar a la muerte de las células AGS, cualquiera de los casos no permite el análisis del fenotipo. Los experimentos de control se realizaron en presencia de DMSO.
Las células de AGS, HepG2, Lovo39, Du145, y líneas de células HT29, indicada en la esquina inferior izquierda de cada panel, se incubaron durante un máximo de tres días con diferentes concentraciones de monastrol, indican a la derecha (0, 20, 50, 100, y 150μM). El número de células viables (% del control) se determinó mediante el ensayo de XTT para la actividad mitocondrial. Los puntos y las barras representan una media y SEM de 3-4 experimentos independientes. * P & lt; 0,05: el número de células viables después del tratamiento Du145 2 días con 20 o monastrol 50 micras, en comparación con las células HT29 viables idénticamente tratados (rojo y círculos azules). Los resultados indican que las diferentes líneas celulares son sensibles a monastrol manera diferente, con la clasificación de la sensibilidad: AGS & gt; HepG2 & gt; & gt Lovo; Du145≥HT29
La inmunotinción Para visualizar los microtúbulos del citoesqueleto. y el ADN, las células se cultivaron en cubreobjetos, se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 30 min, y se permeabilizaron durante 2 minutos con 0,3% Triton-X-100 en 4% de paraformaldehído. Las muestras se lavaron con PBS que contenía 0,1% de BSA (Sigma, Israel). Los cubreobjetos se incubaron con la rata YOL1 anti-tubulina /34 y luego con Alexa 488 anticuerpo secundario anti-rata conjugado. ADN fue manchado por DAPI (0,07 g /ml). Las células se observaron con un microscopio Olympus BX51.
Análisis del ciclo celular
flotante y las células adherentes se fijaron con etanol al 70% y se almacenan en -20 ° C durante al menos 7 días. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 0,1% Triton-X-100 y 30 mg /ml de RNasa A de tipo I-A (Sigma, Israel) a temperatura ambiente durante 40 min. El ADN nuclear se tiñó con 15 g de yoduro de propidio en solución y el ADN contenido en PBS se midió por citometría de flujo (BD Biosciences, UK). proporciones de células en sub-G0 /G1, G0 /G1, S, y G2 /M fases se analizaron usando el software apropiado. Para cada muestra, se obtuvieron 10.000 células.
Análisis de ARNm
Los niveles de ciclina B, survivina, y la actina como gen de referencia se determinaron por PCR en tiempo real (RT-PCR) de ARN total extraído de las células tratadas con monastrol. Extracción de ARN total se realizó con el RNeasy mini kit (Qiagen, Alemania), con el tratamiento con DNasa (Qiagen, Alemania) para asegurar la eliminación de ADN genómico. El molde de ADNc se preparó con 1 g de muestras de ARN, utilizando el Verso cDNA Synthesis Kit como se describe por el fabricante (Thermo Scientific). Para la PCR cuantitativa en tiempo real, las plantillas se diluyeron 1:16 y se sometieron a Taqman en tiempo real procedimiento de PCR utilizando el kit de Absolute Blue QPCR (Thermo Scientific). Los cebadores y las sondas (Solaris) para amplificación por PCR y el tamaño del producto eran como sigue: survivin (95 pb) cebador directo 5'-TTTCTCAAGGACCACCGCAT-3 ', cebador inverso 5'-ATGAAGCCAGCCTCGGCCAT-3', 5'-sonda CACCCCGGAGCGGATGG-3 '; Ciclina B (86 pb) cebador directo 5'-ATCTGAGACAACTTGAGGAAG-3 ', 5'-cebador inverso GATGGCTCTCATGTTTCCAG-3', 5'-sonda GGTCGGGAAGTCACTGG-3 '; Actina (134 pb) cebador directo 5'-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3 ', 5'-imprimación GGTCTCAAACATGATCTGG-3 inversa', 5'-sonda ACCGCGAGAAGATGACC-3 '. Las reacciones se llevaron a cabo en el detector de secuencia ABI-PRISM7500 (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Se utilizaron condiciones de ciclación estándar para este instrumento. La temperatura de hibridación fue 60 ° C para todos los genes. Para cada muestra, los niveles de ciclina B y survivina se normalizaron al gen de referencia (actina) niveles. En tiempo real PCR resultados representan un promedio de tres experimentos diferentes
nivel de proteínas análisis se realizó utilizando el procedimiento de Western blot (WB) como se ha descrito anteriormente [30], utilizando el anticuerpo survivina humana contra (R & amp; D Systems)., ciclina B1 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), o β-actina (Cell Signaling Technology, Inc. MA, EE.UU.). El análisis densitométrico del nivel de expresión de la proteína se realizó mediante el procesamiento de imágenes EZQuant-Gel y software de análisis (EZQuant, Rehovot, Israel). Los niveles de proteína se normalizaron a los niveles de actina
Si silenciamiento de ARN
Las células se sembraron a ~ 1.5x10
5 células por pocillo en placas de 24 pocillos.; monastrol se aplicó 24 h después de chapado. Las células fueron transfectadas con siSurvivin o una revueltos (SC) constructo siRNA (40 nM, Sigma-Aldrich), siRNA transfección se realizó utilizando el reactivo de lipofectamina 2000 de acuerdo con el protocolo del fabricante. La secuencia diana de la survivina de siRNA fue: 5 'GGACCACCGCAUCUCUACA 3' o 5 revueltos 'GCCCAGAUCCCUGUACGU 3'. transfección las células 12h y 24h de correos se contaron usando azul tripán.
El análisis estadístico
Columnas y bares en todas las figuras representan la media ± SEM. La significación de las diferencias entre los valores promedio se determinó utilizando Student de
t-test
. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01
Resultados
Para examinar los factores que influyen en la sensibilidad de las células a diferentes monastrol, primero se caracteriza esta sensibilidad en cinco líneas celulares diferentes:. AGS de un adenocarcinoma de estómago [46 ], HepG2 de carcinoma hepatocelular [47], LoVo de adenocarcinoma de colon [48], Du154 de carcinoma de próstata [49], y HT29 de adenocarcinoma de colon [50]. Las células se sometieron a un tratamiento prolongado con monastrol de hasta tres días. En cada intervalo de tiempo, el número de células viables se examinó por el ensayo de la actividad mitocondrial usando 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) 2H-tetrazolio-5-carboxanilida sal (XTT) [44 ]. Nuestros resultados indican que, como se esperaba, el número de células viables disminuyó después del tratamiento prolongado con monastrol en todas las líneas celulares. Sin embargo, el porcentaje de células viables en las diferentes líneas celulares después del tratamiento con monastrol variada. Por ejemplo, el tratamiento con 100μM de monastrol durante dos días resultó en ~ 80% de disminución en el número de células AGS y HepG2, ~ 60% de disminución en el número de células Lovo, y sólo ~ 30% de disminución en Du145 y células HT29 (Fig 1, círculos verdes). También encontramos una pequeña pero reproducible diferencia entre la viabilidad de las células HT29 Du145 y tratados con monastrol. Por ejemplo: el porcentaje de células viables Du145 tratados con 20 o 50 micras monastrol durante 2 días es significativamente menor que la de las células HT29 tratadas de forma idéntica. Basándose en los datos de viabilidad (Fig 1), establecimos el rango de sensibilidad a monastrol, desde los más sensibles a menos sensibles, como:. AGS & gt; HepG2 & gt; Lovo & gt; Du145≥HT29
deslizamiento mitótica es un fenómeno por el que en la presencia de daño mitótico, las células proceden a la fase G1 del ciclo siguiente sin dividir su ADN [31, 33, 34, 51]. A continuación examinó si la resistencia de una línea celular particular a monastrol está relacionada con su tendencia a sufrir deslizamiento mitótico en presencia del fármaco. Para caracterizar el deslizamiento mitótico, se trataron las células con monastrol durante 48 h a concentraciones que dieron lugar a la supervivencia celular menos, y examinamos la morfología de microtúbulos del citoesqueleto por inmunotinción (Fig 2A y 2B) y la distribución del ciclo celular mediante citometría de flujo (Fig 2C). Las células detenidas en mitosis por monastrol han sido previamente demostrado que presentan husillos monoastral [24, 30]. Se encontró que después del tratamiento monastrol 48h dos morfologías principales de células eran evidentes: las células mitóticas monoastral (figura 2A) G1-como o. El número de células o células con morfologías no identificados mitóticos normales era insignificante. Nuestros resultados muestran que tras el tratamiento con monastrol 48h, las diferentes líneas celulares exhibieron diferentes porcentajes de células con monoasters. Por ejemplo, la mayoría de los supervivientes células AGS apareció como grandes células G1-como con núcleos individuales (Figura 2A). El porcentaje de monoasters en estas células era muy pequeña, ~ 7% (Fig 2B). Se encontró que tanto AGS y HepG2 líneas celulares, que son sensibles a monastrol, exhibieron un pequeño porcentaje de monoasters (& lt; 10%) y un gran porcentaje de células G1-como, tras el tratamiento 48h monastrol (Fig 2B). Por otro lado, LoVo, Du145, y HT29 líneas celulares, que son más resistentes a monastrol, presentan porcentajes considerablemente más grandes, 20 a 30%, de husillos monoastral (Figura 2B), indicando que un gran número de estas células se detuvieron en mitosis. Análisis de la distribución de fase del ciclo celular reveló que después de un tratamiento de 48 horas con monastrol, a pesar de la diferencia en el porcentaje de células mitóticas con monoasters, todas las líneas celulares examinadas contenían un gran porcentaje de células con contenido de ADN de doble (Fig 2C, la doble flecha ). Esto indica que aunque algunas de las células apareció con el típico microtúbulos del citoesqueleto G1-como, las células se habían duplicado el contenido de ADN, es decir, que se sometió a deslizamiento mitótico sin división de ADN. Por tanto, nuestros resultados sugieren que existe una relación entre la sensibilidad a la monastrol y la tendencia a sufrir deslizamiento mitótico:. monastrol células resistentes mantienen detención mitótica durante tiempos más largos, mientras que las células sensibles a monastrol se someten a deslizamiento mitótico
(A AGS) y células HT29 fueron tratados durante 48 horas con 100μM y 150μM de monastrol, respectivamente. citoesqueleto de tubulina se visualizó después de la fijación por inmunotinción, el ADN se tiñeron con DAPI. Después de 48 h de tratamiento monastrol, la mayoría de las células AGS apareció como células grandes, G1-como con un núcleo (flechas amarillas), mientras que un alto porcentaje de células HT29 fueron detenidas en la mitosis como monoasters (flechas verdes). (B) Efecto del tratamiento prolongado con monastrol en porcentaje de monoasters en las diferentes líneas celulares, se indica en la parte inferior. Las células se trataron con monastrol, procesados para inmunotinción, y el porcentaje de monoasters se determinó anotando 200-300 células para cada línea celular. Columnas y barras representan las medias y SEM de 3 experimentos independientes, * P & lt; 0,05, en comparación con las células AGS. (C) de distribución de las fases del ciclo celular se determinó por citometría de flujo en ausencia (control) o presencia de monastrol. Líneas celulares se indican en la parte superior. flechas simples y dobles representan los picos con 2n 4n y contenido de ADN, respectivamente.
El descenso de regulación de la survivina proteína anti-apoptótica fue demostrado previamente para aumentar el deslizamiento mitótico en la presencia de daño husillo [52] . por lo tanto la hipótesis de que durante la exposición a monastrol, la expresión de survivina diferirá entre las células monastrol-sensibles y resistentes. Para probar esta hipótesis, se compararon niveles de ARNm y de proteína de survivina en células HT29 monastrol resistentes y células AGS monastrol sensible (Fig 3). Para permitir la medición de los cambios en el nivel de proteína antes de la apoptosis [30], las células tratadas con monastrol para tiempos más cortos, 12h y 24h. Para evaluar el estado mitótico de las células examinadas, seguimos a los niveles de la proteína ciclina mitótica B. ARNm (Figura 3A) y proteína (Fig 3B y 3C) Encontramos que después del tratamiento con células HT29 24h monastrol exhiben niveles de ciclina B se incrementó en comparación a 12 h de tratamiento, lo que indica que son detenidas en la mitosis (figura 3). Por otra parte, en células AGS, los niveles de ciclina B fueron ya aumentaron a 12 h de tratamiento con niveles de monastrol y ciclina B mostraron una tendencia a disminuir a las 24 horas, 0,05 & lt; P & lt; 0,1 (Fig 3). Esto sugiere que el tratamiento con monastrol durante 24 horas ya provoca el deslizamiento mitótico parcial en las células AGS mientras que las células HT29 mantienen detención mitótica. El examen de ARNm de survivina (Fig 3A) y proteína (Fig 3B y 3C) niveles reveló que en HT29 niveles de survivina células aumentaron en tratamiento con monastrol 24h, lo que sugiere que la survivina está implicado en el mantenimiento de la detención mitótica. Por otra parte, en las células AGS niveles de ARNm de survivina se mantuvo sin cambios a las 24 h en comparación con el tratamiento con monastrol 12h. Por otra parte, en las células AGS, los niveles promedio de proteínas de survivina fueron inferiores a las 24 h en comparación con 12 h de tratamiento monastrol, aunque esta diferencia no alcanzó significación estadística (Figura 3B y 3C, panel derecho). Estos resultados sugieren que los niveles elevados de survivina en una línea celular particular, se correlacionan con la resistencia de esta línea celular para monastrol tratamiento
.
HT29 y las células AGS fueron tratados con monastrol durante 12 h y 24 h y se procesaron para mRNA análisis por RT PCR (A) y análisis de nivel de proteína por WB (B y C). 150μM y monastrol 100μM se utilizaron para las células HT29 y AGS, respectivamente. En A y C, las columnas y las barras representan valores medios y SEM de 3-4 experimentos independientes. En cada experimento, los niveles de ciclina B (izquierda) y survivina (derecha), indicados en la parte superior, en presencia de monastrol se normalizaron a los valores de control obtenidos sólo con DMSO. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; a-0,05 & lt; P & lt; 0,1 en comparación con 12 h de tratamiento monastrol. (B) Análisis de WB Representante de la ciclina B y la expresión de la proteína survivina en AGS (izquierda) y HT29 (derecha) las células tratadas con monastrol a 12h y 24h, se indica en la parte inferior. La igualdad de carga de proteína fue seguir por la expresión de actina (paneles inferiores). (+) Monastrol; (-) DMSO
Para examinar si elevados niveles de expresión de survivina mantienen directamente arresto mitótico sostenida, transfectadas las células AGS monastrol sensible con un plásmido que codifica para la proteína survivina de tipo salvaje fusionado a GFP (. pSurvivin, [45]), y crearon una línea celular clonal poli-transfectadas establemente AGS (ver Materiales y Métodos). vector que expresa GFP se utilizó como control. células AGS que expresan el plásmido pSurvivin exhibieron 5,2 ± 0,9 (SEM, n = 4) se pliegan aumento de la expresión de survivina (Fig 4A, parte inferior). Después de la generación de líneas celulares transfectadas de forma estable, las células fueron tratadas con 100μM monastrol y procesados para inmunotinción tubulina, la viabilidad, y análisis de la distribución del ciclo celular (Fig 4A-4D). Se encontró que después del tratamiento con monastrol 24h, el porcentaje de células mitóticas detenidos con monoasters aumentó significativamente en las células que expresan survivina comparación con las células que expresan AGS vector solamente (Fig 4A y 4B). Estos datos indican que la sobreexpresión de survivina aumenta la capacidad de las células AGS de mantener detención de la mitosis en presencia de daño inducido por husillo monastrol. Análisis de la distribución de fase del ciclo celular indica que después del tratamiento 12h con monastrol, el porcentaje de células AGS survivina-expresión con doble (4n) el contenido de ADN se aumentó significativamente en comparación con las células que expresan sólo vector (Fig 4C, 12H), lo que indica que la survivina induce la detención mitótica sostenida. Es importante destacar que, tras el tratamiento con monastrol 24h no se encontraron diferencias en el porcentaje de población de células con contenido de ADN 4N entre las células que expresan survivina y las que expresan único vector (Figura 4C, 24h). Sin embargo, después del tratamiento 24h con monastrol, hubo un aumento significativo en el número de células con monoasters en las células de survivina que expresan, indicando que las células están en detención mitótica, en comparación con las células que expresan sólo vector, que se sometieron a deslizamiento mitótico y estaban destinados a la celda muerte (Fig 4A y 4B). Por lo tanto, nuestros datos indican que, en ausencia de la sobreexpresión de survivina, las células AGS se someten a deslizamiento mitótico y la muerte celular tras el tratamiento con monastrol, mientras que la sobreexpresión de survivina induce la detención mitótica, probablemente el rescate de las células. Además, de acuerdo con la función anti-apoptótica sugerido de survivina [45, 53], se encontró que la sobreexpresión de survivina en células AGS aumentó la viabilidad de estas células después de 24 horas y el tratamiento con monastrol 48h (Fig 4C).
(a-D) células AGS se transfectaron de manera estable con un plásmido que expresa GFP (vector) o un plásmido que codifica para la sobreexpresión de survivina-GFP (pSurvivin). Las células se trataron con 100μM monastrol y procesados para inmunotinción de los microtúbulos (A y B), análisis de la distribución del ciclo celular (C), y la prueba de viabilidad (D). (A) Imágenes representativas de microtúbulos del citoesqueleto en células AGS que llevan un vector vacío o pSurvivin, indicados en la parte inferior. Las células se trataron con 100μM monastrol durante 24 h. Se observan células G1-como (flechas amarillas) y células mitóticas (flecha verde). Dado que las células mitóticas son redondos, su plano focal es diferente de la de las células G1-como planas. Imágenes en (A) se centran en las células G1 y, por tanto, los monoasters en la mitosis no se ven en estas imágenes. En consecuencia, las células mitóticas aparecen como esferas brillantes (flechas verdes). Conclusión: el análisis WB survivin de la proliferación de células AGS en presencia (+) o ausencia (-) del plásmido pSurvivin sobreexpresión. (B) Cuantificación de% de células mitóticas basado en imágenes tal como se muestra en (A). solamente Gray-vector; azul-pSurvivin. Columnas y barras representan las medias y SEM de tres experimentos independientes en los que se contaron un total de 200-300 células. ** P & lt; 0,01, en comparación con sólo vector. (C) células AGS transfectadas establemente se trataron con monastrol durante 12 h y 24 h (indicado en la parte superior) y se procesaron para análisis de la distribución de fase del ciclo celular por citometría de flujo. flechas simples y dobles representan los picos con el contenido de ADN 2n y 4n, respectivamente. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de células con doble (4n) el contenido de ADN. (D) viabilidad de las células transfectadas de forma estable en presencia de 100μM monastrol durante 24 h y 48 h. solamente Gray-vector; Azul-pSurvivin. El número de células viables se determinó mediante el ensayo de XTT para la actividad mitocondrial. Porcentaje de células viables se calculó con relación al control experimentos con solamente DMSO. Columnas y barras representan la media y SEM de 3 experimentos independientes. * P & lt; 0,05, en comparación con sólo vector. (E) AGS y células HT29 fueron transfectadas transitoriamente con survivina (verde oscuro) o revueltos (SC, de color verde claro) secuencia de ARN Si. 12h siguiente AGS de transfección y las células HT29 fueron tratados con 100 y monastrol 150μM, respectivamente, durante 12 h y 24 h (indicado en la parte inferior). La viabilidad de las células se determinó por Trypan azul. Porcentaje de células viables se calculó con relación al control experimentos con solamente DMSO. Columnas y barras representan la media y SEM de 2-4 experimentos independientes por triplicado preformados. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; un 0,05 & lt; p & lt;. 0,1, en comparación con la secuencia de ARN codificado Si
A fin de examinar la relación entre la viabilidad celular en tratamiento monastrol y la expresión de survivina, que parcialmente silenciados expresión de survivina por Si ARN ( Fig 4E). secuencia de ARN revueltos sirvió como control. El examen de los niveles de ARNm de survivina por RT PCR confirmó que mientras que la transfección transitoria de la secuencia de ARN codificado no causó ningún cambio en los niveles de ARNm de survivina, transfección con survivin Si RNA causada ~ 70% y 50 a 60% de disminución en los niveles de ARNm de survivina en AGS y células HT29, respectivamente (no mostrado). Se encontró que después de 12 h de exposición a monastrol, el silenciamiento de la expresión de survivina parcial causó una disminución de la viabilidad de AGS y células HT29 en un 50-60%, en comparación con las células transfectadas con la secuencia de ARN codificada (Fig 4E). Mientras que las células AGS monastrol sensible sólo mostró una tendencia (0,05 & lt; P & lt; 0,1), las células HT29 monastrol resistentes mostraron una disminución claramente significativa en la viabilidad después de silenciamiento sobreviviente parcial (P & lt; 0,05), lo que indica que se requiere la survivina para la viabilidad y la resistencia a monastrol. Después de 24 h de tratamiento con monastrol, la viabilidad de las células AGS monastrol sensible se redujo aún más en las células transfectadas con survivin Si o ARN codificado (Fig 4E). En las células HT29 monastrol resistentes, el silenciamiento de la expresión de survivina parcial indujo un aumento de la viabilidad en comparación con la secuencia de ARN codificada, que indica que hay mecanismos de adaptación en estas células a niveles de survivina reducen parcialmente. En conjunto, nuestros datos indican que los niveles de survivina durante la detención mitótica creciente están relacionados con la viabilidad celular, que es al menos parcialmente relacionada con su capacidad para inducir la detención mitótica prolongada bajo tratamiento con monastrol.
Discusión
los estudios de la última década han indicado que cuando las células se tratan con medicamentos antimitóticos tales como inhibidores específicos kinesin-5, pueden ocurrir dos escenarios principales: las células pueden o bien mantener la detención de la mitosis y morir por apoptosis mitótico [30, 31], o pasar a la siguiente fase G1 por el deslizamiento mitótico y someterse a la apoptosis [33, 34]. En este último caso, las células mueren rápidamente de la apoptosis causada por el "punto de control tetraploidia" [33, 35]. Por este escenario, las células que se someten a deslizamiento mitótico más fácilmente en presencia de monastrol serán sometidos a la apoptosis inducida por el puesto de control tetraploidia y por lo tanto ser más sensibles a monastrol. Sin embargo, se encontró que el punto de control tetraploidia ser dependiente de la proteína p53 supresora de tumores [51, 54]. Por lo tanto, se espera que las células a ser más sensibles a monastrol si se someten a un deslizamiento mitótico y expresan una p53 de tipo salvaje. De hecho, las líneas celulares examinadas en este estudio expresan ambas versiones de la proteína p53: p53 es de tipo salvaje en AGS [55], HepG2 [56], y LoVo [57] líneas celulares, mientras que está mutado en HT29 [58] y [49] DU145 células. Nuestra conclusión de que el grado de sensibilidad a la monastrol es AGS & gt; HepG2 & gt; Lovo & gt; Du145≥HT29 apoya la idea de que las células serán más sensibles a los kinesin 5 inhibidores de si tienden a someterse a deslizamiento mitótico y llevar alelo de tipo salvaje p53. La tendencia a sufrir deslizamiento mitótico per se no es directamente dependiente de la p53 ya que las células LoVo que llevan WT p53 [57] se someten a deslizamiento mitótico al mismo grado que el HT29 y las células Du125, que llevan una mutación de p53 [49, 58 ] (Fig 2B y 2C). Sin embargo, el aumento de la muerte celular se produce en las células LoVo cuando p53 WT permite la activación del "punto de control tetraploidia".
Cuando se produce el deslizamiento mitótico en las células p53 mutado, las células proceden con la proliferación sin dividir adecuadamente ADN.
In vivo
, esto puede dar lugar a la acumulación de mutaciones que reducen la actividad citotóxica /anti-cáncer de kinesin-5 inhibidores [22, 27, 39]. Por lo tanto, una de las estrategias para aumentar la eficiencia de los fármacos contra el cáncer anti-mitótico puede ser para inducir la detención de la mitosis prolongada en los cánceres que expresan versiones mutadas de p53.