Extracto
La survivina es un componente del complejo de pasajeros cromosómica (CPC) que es esencial para la segregación cromosómica precisa. Interfiriendo con la función de survivina en la mitosis conduce a errores de la segregación cromosómica y citocinesis defectuoso. Survivina contiene una repetición de baculovirus IAP (BIR) y por lo tanto se clasificó originalmente como inhibidor de la proteína apopotosis (IAP), sin embargo, su papel en la apoptosis después de estrés celular sigue siendo en gran parte desconocido. Se demuestra aquí que la survivina suprime predominantemente anoikis, una forma de muerte celular programada inducida por la pérdida de la adhesión celular a la matriz extracelular. Curiosamente, las células que sobreexpresan ectópica EGFP-survivina mostraron después de la pérdida de la célula-matriz-interacción de una disminución de expresión de I? B-α. Posteriores de fraccionamiento de proteínas y de inmunoprecipitación experimentos revelaron que subcelulares XIAP interactúa con survivina detergente soluble que es conocida para activar de manera cooperativa de señalización NF-kB. El examen de los niveles de expresión de survivina detergente soluble en líneas celulares de cáncer colorrectal y en tejidos cancerosos colorrectales reveló que el detergente soluble niveles citoplasmáticos Survivin correlacionados inversamente con la anoikis susceptibilidad en el cáncer colorrectal. Por lo tanto, el detergente soluble survivina citoplasmática podría ser un biomarcador predictivo prometedor para los ganglios linfáticos y metástasis a distancia del cáncer colorrectal. Llegamos a la conclusión de que una función anti-apoptótica de survivina detergente soluble en células de interfase que experimentan anoikis está mediada, al menos, a través de XIAP /I? B-α señalización /NF-kappa B
Visto:. Hori M, Miki T, M Okamoto , Yazama F, Konishi H, Kaneko H, et al. (2013) El detergente soluble citoplasmática piscina de survivina Suprime Anoikis y su expresión se asocia con enfermedad metastásica del cáncer de colon humano. PLoS ONE 8 (2): e55710. doi: 10.1371 /journal.pone.0055710
Editor: M. Srinivasa Srinivasula, IISER-TVM, India
Recibido: 20 Julio, 2012; Aceptado: December 29, 2012; Publicado: 6 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Hori et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (KAKENHI Nº 21591730 por Masaaki Tatsuka) y la Prefectura de Hiroshima Universidad (importante proyecto de investigación, GAKUNAI Kyodo kenkyu H-24 para Masaaki Tatsuka, Hiroaki Konishi, y Fumio Shimamoto), y la Prefectura de Hiroshima Universidad Escuela Superior de Investigaciones Científicas integral a Mayumi Okamoto y Guangying Qi (Investigador Asociado de Grant H-24). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Durante el desarrollo del cáncer, las células metastásicas se desprenden de las células tumorales vecinas, adquirir la motilidad celular, invadir y penetrar en el sistema linfático o de la circulación sanguínea, sobrevivir y formar lesiones metastásicas. Estos pasos implican muchos genes y vías, y sin embargo, estos procesos biológicos son poco conocidos a pesar de muchos enfoques científicos [1]. sigue siendo necesaria la identificación de moléculas de metas tumorales metastásicas para procedimientos diagnósticos y terapéuticos.
survivina es un miembro del complejo de proteína de pasajeros cromosómica (CPC), que es un regulador clave de la mitosis. Survivina y otros componentes de la CPC, Aurora-B, proteínas interior centrómero (INCENP), y Borealin (Dasra B) son esenciales para las funciones de la CPC, incluyendo las correcciones de errores de fijación cinetocoro y finalización de la citocinesis [2]. Survivina contribuye a la localización mitótico de la CPC y se ha descrito para mejorar la actividad de quinasa Aurora-B como se muestra en la
Xenopus laevis
y
S. pombe
[3], [4]. En la mitosis temprana, la fosforilación de la histona H3 en la treonina 3 mediada por Haspin y la posterior unión de survivina a este sitio es crítica para el montaje de CPC en cinetocoros [5], [6], [7].
survivina es periódicamente expresado durante el pico del ciclo celular en la mitosis [8]. estudios Previou han demostrado que la expresión de survivina se ve afectada por p53, y la pérdida de función de p53, que se observa a menudo en las células cancerosas, aumenta su transcripción [9], [10]. De hecho la mayoría de las células cancerosas analizadas hasta el momento máximo de regular survivina [11], [12] en comparación con las células normales o tejidos adyacentes. Además, en muchos casos de cáncer humano, de survivina se ha detectado incluso durante la interfase [13], [14]. La sobreexpresión de survivina se encuentra con frecuencia en el cáncer colorrectal [15], [16], [17]. Aquí aumento de los niveles de survivina se han descrito que se correlaciona con un mal pronóstico [18], [19], pero los datos contradictorios se han publicado en relación con este [20]. Además de sus funciones CPC survivina se cree que tiene múltiples funciones en la regulación de la apoptosis [21], [22], [23]. Sin embargo, en el N-terminal de survivina, sólo hay un inhibidor de la apoptosis de baculovirus de repetición de dominio (BIR). También survivina no contiene dominio de dedos de anillo C-terminal que es común para los miembros de la familia IAP [11], [24]. A pesar de survivina se clasificó originalmente como inhibidor de la apoptosis (BIR) que ahora se reconoce que sus principales funciones moleculares están vinculados a la asamblea de control de huso y la citocinesis. Hoy en día, las funciones de anti-apoptóticos de la survivina son cuestionados porque la mayoría de experimentos que bloquean la función de survivina condujeron al desarrollo de defectos mitóticos que podrían interferir con un análisis preciso de su función IAP [25] [26], [27], [28, ]. En un estudio anterior de ablación de survivina en el pollo de linfocitos B DT40 fue letal debido a la falta de ambas funciones CPC y otras células proliferativas habilidades adicionales [29]. Sin embargo, estas células muestran la susceptibilidad normal a la apoptosis inducida por etopósido-en comparación con las células control.
En nuestro estudio demostramos por primera vez que el detergente soluble survivina suprime anoikis en las células dependientes de anclaje, una forma de programar la muerte celular inducida por la pérdida de adhesión de la matriz extracelular circundante. experimentos de fraccionamiento subcelular proporcionado pruebas de que la survivina Detergente soluble del citoplasma fue el responsable de la supresión de la anoikis. El mecanismo de supresión de anoikis implica la activación de /I? B-α /señalización e inactivación de c-Jun NF-kB XIAP. Otro hallazgo importante de este estudio es que el detergente soluble survivina se correlaciona con el fenotipo invasivo de las células del cáncer colorrectal. Por lo tanto, detergente soluble survivina podría ser de valor clínico, ya que es probable predice ganglionar y metástasis a distancia en pacientes con cáncer colorrectal.
Resultados
La sobreexpresión de survivina protege las células de la anoikis
en los estudios iniciales hemos tratado de analizar el impacto de la survivina sobreexpresión en fibroblastos de hámster chino deficientes en p53 embrionarias (células diploides CHE CHE) y células isogénicas que albergan p53 de tipo salvaje. Para el seguimiento de la transfección se utilizó un survivina-etiquetados proteína verde fluorescente mejorada (EGFP-survivina). Sin embargo, la sobreexpresión ectópica de EGFP-survivina no tuvo efecto sobre la apoptosis en CHE-p53 + /+ células tratadas con ADN dañar la radiación ionizante (IR) y UV-C, en comparación con CHE-p53 + /+ - células EGFP (Figura 1A) como medido por tinción con anexina V y el terminal desoxinucleotidiltransferasa (TDT) mediada por dUTP nick fin de etiquetado de ensayo (TUNEL). A continuación, nos centramos nuestra atención en las células CHE con la condición de p53 defectuoso (CHE-p53 - /- las células). Sorprendentemente, CHE-p53 - /- células con sobreexpresión ectópica de EGFP-survivina produjo tumores pulmonares metastásicos cuando se inyecta por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes mientras que no se observaron metástasis pulmonares después de xenoinjerto CHE-p53 - células que expresan EGFP (Tabla S1) - /. Prueba de inducción de la apoptosis después de IR o UV-C reveló que CHE-p53 - /- células tenían significativamente mayor fracción de células de la apoptosis positiva en comparación con las células CHE tienen p53 de tipo salvaje [30], [31], [32] (Figura 1A ). Esta observación está de acuerdo con informes utilizando fibroblastos de embriones de roedores que demuestran una menor susceptibilidad a la IR y UV-C que en aquellas células que carecen de p53 funcional, control de punto de control. Curiosamente, también No se encontró un efecto protector de la survivina sobreexpresa en CHE-p53 - /- las células en comparación con las células CHE con la expresión ectópica de EGFP (Figura 1A)
A.. Frecuencia de la apoptosis en células de CHE (con p53 + /+ y p53 - /-) transfectadas con pEGFP-vacío y pEGFP-survivina después del tratamiento con X-irradiación (10 Gy) y UV-C (10 J /m
2) . Las células transfectadas fueron expuestas a IR o UV-C a las 24 h después de la transfección. frecuencias de transfección fueron 80-90%, y se contaron las células EGFP-positivos para las células con anexina V-positivos o negativos-(
panel superior
) y las células de ensayo-positivos o negativos-TUNEL (
). X-irradiado CHE-p53 - /- células tenían significativamente una mayor fracción de las células de la apoptosis positiva si se compara con X-irradiado CHE-p53 + /+ células (
P Hotel & lt; 0,03 para la tinción con anexina V y
P Hotel & lt; 0,08 para el ensayo de TUNEL), y UV-C irradiado CHE-p53 - /- células tenían significativamente una mayor fracción de las células de la apoptosis positiva si se compara con UV-C irradiados CHE-p53 + /+ células (
P Hotel & lt; 0,001 para la tinción con anexina V y
P Hotel & lt; 0,02 para el ensayo de TUNEL). las células de la apoptosis positiva no se redujo significativamente en las células transfectadas con pEGFP-survivina en comparación con las células transfectadas con pEGFP en cada caso (
P
& gt; 0,4 para la tinción con anexina V y
P
& gt; 0,4 para el ensayo de TUNEL). Los valores indican la media ± S. D. (N = 3). B. Aumento de la retención en los pulmones después de la inyección intravenosa de EGFP- o EGFP-survivina-expresando células. El número de sobrevivir CHE-p53 - /- células en el pulmón se incrementó significativamente en comparación con el número de células supervivientes de control que expresan EGFP. Los valores indican la media ± S. D. de seis ratones. * Diferencia significativa (
P Hotel & lt; 0,005). C. La caspasa-3 de activación en CHE-p53 - /- células transfectadas con pEGFP-vacía y pEGFP-survivina después de la inducción anoikis. Las células transfectadas se separaron de la matriz extracelular y al mismo tiempo privaron de suero para inducir anoikis a las 24 h después de la transfección. Las células se suspendieron en medio libre de suero durante 6 a 36 h, se recogieron y se lisaron en tampón de muestra de SDS de Laemmli para el análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo de la caspasa-3 contra activado. frecuencias de transfección se comprueban mediante el uso de microscopía de fluorescencia y se confirmó que 80 a 90%. D. La caspasa-3 de activación en CHE-p53 - /- células transfectadas con pEGFP-vacía y pEGFP-survivina después del tratamiento con UV-C (10 J /m
2). Las células transfectadas fueron expuestas a UV-C a las 24 h después de la transfección. Las células se cultivaron durante 24 h, se recogieron y se lisaron en tampón de muestra de SDS de Laemmli para el análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo de la caspasa-3 contra activado. frecuencias de transfección se comprobaron mediante el uso de microscopía de fluorescencia y se confirmó que el 80-90%.
Hasta el momento de la transfección pEGFP-survivina no inhibe la apoptosis inducida por la radiación en las células CHE, independientemente del estado de p53 y los niveles de expresión de survivina, sino por el contrario solamente CHE-p53 - /- las células que sobreexpresan EGFP-survivina causaron la enfermedad metastásica en ratones. Por lo tanto, la hipótesis de que la sobreexpresión de survivina podría aumentar la supervivencia de CHE-p53 - /- células EGFP-survivina bajo condiciones de estrés que se asemeja más probable que el
in vivo
condiciones fisiológicas de la difusión de las células tumorales, como independiente de anclaje situación y el hambre de nutrientes
de hecho, mediante la aplicación de
iv
inyección de células tumorales en ratones que reveló que el número de sobrevivir CHE-p53 -. /- células en el pulmón se incrementó significativamente cuando se compara con el número de células supervivientes de control que expresan EGFP (Figura 1B).
para estudiar más a nuestra hipótesis, hemos probado si la sobreexpresión de survivina-EGFP redujo conferido anoikis-susceptibilidad, es decir, la resistencia a la starvation- suero y cultura- suspensión inducida por apoptosis, en las células CHE. Como se muestra en la Figura 2A se hizo evidente que la sobreexpresión de EGFP-survivina suprimió significativamente anoikis en comparación con el CHE-p53 - /- las células de control, tal como se mide por tinción con anexina V y también mediante el ensayo TUNEL, en CHE-p53 - /- células . análisis de inmunotransferencia adicional para la detección del ejecutor procesado caspasa-3 confirmó que sobreexpresa EGFP-survivina protegido de anoikis (Figura 1C) desde CHE-p53 - /- células con la expresión ectópica de EGFP-survivina demostró un aumento gradual más débil de la caspasa-3 procesada durante el periodo observado de tiempo. Por otra parte, la sobreexpresión de EGFP-survivina no suprimió la activación de caspasa-3 en la apoptosis inducida por UV-C (Figura 1D).
A. Frecuencia de anoikis en CHE-p53 - /- células transfectadas con pEGFP-vacía y pEGFP-survivina. Las células transfectadas se separaron de la matriz extracelular y al mismo tiempo privaron de suero para inducir anoikis a las 24 h después de la transfección. frecuencias de transfección se 80-90%, y se contaron las células EGFP-positivo para células anoikis-positivos o negativos al. La sobreexpresión de survivina EGFP-suprimió significativamente anoikis en comparación con el CHE-p53 - células de control - /. Los valores indican la media ± S. D. (N = 3). * Diferencia significativa (
P Hotel & lt; 0,08). ** Diferencia significativa (
P Hotel & lt; 0,04). B. La caspasa-3 de activación de células EGFP y EGFP-survivina que expresan después de la privación de suero en condiciones de cultivo conectados o desconectados. El protocolo experimental fue ilustrado en la Figura S1. frecuencias de transfección se comprueban mediante el uso de microscopía de fluorescencia y se confirmó que 80 a 90%. Las células se mantuvieron en medio libre de suero durante 24 a 72 h, se recogieron y se lisaron en tampón de muestra de SDS de Laemmli para el análisis de inmunotransferencia con anti-GFP, anti-survivina, anti-activado caspasa-3, anticuerpo anti-LC3B, y anti -α-tubulina. C. survivina-indujo apoptosis en comparación tasa de represión entre las células que expresan EGFP-y células EGFP-survivina que expresan. Los niveles de proteína de la caspasa-3 activada se estimaron mediante análisis de inmunotransferencia. Las tarifas de represión se expresaron en una relación de activado nivel de proteína caspasa-3 en células EGFP-survivina que expresan al nivel en las células que expresan EGFP. Los valores indican la media ± S. D. (N = 3). * Diferencia significativa (
P Hotel & lt; 0,04). ** Diferencia significativa (
P Hotel & lt; 0,02). *** Diferencia significativa (
P Hotel & lt; 0,007). D. análisis de la fragmentación del ADN en las células que expresan EGFP-y células EGFP-survivina que expresan. Las células transfectadas se separaron de la matriz extracelular y al mismo tiempo privaron de suero para inducir anoikis a las 24 h después de la transfección. Se suspendieron las células durante 24 h, y se cosechan. El ADN genómico se extrajo y se sometió a electroforesis en geles de agarosa. E. imágenes representativas de las células que expresan EGFP y EGFP-células que expresan survivina-, utilizando microscopía confocal láser. Las células transfectadas se suspendieron en medio libre de suero durante 24 años, y la imagen de Nomarski contraste diferencial de interferencia (
Lane DIC
), mediante tinción con rodamina faloidina (
carril de F-actina
), por fluorescencia EGFP (
carril EGFP
), y por tinción con DAPI (
carril DAPI
). Rodamina faloidina tinción DAPI y tinción típicamente indican que las células que expresan EGFP-sometieron anoikis, pero las células EGFP-survivina que expresan no lo hicieron. F. Determinación de la viabilidad celular por WST-1 de ensayo. Las células transfectadas se suspendieron en medio libre de suero durante 24 h, y después de viabilidad celular de células EGFP-expresión y células EGFP-survivina que expresan se evaluó. Los valores indican la media ± S. D. (N = 3). * Diferencia significativa (
P Hotel & lt; 0,04).
A continuación, se determinó si el efecto protector de sobreexpresa EGFP-survivina en la caspasa-3-activación fue anoikis específica, mediante el uso de un protocolo de ensayo de anoikis (ilustrado esquemáticamente en la Figura S1). análisis de inmunotransferencia mostraron que el efecto supresor era más potente en la condición de cultivo individual que en condiciones de cultivo adjunto (Figura 2B). Digno de mención, la autofagia, otro tipo de muerte celular causada por un proceso catabólico de la degradación de los componentes celulares por los lisosomas, que no estuvo involucrado en el efecto (Figura 2B,
IB: anti-LC3B
). Los datos cuantitativos demostraron la eliminación efectiva de la anoikis de cultivo inducida por suspensión en células EGFP-survivina expresan en comparación con las células control que expresan EGFP (Figura 2C). En consonancia con esta observación, la sobreexpresión de survivina-EGFP suprimió la fragmentación del ADN (Figura 2 D y E) y la viabilidad celular conservado (Figura 2F) en condiciones de cultivo individual.
La sobreexpresión de survivina regula la apoptosis relacionadas con factores de transcripción
a continuación pregunta qué vías de señalización podrían estar implicados en la supresión de la anoikis-en-EGFP-expresando survivina CHE-p53 - /- células. La survivina se ha descrito para inhibir la pro-apoptóticos proteína X asociada a Bcl-2 (BAX) inducida por la apoptosis [33]. Sin embargo, los niveles de expresión de BAX no se alteraron después de la inducción de anoikis en EGFP-Survivin- así como EGFP-expresando CHE-p53 - /- células (Figura 3,
Bax
). a continuación, nos centramos en el segundo activador de las mitocondrias derivadas de la caspasa inhibidor /proteína de unión directa de la apoptosis con un bajo pI (Smac /DIABLO) que se ha demostrado que se unen a survivina [34], [35]. Sin embargo, Smac /DIABLO era indetectable en estado individual de cultivo (Figura 3,
Smac /DIABLO
). Otro miembro de la familia IAP, el inhibidor ligada al cromosoma X de la proteína de apoptosis (XIAP) se ha descrito la formación de heterodímeros con survivina [36]. Algunas líneas de evidencia sugieren que este heterodímero es capaz de activar una señalización de NF-kappa B anti-apoptótica, a través de la fosforilación y la posterior degradación del inhibidor molecular de kappa B-α (I? B-α) [37]. Curiosamente, se observó una regulación por incremento de los niveles de proteína I? B-a en condiciones de cultivo individual de control de CHE-p53 - /- células, mientras que los niveles de expresión de I? B-alfa permanecieron muy baja en las células EGFP-survivina que expresan (Figura 3,
XIAP, I? B-α, y NF-kB
). Al mismo tiempo, el aumento de la fosforilación del factor de transcripción pro-apoptóticos, c-Jun, fue suprimida por la sobreexpresión de EGFP-survivina en condiciones de cultivo individual (Figura 3,
JNK, c-Jun-P (S73), y c-Jun
). Estos datos sugieren que la sobreexpresión de survivina-EGFP disminuye el nivel de I? B-α en células separadas y posteriormente conducen a la activación de NF-kappa B y en el mismo tiempo a una supresión de la transcripción mediada por c-jun. Sin embargo, no pudimos encontrado una contribución de la quinasa de adhesión focal (FAK) a la supresión anoikis en este sistema de células aunque FAK sitio de auto-fosforilación en Y397 se ha informado a ser importante para la actividad anti-apoptótica de FAK [38], [39] .
El protocolo experimental se ilustra en la Figura S1. frecuencias de transfección se comprueban mediante el uso de microscopía de fluorescencia y se confirmó que 80 a 90%. Las células se mantuvieron en medio libre de suero durante 24 a 72 h, se recogieron y se lisaron en tampón de muestra de SDS de Laemmli para el análisis de inmunotransferencia con anti-β-actina, anti-Bax, anti-Smac /DIABLO, anti-XIAP, anti- I? B-α, anti-NF-B, anti-JNK, anti-c-jun-P (S73), anti-c-jun, anti-FAK-P (Y397), y anti-FAK.
componentes CPC incluyendo survivina tienen una tendencia a asociar con la cromatina y, por tanto, se encuentran a menudo en el núcleo y son en su mayoría insoluble en detergente. Sin embargo, otra piscina intracelular de survivina se ha descrito en el citosol o asociadas con la mitocondria [40], [41]. Fue de especial interés cómo Survivin asociados con XIAP en una célula. A partir de experimentos tiempo-por supuesto, se encontró que la activación de la caspasa-3 6 h después de la inducción de la anoikis (Figura 1C). De acuerdo con ello, se utilizaron las células en el tiempo 0, 3, y 6 h después de la inducción anoikis para los experimentos de fraccionamiento subcelular para evitar interpretaciones erróneas que pueden surgir de la utilización de células muertas inducidos por anoikis. Inmunoblot análisis realizados tras el fraccionamiento subcelular reveló que XIAP se encuentra principalmente en la fracción soluble en detergente del citosol (Figura 4A,
IB: anti-XIAP
). Sin embargo, se encontró que la mayoría de EGFP-survivina en la fracción de sedimento insoluble en detergente que contiene la cromatina pero también se encontró en menor medida en las fracciones nucleares y citosólicas detergente soluble (Figura 4A,
IB: anti-survivina y IB :
anti-EGFP). Por lo tanto, una interacción de XIAP y survivina, obviamente, se restringió a la fracción soluble de detergente de la citosol. De hecho, encontramos una interacción proteína-proteína estable entre XIAP y survivina mediante la aplicación de experimentos de inmunoprecipitación utilizando la fracción citoplásmica soluble en detergente de CHE-p53 - células con la expresión ectópica de EGFP-survivina (Figura 4B) - /. Además, no etiquetados survivina se fraccionó con menor eficacia en la fracción citoplasmática y anoikis detergente soluble y la activación de la caspasa-3 también fueron suprimidas con menor eficacia en la no-etiquetada survivina-CHE-sobreexpresa p53 - /- las células. Por otro lado, un rojo fluorescente sobreexpresa-survivina-DsRed proteína marcada con survivina (survivina-DsRed) se fraccionó más eficazmente en la fracción y anoikis y la caspasa-3 también fueron suprimidas de manera más eficaz en citoplasmática detergente soluble CHE-p53- Discosoma /- células (nuestros datos no publicados) guía
a.. Fraccionamiento subcelular y análisis de inmunotransferencia de caspasa-3 activada, survivina, y XIAP. frecuencias de transfección se comprueban mediante el uso de microscopía de fluorescencia y se confirmó que 80 a 90%. Las células se mantuvieron en medio libre de suero durante 3-6 h, se recogieron, y se lisaron. El lisado celular se fraccionó en el detergente soluble citoplasmática (
C
) y nuclear (
N
) fracciones y la pastilla insoluble en detergente (
P
) fracción de análisis de inmunotransferencia con caspasa-3 activada contra-, anti-survivina, anti-GFP, anti-XIAP, anti-α-tubulina, anti-H3-histona, y anti-β-actina. B. Las interacciones proteína-proteína entre EGFP-Survivn y XIAP. lisado celular de la fracción citoplásmica soluble en detergente se inmunoprecipitó por el anticuerpo anti-XIAP y anticuerpo anti-GFP y, posteriormente, inmunotransferencia con anticuerpo anti-GFP (
panel inferior
) y anti-XIAP anticuerpo (
panel superior
), respectivamente. EGFP-survivina y XIAP fueron co-imunoprecipitated sólo en forma de células EGFP-survivina que expresan lisado celular (
carril 2
).
El detergente soluble citoplasmática survivina está involucrado en metastásico progresión del cáncer colorrectal humano
finalmente abordó la cuestión de si detergente soluble citoplasmática survivina, se encuentra en el cáncer humano y de alguna manera está relacionado con el desarrollo de la enfermedad metastásica. Se analizaron ocho líneas celulares de cáncer colorrectal, la línea celular de carcinoma de cuello uterino HeLa, y la línea celular de carcinoma 8505C throid por fraccionamiento celular e inmunotransferencia. Como control se incluyeron fibroblasto diploide embrionario normal (NHDF). Entre las líneas celulares de cáncer colorrectal, la survivina se encontró en las fracciones solubles en detergente, aunque los niveles de expresión variaban considerablemente (Figura 5A). Posteriormente, anoikis-susceptibilidad fue examinado en todas las líneas celulares de cáncer (Figura 5B). Aunque la magnitud de la contribución de survivina a la anoikis fenotipo resistente en células de cáncer colorrectal no está definido, existe una correlación directa entre los niveles más altos de expresión de la citoplasmática survivina y anoikis resistencia a los detergentes solubles en particular para las células HCT116 y HT29 con expresión más elevada de detergente fracción soluble del citoplasma. , NHDF, LoVo y SW480 células dignos de mención, en el que el detergente soluble survivina no era detectable, mostraron la muerte celular masiva después de la inducción de la anoikis.
A. Fraccionamiento subcelular y análisis de inmunotransferencia de survivina. El lisado celular de células de crecimiento exponencial se fraccionó en el detergente soluble citoplasmática (
C
) y nuclear (
N)
fracciones y el sedimento insoluble en detergente (
P
) fracción para el análisis de inmunotransferencia con anti-survivina, anti-α-tubulina, anti-H3-histona, y anti-β-actina. El nivel de survivina citoplásmica detergente soluble se estimó por análisis de inmunotransferencia, y se expresó como un porcentaje del nivel de 8505C, que es el carcinoma indiferenciado de tiroides que muestra la resistencia a la anoikis (+++, & gt; 80%; ++, 40-80%; +, 10 a 40%, -, & lt; 10%). susceptibilidad B. Anoikis en en células de cáncer colorrectal. Las células se suspendieron en medio libre de suero durante 72 h. La viabilidad celular se determinó por WST-1 de ensayo.
Qué comportamientos biológicos en el cáncer colorrectal se relacionan con detergente soluble survivina citoplásmica es importante para sus disponibilidades de diagnóstico o terapéuticos. En nuestros análisis inmunohistoquímicos anteriores de tejidos de cáncer colorrectal, la ausencia de survivina nuclear y citoplasmática la existencia de survivina han resultado ser predictores significativos de la mortalidad en pacientes con cáncer de colon [42]. Sin embargo, el análisis de la localización inmunohistoquímica y la detección fraccionamiento subcelular no son los mismos. Cinco muestras de normal y tejidos cancerosos primarios de los mismos pacientes correspondientes fueron examinados por los experimentos de fraccionamiento subcelular, pero independientemente de los niveles de survivina sobreexpresión, los casos positivos para la detección de la survivina citoplasmática detergente soluble fueron pacientes con ganglios linfáticos y otros distante metástasis. Aquí, se examinaron otros casos cuarenta. El esquema del método de detección se ilustra en la Figura S2. La Figura 6 muestra un resultado típico de dos pacientes con o sin la survivina citoplásmica detergente soluble en tejidos cancerosos primarios (caso A es un paciente sin metástasis y el caso B es un paciente con metástasis). Se determinó la importancia clínico-patológico de la expresión de survivina citoplasmática detergente soluble de los cuarenta casos. Los casos positivos se incrementaron significativamente en el tamaño del tumor (& lt; 0,005), el cáncer colorrectal primario con metástasis en los ganglios linfáticos (& lt; 0,001), y el cáncer colorrectal primario con metástasis a distancia (& lt; 0,01), en comparación con los casos negativos (Tabla 1) .
el oultline del método se ilustra en la Figura S6. tejidos normales y cancerosos de pacientes con cáncer colorrectal humano sin metástasis (
Caso A
) o con metástasis (
Caso B
) se zadas. El lisado celular se fraccionó en el detergente soluble citoplasmática (
C
) y nuclear (
N
) fracciones y la pastilla insoluble en detergente (
P
) fracción de análisis de inmunotransferencia con anti-survivina, anti-α-tubulina, anti-histona H3-y anti-β-actina.
Discusión
Hoy en día, es por unanimidad acepta que la survivina es un componente esencial de la regulación de la segregación CPC chromomal y la citocinesis [2], aunque el papel exacto de survivina en la mitosis aún no se comprenden totalmente. Las células con deterioro de la función de survivina o de uno de sus socios debido a la inhibición o la expresión de mutantes dominantes negativos RNAi mediada mostraron fenotipos comparables (es decir, la segregación perturbado de los cromosomas y la citocinesis defectuosa) [25], [26], [28] , [43], [44], [45]. Por otra parte, los fenotipos de survivin mutantes knock-out en levaduras [46], [47] y
C. elegans
[48], [49] confirmó el papel de la survivina como CPP. En los vertebrados, el papel esencial de survivina durante la mitosis se ha demostrado en
Xenopus laevis
[3] y ratones [50]. Por otra parte, varios estudios revelaron una función anti-apoptótica de survivina en diferentes especies y líneas celulares. Se informaron los efectos anti-apoptóticos de survivina y de la proteína survivina-como Deterin en la levadura [51] y
D. melanogaster
[52], respectivamente. Sin embargo, la sobreexpresión de survivina podría actuar como un factor anti-apoptótica incluso en no vertebrados bajo ciertas condiciones, pero parece concebible que los fenotipos survivina-knockout que fueron interpretados como pérdida de la función anti-apoptótica podrían estar vinculados principalmente a procesos mitóticos desregulados .
En los sistemas celulares cultivadas, una mayor susceptibilidad apoptótica, que apareció de forma espontánea o por agentes apoptóticos, es conferida por la pérdida de la función o knock-down de survivina. Survivina ronda en un linaje de células T fenotipos dependientes de p53 inducida, lo que resulta en timocitos defecto en el desarrollo [53]. Este fenotipo no podía ser rescatado por la inactivación de p53, lo que sugiere que la survivina es probable que sea un factor anti-apoptóticos, independientemente del estado de p53. En fibroblastos humanos normales, survivina knock-down de inducción de p53 inducida también, lo que provocó la detención del ciclo celular y sin la apoptosis inmediata [54]. Este fenotipo fue rescatado por la inactivación de p53, lo que sugiere que la survivina es probable que funcione a través de p53 bajo condiciones de cultivo adherente. Estos diferentes resultados están ocultando información para la comprensión de la protección inducida por la survivina de la apoptosis. Los diferentes tipos de células, las células adherentes y las células no adherentes, son diferentes en fenotipos inducida por p53. Las células no adherentes con p53 normal de predisponen a celular inducida por el estrés apoptosis inmediata [55], la llamada interfase muerte celular, en comparación con las células adherentes, mientras que las células adherentes con p53 detienen principalmente el ciclo celular [56], [57]. Survivina ronda induce p53 tanto en las células adherentes y no adherentes, en consecuencia la expresión de los fenotipos para cada tipo de las células. En nuestra hipótesis de que es apoyado por nuestro estudio, la survivina es la inhibición de anoikis preferentemente en las células sometidas a la supervivencia y el crecimiento independientemente del estado de p53 dependiente de anclaje.
Cuando se expone al agente que daña el ADN etopósido, survivina noqueado DT40 células mostraron sensibilidad normal a este agente [29]. Los datos sugieren que la survivina no es un inhibidor universal de la apoptosis inducida por agentes que dañan el ADN. Aquí observamos sensibilidades normales de IR y UV-C en la survivina sobreexpresan CHE-p53 - /- las células. En nuestra opinión, la survivina tendría un papel importante en la supresión anoikis para el desarrollo del cáncer (véase más adelante).
De acuerdo con los informes anteriores, se muestra aquí que la survivina regula la actividad de caspasa-3. Se ha informado de que la survivina inhibe la activación de caspasa-3 en situaciones fisiológicas durante la apoptosis, pero este efecto probablemente no se debe a la inhibición directa de la caspasa-3 [58], [59], [60]. Por lo tanto el mecanismo anti-apoptótica precisa de survivina todavía sigue siendo un reto. Se han propuesto dos mecanismos para explicar la inhibición de la apoptosis mitocondrias regulado resulta en la activación de la caspasa-3. La molécula más estudiado de esto es una proteína pro-apoptótica Smac /DIABLO, a la que se une directamente survivina [34]. parece poco probable una interacción mediada por DIABLO Smac /con survivina para reprimir anoikis ya que en nuestro entorno experimental solamente poca o ninguna expresión de Smac /DIABLO durante la anoikis de Che-células se detectó (Figura 3). El segundo mecanismo de cómo survivina cumple su función IAP es una unión directa a XIAP [36].