Extracto
Antecedentes
No muscular cáncer de vejiga invasivo (CVNMI ) tiene la tasa de recurrencia más alta de cualquier malignidad y hasta el 70% de los pacientes experimentan una recaída. la metilación del ADN aberrante está presente en todos los tumores de la vejiga y se puede detectar en muestras de orina. Estudios previos han identificado marcadores de metilación del ADN que mostraron valor diagnóstico significativo. Se evaluó la significación de los biomarcadores para la detección precoz de la recidiva tumoral en la orina.
Metodología /Principales conclusiones
Los niveles de metilación de
Eomes
,
Hoxa9
,
POU4F2
,
TWIST1
,
VIM, España y
ZNF154 Hoteles en muestras de orina se midieron mediante PCR en tiempo real (MethyLight). Se analizaron 390 sedimentos de orina de 184 pacientes con diagnóstico de CVNMI. se utilizó orina de 35 emparejados por edad los individuos de control para determinar los niveles de metilación de línea de base. La recurrencia se diagnostica mediante cistoscopia y verificado por la histología. Inicialmente, se comparó la orina de pacientes con cáncer de vejiga y de los individuos sanos y detectada la hipermetilación significativa de los seis marcadores (P & lt; 0,0001) la consecución de la sensibilidad en el rango de 82% -89% y la especificidad en el rango de 94% -100%. Siguiendo, se validó la hipermetilación de orina para su uso en la vigilancia de la recurrencia y encontramos sensibilidad de 88-94% y especificidad de 43-67%.
Eomes
,
POU4F2
,
VIM
y
ZNF154
se metilado con mayor frecuencia en la orina de los pacientes con tumores de grado alto (P≤0.08). Univariado de Cox análisis de regresión mostró que cinco marcadores se asociaron significativamente con la recurrencia de la enfermedad;
Hoxa9 gratis (HR = 7,8; p = 0,006),
POU4F2 gratis (HR = 8,5; p = 0,001),
TWIST1 gratis (HR = 12,0, p = 0,015) ,
VIM gratis (HR = 8,0; p = 0,001), y
ZNF154 gratis (HR = 13,9, P & lt; 0,001). Curiosamente, para un grupo de pacientes (n = 15), se encontró que la hipermetilación estaba constantemente presente en las muestras de orina a pesar de la ausencia de recidivas tumorales, lo que indica la presencia de un defecto del campo.
Conclusión /Importancia
Los niveles de metilación de
Eomes
,
Hoxa9
,
POU4F2
,
TWIST1
,
VIM, España y
ZNF154 Hoteles en muestras de orina son prometedores biomarcadores de diagnóstico para la vigilancia de la recurrencia del cáncer de vejiga
Visto:. Reinert T, Borre M, Christiansen a, Hermann GG, Ørntoft TF, Dyrskjøt L (2012) diagnóstico de cáncer de vejiga recurrencia sobre la base de los niveles urinarios de
Eomes
,
Hoxa9
,
POU4F2
,
TWIST1
,
VIM, España y
ZNF154
hipermetilación. PLoS ONE 7 (10): e46297. doi: 10.1371 /journal.pone.0046297
Editor: Brock C. Christensen, Escuela Geisel de Medicina de Dartmouth, Estados Unidos de América
Recibido: Junio 7, 2012; Aceptado: 29 Agosto 2012; Publicado: 3 Octubre 2012
Copyright: © Reinert et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Fundación John y Birthe Meyer, el Consejo danés de Investigación Independiente, la Fundación Lundbeck, la Fundación Novo Nordisk, una subvención de la UE para UROMOL Consorcio no. 201.663, la Sociedad Danesa del Cáncer, la Universidad de Aarhus, y el Ministerio del Interior y de Salud de Dinamarca. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de la vejiga urinaria es la quinta neoplasia más común en los países industrializados. En aproximadamente el 75% de todos los casos, los pacientes se presentan con el estadio Ta o no músculo invasivo cáncer de vejiga T1 (CVNMI), mientras que el restante 25% de los tumores será el escenario invasivo muscular T2-4 cánceres (MIBC) [1] . Alrededor del 60% -70% de los pacientes con experiencia CVNMI recurrencias del tumor dentro de los 3 años después de la resección [2], [3] y los pacientes pueden desarrollar tumores recurrentes cada año desde hace muchos años sin progresión de la enfermedad. Sin embargo, hasta un 25% progresará a una enfermedad invasiva del músculo [4]. La alta tasa de recurrencia y el riesgo de progresión impulsan la necesidad de una vigilancia frecuente y larga, por lo que el cáncer de vejiga es el cáncer más costosas de tratar [5], [6]. Después de la resección del tumor primario, los pacientes son frecuentemente controlados por cistoscopia y citología. Las biopsias tomadas durante la cistoscopia son el estándar de oro para el diagnóstico de los tumores de vejiga. La sensibilidad de la cistoscopia para CVNMI está cerca de un 80% para la cistoscopia con luz blanca, y el 96% cuando se usa el, cistoscopia guiada por fluorescencia utilizando hexaminolevulinato más costoso (HAL). Para la detección de la displasia y carcinoma in situ (CIS), la sensibilidad de la cistoscopia con luz blanca disminuye al 48% y 68%, respectivamente; mientras que la sensibilidad de cistoscopia con HAL para estas lesiones se mantiene en el rango de 93% -95% [7] - [9]. La citología se utiliza a menudo en combinación con la cistoscopia, debido a la alta especificidad del 99% (0,83 hasta 0,997; IC del 95%), pero con una baja sensibilidad del 34% (0,20 a 0,53; IC del 95%). La sensibilidad de la citología aumenta para los tumores de etapa alta y de calidad, sobre todo en los tumores primarios [10]. Se ha propuesto que un defecto en el campo de la vejiga puede ser la causa de la elevada frecuencia de las recidivas tumorales en pacientes con cáncer de vejiga [11]. Varios cambios moleculares han demostrado estar presente en las zonas que aparecen normales del urotelio en pacientes con cáncer de vejiga [12], [13], y recientemente se ha descrito un defecto del campo epigenética [14].
epigenética es la estudio de los cambios mitóticamente y /o meiotically heredables en la expresión génica que no se pueden explicar por los cambios en la secuencia de ADN [15]. La metilación del ADN es un mecanismo epigenético bien estudiado que participan en los procesos normales como el desarrollo, la impronta genómica, y X-inactivación del cromosoma [16] - [18]. Las alteraciones en la metilación del ADN se han asociado con varios trastornos patológicos humanos, incluyendo el cáncer [19], y la inactivación transcripcional por hipermetilación aberrante es un mecanismo bien establecido para el silenciamiento de genes en los cánceres de vejiga [20] - [23]. Identificación de marcadores de metilación del ADN para la detección de cáncer de vejiga ha estado en curso desde hace algunos años. Varios estudios han reportado altas sensibilidades y especificidades de estos marcadores, haciéndolos potencialmente útiles como marcadores de diagnóstico para el cáncer de vejiga [24] - [31]. En un estudio anterior hemos identificado una serie de marcadores de metilación del ADN (
Eomes
,
Hoxa9
,
POU4F2, España y
ZNF154
) que mostraron potencial diagnóstico valor en las muestras de orina de pacientes con CM [26].
ahora validó el valor diagnóstico y pronóstico de estos biomarcadores junto con reportado anteriormente
TWIST1
[25] y
VIM
[30] en las muestras de orina. Inicialmente, para validar la importancia de los marcadores de metilación seleccionados, y para determinar los valores de corte de marcador, se comparó la primera muestra de orina de cada paciente con CVNMI de las muestras de orina de individuos sanos. A continuación se evaluó el valor diagnóstico y pronóstico de los marcadores para la detección precoz de la recidiva del tumor a partir de muestras de orina obtenidas en posteriores visitas de seguimiento.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
consentimiento informado, se obtuvo de todos los pacientes, y los protocolos de investigación fueron aprobados por los comités centrales Dinamarca Región de Ética de la investigación Biomédica.
paciente material
se recogieron un total de 652 muestras de orina espontánea en el Departamento de Urología del hospital Universitario de Aarhus, de 390 pacientes con cáncer de vejiga y 47 individuos con hiperplasia o cálculos en la vejiga prostática benigna, pero sin antecedentes de cáncer de vejiga (individuos de control). De éstos, se excluyeron 227 muestras, ya que la cantidad de ADN estaba por debajo de nuestro umbral (Suppl. Tabla 1), que dejó 425 muestras (390 muestras de 184 pacientes con CM y 35 de individuos control) (Tabla 1 y Supl. Figura 1). De diez a cincuenta ml de orina se recogió en las visitas regulares de seguimiento. Las muestras de orina se recogieron inmediatamente antes de la cistoscopia; las células se sedimentaron por centrifugación, y se congelaron a -80 ° C. Los tumores se clasifican de acuerdo con el sistema TNM [32] y clasificados de acuerdo a Bergkvist [33]. Quince de los individuos de control eran Stix positivas de nitrito en la orina indica una infección bacteriana. tratamiento de los pacientes y el seguimiento se realizaron de acuerdo con las directrices de la Asociación Europea de Urología [34].
Extracción de ADN y bisulfito de modificación
Se extrajo el ADN con el Virus QIAsymphony las bacterias /kit Midi (96) (Qiagen) utilizando el instrumento QIAsymphony® SP y empleando el protocolo Complex800_V5_DSP. Quinientos nanogramos de ADN fue modificado usando EZ-96 ADN D5004 metilación (Zymo Research) de bisulfito de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y se eluyó en 60 l de tampón de elución y se almacena a -20 ° C hasta su uso.
Real- tiempo de reacción cuantitativa de metilación específicos de cadena de polimerasa (MethyLight)
El análisis de metilación
se ha realizado mediante MethyLight [35]. Los cebadores y sondas para los seis genes de interés fueron diseñados para incluir ocho a diez dinucleótidos CpG (Suppl. Tabla 2). Para la normalización de material de entrada de ADN, se utilizó la secuencia de elemento de repetición ALU-C4 [36]. qPCR amplificaciones se llevaron a cabo con la TaqMan PCR Universal Master Mix No AmpErase (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en duplicados usando 2 l (5 ng) de ADN con bisulfito modificado en un volumen final de 5 l en placas de 384 pocillos en un sistema ABI 7900 HT Fast real Time PCR (Applied Biosystems). Si los duplicados fueron inconsistentes, siendo positivo para la metilación y uno negativo para la metilación de un replicado, se repitió el análisis. La muestra fue excluida en relación con ese marcador específico si se obtuvo otro resultado inconsistente. protocolos de amplificación se enumeran en suppl. Tabla 2. Los datos de amplificación se analizaron por el sistema de detección de secuencias (SDS 2.4, Applied Biosystems). Cada placa incluyó una dilución en serie (25-0.04ng) de ADN completamente metilado: DNA metilado universal ™ CpGenome) (Millipore) con el gen de interés y ALU-C4, varios no controla plantilla pozos (NTC), 5 nanogramos de un metilado muestra de control [ADN metilado universal ™ CpGenome (Millipore)], y la muestra no metilada que consiste en ADN de todo el genoma de ADN amplificado a partir de sangre periférica. El porcentaje de referencia metilado (PMR) se calculó para cada muestra de acuerdo con la ecuación: 100 x [(valor de copias de genes-x) muestra /(ALU-C4 valor de copia) de la muestra] /[(valor de copias de genes-x) universal metilado ADN /(valor ALU-C4copy) ADN metilado universal].
Análisis estadístico
Stata 11 (Statacorp, Texas, EE.UU.) se utilizó para todos los cálculos estadísticos. Dos de cola-pruebas se consideraron estadísticamente significativas si p & lt; 0,05. diferencias de metilación se evaluaron mediante la prueba no paramétrica de Wilcoxon-Mann-Whitney. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para el análisis de las variables dicotómicas. La prueba exacta $ x ^ 2 $ se utilizó para el análisis de las asociaciones entre los parámetros clínico-patológica con dos o más categorías. Las correlaciones de los niveles de metilación de los marcadores se calcularon con coeficientes de correlación de Spearman. Una curva ROC se realizó para cada marcador y combinaciones de marcadores mediante el trazado de la sensibilidad contra (1-especificidad) y el área bajo la curva (AUC) se calculó. log-rank pruebas se aplicaron para evaluar la igualdad de supervivencia y gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier fueron utilizados para la visualización. Se utilizó un análisis de regresión de Cox univariante para analizar las asociaciones de edad, sexo, estadio, el grado, la multiplicidad, y la CEI con la supervivencia libre de recurrencia
Resultados
Nuestro análisis se dividió en dos partes:. 1 ) para establecer el nivel de corte de los marcadores de metilación y para demostrar la importancia de los marcadores seleccionados se analizó la primera muestra de orina de cada paciente y se comparó con el control de las muestras de orina de individuos sanos; 2) el uso de los niveles límite determinados marcador que luego validó el valor diagnóstico y pronóstico de los marcadores de metilación en muestras de orina tomadas durante la vigilancia del paciente.
Establecimiento de niveles de corte de prueba y validación inicial del marcador Importancia
Inicialmente, definimos los niveles de corte por el nivel de metilación media de cada marcador 2x + desviación estándar del nivel de metilación en muestras de orina de 35 individuos de control (sólo las muestras con valores por encima de metilación se incluyeron cero). Los niveles de corte (valores PMR - ver materiales y métodos) utilizados para dicotomizar los marcadores de metilación fueron:
Eomes
= 0,348,
Hoxa9
= 0,077,
POU4F2
= 0,371 ,
TWIST1
= 0,405,
VIM = 0,368
, y
ZNF154
= 1,51. Otros niveles de corte (media + 1xSD y + 3xSD) en base a los niveles de metilación en muestras de orina de control se consideraron inicialmente (resultados no mostrados). Para validar la significación de los marcadores para el diagnóstico del cáncer de vejiga se comparó la primera muestra de orina de 184 pacientes diagnosticados con NMIB a las muestras de orina de 35 individuos de control (Tabla 1). Todos los seis marcadores fueron muy significativamente hiper-metilado en la orina de pacientes con CVNMI en comparación con la orina de individuos sanos (Mann-Whitney, P & lt; 0,0001) (Tabla 2). Se observaron mejores sensibilidades de los marcadores en el análisis de muestras de orina de pacientes con un tumor incidente en comparación con la orina de pacientes con un tumor recurrente (Suppl. Tabla 3). No se observó ninguna asociación entre los marcadores individuales y el estadio del tumor, pero
Eomes
,
POU4F2
,
VIM
, y
ZNF154
eran más metilado en el grado lesiones III en comparación con las lesiones de grado I (prueba exacta de Fisher, P≤0.048) (Supl. Tabla 4).
Eomes
,
POU4F2, España y
ZNF154
eran menos metilado en los tumores con un tamaño inferior a 3 cm. (Prueba exacta de Fisher, P≤0.047) (Supl. Tabla 4).
La detección de recurrencias por metilación marcadores
Hemos validado la utilidad clínica de los marcadores para la vigilancia del cáncer de vejiga. Se estratificó nuestro análisis para incluir sólo los pacientes que inicialmente mostraron hipermetilación de uno o más marcadores de metilación. Dependiendo del marcador estudiado, 11-18% de los pacientes no mostró metilación en la primera tumor y por lo tanto no se incluyó. Esto restringe el análisis a 158 pacientes y 206 muestras de orina de las visitas de seguimiento; 139 muestras de orina eran de pacientes con un tumor de vejiga recurrente y 67 muestras de orina fueron de pacientes sin recurrencia del tumor (Tabla 1). El empleo de los puntos de corte determinados inicialmente utilizando la orina de individuos sanos; obtuvimos sensibilidades en el intervalo de 87% a 94%, y especificidades en el intervalo de 28% a 47% (Tabla 3). En comparación, la sensibilidad de la citología fue del 77% y la especificidad fue del 60%. No se observaron asociaciones significativas entre los niveles de metilación y las variables clínico-patológicas de esta cohorte de pacientes con tumores recurrentes (Supl. Tabla 5).
Las pruebas moleculares pueden tener una sensibilidad más alta en comparación con la cistoscopia estándar de oro. Para hacer frente a esto, por lo tanto utilizamos los resultados de cistoscopia de un período de 12 meses a partir de la orina se tomaron muestras. Encontramos muchas de las muestras anteriormente clasificados como positivos falsos para ser verdaderos positivos; les bastó un tiempo de espera positivo en comparación con la cistoscopia. La sensibilidad obtenida varió de 88% a 94%, y la especificidad varió de 43% a 67% (Tabla 4). Incluyendo tumores diagnosticados durante un período de seguimiento de 12 meses y la combinación de dos marcadores con el requisito de que ambos marcadores fueron positivos para una prueba positiva como resultado la disminución de la sensibilidad (rango: 86-93%), mientras que la especificidad aumentó (rango: 50-73 %). Si sólo uno de los dos marcadores debe ser positivo, la sensibilidad aumentó (rango: 92 a 98%), mientras que la especificidad disminuyó (intervalo: 29-60%) (.. Suppl Tabla 6 y Tabla 7 Suppl, respectivamente). En general, las combinaciones de marcadores no mejoró la sensibilidad y especificidad de las pruebas.
Valor pronóstico de la metilación marcadores para predecir la tarde recurrencias
A fin de abordar el valor pronóstico de los marcadores de metilación que analizaron las muestras de orina de pacientes en las visitas donde no hay tumores fueron diagnosticados con ayuda de la cistoscopia. Para todos los marcadores, se encontró que un marcador positivo en una visita a un tumor negativo se asoció significativamente con la recidiva tumoral después durante 24 y 60 meses los períodos de seguimiento (log-rank test, P≤0.04) (Figura 1 y Supl. La figura 3). Se observaron las diferencias más significativas en el plazo de 24 meses para
POU4F2
y
ZNF154 gratis (log-rank test, P & lt; 0,0001), donde sólo el 12% (3/25) y 8% (2/26) sin metilación experimentó una recurrencia dentro de 2 años, respectivamente. Para las muestras de metilación positivo el porcentaje de pacientes con recidiva después fue del 68% (21/31) de
POU4F2
y el 63% (20/32) de
ZNF154
. Univariado de Cox análisis de regresión mostró que
Hoxa9 gratis (HR (95% IC) = 7,8 (1.8-33.7)),
POU4F2 gratis (HR (95% IC) = 8,5 (2,5-28,5) ),
TWIST1 gratis (HR (95% IC) = 12,0 (1.6-88.6)),
VIM gratis (HR (95% IC) = 8,0 (2.4-26.8)), y
ZNF154 gratis (HR (IC del 95%) = 13,9 (3.3-59.7)) se asociaron significativamente con la supervivencia libre de recidiva. La edad, el género, la etapa anterior, grado anterior, la multiplicidad anterior, y la CEI anteriores no se asociaron significativamente con la supervivencia libre de recurrencia (P & gt; 0,05). En consecuencia, la presencia de una metilación alterada de ADN en la orina parecía estar fuertemente relacionado con el pronóstico.
metilación del ADN se asocia con la posterior recurrencia del tumor dentro de 24 meses para los pacientes sin tumor pero con muestras de orina de metilación positivo. De Kaplan-Meier parcelas de supervivencia libre de recurrencia en función de los niveles de metilación en dicotomía de
Eomes gratis (P = 0,0397) (A),
Hoxa9 gratis (P = 0,0009) (B),
POU4F2 gratis (P & lt; 0,0001) (C),
TWIST1 gratis (P = 0,0017) (D),
VIM gratis (P = 0,0001) (e), y
ZNF154 gratis (P & lt; 0,0001). (F) guía empresas
la identificación de pacientes con un posible campo de defectos epigenéticos
Si la metilación de los biomarcadores se limitaba a las células malignas, sólo debe detectar los marcadores en la orina cuando un tumor estaba presente, o que se presenta dentro de un futuro previsible en función de la tasa de crecimiento del tumor. Sin embargo, nuestros resultados mostraron que incluso los altos niveles urinarios de metilación podrían estar presentes en las visitas sin recidivas (Suppl la Figura 2, los pacientes C y D;.. Suppl Figura 3). Fue posible identificar un grupo de 15 pacientes (31%) en la que la metilación estaba presente en la orina en la primera visita y continuó a estar presentes en las muestras de orina tomadas en posteriores visitas de seguimiento, aunque no se produjo ningún tumor. A modo de ejemplo, un paciente metilación positiva con el seguimiento más prolongado fue diagnosticado con la CEI después de 118 meses, pero no presentaban lesiones en el medio. Los 15 pacientes con un defecto del campo, pero no se repitan, tienen un número significativamente menor de tumores en las visitas anteriores (P = 0,02) en comparación con los pacientes con recurrencia de la enfermedad.
Modificado de Hermann GG et al. (Http://skejby.net/Webudgaven/DaBlaCa2010.htm.).
Discusión
En este estudio se realizó una validación independiente de
Eomes
,
Hoxa9
,
POU4F2
,
TWIST1
,
VIM
, y
ZNF154
metilación para el diagnóstico urinaria en la vigilancia del cáncer de vejiga. Se obtuvieron sensibilidades en el rango de 87% -93% y especificidades en el rango de 28% -47%. Si se incluyen los tumores resecados en un período de seguimiento de 12 meses obtuvimos sensibilidad en el rango de 88% -94% y especificidades en el rango de 43% -67%. El análisis de regresión de Cox univariante mostró que los marcadores de metilación predijeron recurrencias futuras con las proporciones de riesgo en el rango de 7,8 a 13,9 (P≤0.015). etapa anterior, el grado, la multiplicidad y la CEI no se asociaron significativamente con la recidiva tumoral. Curiosamente, también se observó que algunos pacientes con cáncer de vejiga sin recurrencia todavía mantienen la metilación aberrante urinaria que los distinguía de los individuos de control. Creemos que esto puede ser causado por una alteración general de mucosa vesical epigenética.
Los controles aplicados en este estudio fueron de pacientes con hiperplasia benigna de próstata (HBP) o cálculos en la vejiga y el 43% de los controles fueron positivos nitrito, indicando infecciones de la vejiga. Algunas de las células en la orina de los controles pueden proceder de la hiperplasia, o pueden ser células inmunológicas o bacterianas. muestras de control similares se aplican cuando los marcadores se investigaron inicialmente como marcadores de cáncer de vejiga, lo que sugiere que la frecuencia de metilación de los marcadores seleccionados es baja en estos tipos de células [25], [26], [30]. Las células de la próstata o de una infección de la vejiga aún puede sesgar los resultados obtenidos por dilución de las células tumorales. Esto podría dar lugar a resultados falsos negativos de la prueba. Las infecciones bacterianas son mucho menos comunes y en nuestras infecciones del estudio no se asociaron significativamente con la metilación del marcador, lo que indica que las infecciones no influyeron en la sensibilidad del marcador (Suppl. Tabla 4).
Es de destacar que sólo el 9% de la recurrencias son de grado I. por lo tanto las sensibilidades calculadas de los marcadores pueden ser más altos en comparación con las sensibilidades que se obtendrían a partir de una serie consecutiva de pacientes de bajo riesgo con un número mucho mayor de los tumores de grado I.
una de las principales retos que utilizan marcadores urinarios está recibiendo suficientes células tumorales, y mientras MethyLight es un método muy sensible que todavía tenía que excluir a 227 (35%) muestras del estudio debido a una cantidad insuficiente de ADN. Hemos observado que si se incluyeron las muestras con menos de 5 ng de ADN como plantilla en el análisis, la sensibilidad disminuye, y para los pacientes bajo vigilancia la especificidad aumentado. Al excluir a los pacientes sobre la base de la cantidad de ADN extraído de las muestras de orina espontánea, mantenemos la integridad del ensayo MethyLight a costa de introducir un sesgo en los que se excluyen especialmente los pacientes con tumores en estadio Ta grado I, como lesiones de grado I exfoliar la más pequeña número de células [37] (prueba exacta de Fisher, P & lt; 0,05) (Suppl. Tabla 1). Recientemente, un estudio realizado por Zuiverloon et al. informado de un aumento en la sensibilidad de la
FGFR3 mutación
como marcador de recidiva tumoral del 75% al 100% cuando se aumentó el volumen de orina utilizada para la prueba [38]. Al aumentar el volumen de orina recogida a partir de los actuales 10 a 50 ml, menos muestras tendrán que ser excluidos [39], [40]. Otras posibilidades para mejorar el ensayo para la detección de metilación puede incluir el análisis de dos o más muestras por separado o utilizar otra tecnología que MethyLight (por ejemplo, PCR anidada).
La prueba de marcadores de metilación puede ser complementada por
FGFR3
análisis de la mutación.
FGFR3
mutaciones están presentes en aproximadamente el 70% -80% de bajo grado CVNMI, y las mutaciones en el
FGFR3
gen han demostrado ser detectable en ADN de orina evacuada [41], [42]. Al igual que en el análisis de metilación, la
FGFR3
análisis se basa en el ADN, y la visita primario se puede usar para estratificar la presencia de la mutación. Estudios recientes con
FGFR3 mutaciones
solamente para detectar recurrencias CVNMI reportan una sensibilidad del 58% para las recurrencias concomitantes. La sensibilidad aumenta cuando los 12 meses de seguimiento se incluyeron [43]. La combinación de
FGFR3
mutaciones y marcadores de metilación ha sido probado por Serizawa y col., Y se observó un aumento de la sensibilidad del ADN a partir de la orina espontánea cuando la combinación de marcadores de metilación y
FGFR3 mutaciones [44
]. Es de destacar que se observó una correlación inversa entre la hipermetilación y
FGFR3
mutaciones.
El hecho de que nos encontramos ninguna asociación entre la metilación y las variables clínico-patológicas cuando sólo se utiliza la orina de los pacientes con tumores recurrentes es intrigante , pero puede ser que la menor sensibilidad observada en tumores de bajo grado no sólo es causada por algunas células tumorales exfoliadas en la orina, sino más bien que la hipermetilación no está presente en el tumor o en el urotelio circundante, y estratificando para la metilación en una visita anterior se excluyen estos pacientes. Es posible que los pacientes sin metilación deben ser considerados como un grupo distinto de tumores de vejiga. Por último, la falta de asociación entre las variables de metilación y clínico-patológicos también puede ser una consecuencia de la relativamente pequeña de datos.
Los marcadores de metilación han valores de especificidad en el rango de 43% a 67%, lo cual es bajo teniendo en cuenta que todos ellos tienen entre 94% de especificidad tumor -100% en comparación con los individuos de control. Una baja especificidad equivalente se observó en un estudio de investigación de los niveles de mRNA de hTERT, SENP1, PPP1CA, y MCM5 en la orina obtenidas de pacientes durante la vigilancia de la enfermedad [45]. Baja especificidad también se observó por Zuiverloon et al. cuando se estudia
FGFR3
mutaciones para detectar recurrencias del cáncer de vejiga [38]. Además, la baja especificidad de los marcadores de metilación se informó previamente en otro lugar por dos estudios dirigidos a la detección de recurrencias CVNMI [46], [47].
La metilación observados en muestras de orina de visitas cistoscopia negativa puede tener varias fuentes, ( i) un pequeño tumor no se detecta mediante cistoscopia, (ii) las células tumorales residuales en el sitio de la resección, o (iii) que pueden ser un síntoma de células uroteliales epigenetically modificados presentes en el urotelio que rodea el tumor o en otros lugares (defecto del campo ) que no tienen ningún fenotipo para distinguirlas de las células uroteliales normales - una epigenética methylator fenotipo urotelial [14]. Algunas de las muestras positivas falsas con una recurrencia dentro de los 12 meses después de la cistoscopia son causados probablemente por los tumores perdidas o las células tumorales residuales, pero para el resto de las muestras de falsos positivos es poco probable esta explicación y nuestros resultados se corresponden bien con la presencia de una vejiga defecto del campo. Datos recientes apoyan la noción de que hay un defecto en el campo hipermetilación del ADN en las vejigas de pacientes de BC donde el tejido de aspecto normal contiene generalizada la metilación del ADN [14]. Wolff y colaboradores sugieren que la metilación aberrante no es debido a la expansión clonal, pero en cambio es causado por la alteración epigenética generalizada en el urotelio a través de la vejiga. Se ha sugerido que este campo extendido de urotelio de apariencia normal metilado aberrante puede ser el origen de la alta tasa de recurrencia en el cáncer de vejiga [14].
Con el descubrimiento de marcadores de metilación con una sensibilidad muy alta, la implementación de marcadores de metilación en la vigilancia de los pacientes con bajo grado CVNMI parece probable. En el momento del diagnóstico, el nivel de metilación de cada marcador de la metilación tiene que ser establecido antes de que el marcador se puede aplicar para la vigilancia. Antes de la próxima visita de control, el paciente puede suministrar una muestra de orina para el análisis, y existen tres resultados posibles: i) si la prueba es positiva habrá una cistoscopia hecho el paciente, y en 67 pacientes de cada 100 de un tumor recurrente se encontrará, mientras que los 33 pacientes restantes no tendrán una recurrencia del tumor. Esto no es un problema importante, ya que los pacientes positivos falsos habrían tenido una cistoscopia hecho en cualquier caso; ii) una prueba negativa permitirá que los pacientes que se saltan la cistoscopia actual. Con el rendimiento actual del análisis, 94 de cada 100 pacientes BC con una recurrencia del tumor se diagnostica correctamente y seis pacientes se diagnostican erróneamente como no tener una recurrencia del tumor. Esta cantidad de falsos negativos es comparable con la cistoscopia guiada por HAL y mejor que la cistoscopia con luz blanca, donde 20 pacientes se puede esperar a ser diagnosticados erróneamente como no tener una recurrencia del tumor [7] - [9]. Sin embargo, en este estudio el
ZNF154
marcador no pudo diagnosticar dos tipos de cáncer vesical infiltrante que progresaron a partir de dos tumores de grado III T1. Esto no sería aceptable en un entorno clínico, e indica que los pacientes con un alto riesgo de progresión (por ejemplo, todos los T1, tumores de grado III o CIS) tienen que continuar con el régimen de tratamiento regular. Otra opción podría ser utilizar una más conservadora de corte. Mediante la definición de los valores de corte como la media más 1x desviación estándar del nivel de metilación, los dos tumores invasivos del músculo no se habrían perdido; iii) una muestra de orina con el ADN insuficiente debería conducir a la continuación del régimen de tratamiento original. En los tres casos el paciente va a suministrar una nueva muestra de orina antes de la próxima visita de control que va a determinar si el paciente debe tener una cistoscopia realizada. Los marcadores de metilación también pueden aumentar la tasa de detección de lesiones de la CEI, como una prueba positiva con una cistoscopia negativa, entonces podría ser seguida por otra cistoscopia incluyendo HAL.
En conclusión, mediante la aplicación de una metodología muy sensible y semi-cuantitativa para la detección de recurrencias de cáncer de vejiga y la estratificación de estado de metilación del tumor inicial, hemos demostrado que el uso de un único marcador (
ZNF154
) podemos detectar una recurrencia del tumor concomitante con una sensibilidad de 94% y una especificidad del 67 %. De acuerdo con las directrices de la EAU sobre CVNMI, el régimen de tratamiento actual para los pacientes de bajo riesgo CVNMI es la cistoscopia a los 3 y 12 meses después de la RTU y después cada año durante 4 años adicionales [48]. Este estudio sugiere que los marcadores de metilación pueden ser utilizados como marcadores de recurrencia del cáncer de vejiga para reducir el número de cistoscopías en pacientes de bajo riesgo que no tuvieron tumor concomitante (Figura 2) y por lo tanto mejorar la calidad de vida de los pacientes, así como la asistencia sanitaria disminución gastos.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Diagrama de flujo que ilustra el flujo de las muestras durante el curso del estudio.
doi: 10.1371 /journal.pone.0046297.s001 gratis (EPS)
figura S2.
ejemplos de los niveles de metilación en la primera visita y dos visitas posteriores para 5 pacientes con o sin recurrencias. Los pacientes con dos recurrencias posteriores (A y B). Paciente sin recurrencias en la primera visita de control, pero la recurrencia en una posteriores visitas de control (C y D). Un paciente sin recurrencias posteriores (E). PMR es el porcentaje de referencia relativa. Un valor de 0% significa que no hay metilación y un valor del 100% significa totalmente metilado. Una barra oscura representa una visita con el tumor concomitante y una barra gris representa una visita sin tumor
doi:. 10.1371 /journal.pone.0046297.s002 gratis (EPS)
Figura S3.
de Kaplan-Meier trama del tiempo hasta la recurrencia. la metilación del ADN está asociada con la recurrencia del tumor posterior dentro de los 60 meses para los pacientes sin tumor pero con muestras de orina positivas de metilación.