Extracto
Antecedentes
El diclofenac es uno de los fármacos antiinflamatorios más antiguos de utilizar. Además de su inhibición de las ciclooxigenasas (COX), diclofenaco inhibe de forma potente la fosfolipasa A
2 (PLA
2), produciendo de este modo un amplio efecto anti-inflamatorio. Dado que la inflamación es un factor importante en el desarrollo de los tumores pancreáticos hemos explorado el potencial de diclofenac para inhibir el crecimiento tumoral en ratones inoculados con células PANCO2 ortotópica.
Metodología /Principales conclusiones
Se encontró que el diclofenaco tratamiento (30 mg /kg /de peso corporal durante 11 días) de los ratones inoculados con células PANC02, redujo el peso del tumor en un 60%, que se correlaciona con aumento de la apoptosis de las células tumorales. Dado que no se observó este efecto
in vitro sobre células
PANCO2 cultivadas, que la teoría de que el diclofenaco tratamiento beneficioso involucrado otros mediadores presentes en
in vivo
. De hecho, el diclofenaco se redujo drásticamente la vascularización del tumor mediante la regulación negativa de VEGF en el tumor y en el líquido de la cavidad abdominal. Por otra parte, el diclofenaco inhibe directamente crecimiento vascular
ex vivo. Sorprendentemente, a diferencia de otros inhibidores de la COX-2, diclofenac aumentó /contenido de proteína arginasa 1 actividad de la arginasa en las células del estroma del tumor, los macrófagos peritoneales y células blancas de la sangre por 2,4, 4,8 y 2 veces, respectivamente. Proponemos que el agotamiento de arginina y la posterior disminución de los niveles de NO, tanto en el suero y la cavidad peritoneal, se suma a la inhibición del crecimiento tumoral por desnutrición y pobre desarrollo vasculatura.
Conclusión /Importancia
En conclusión, diclofenaco muestra propiedades antitumorales pronunciados en modelo de cáncer de páncreas que puede contribuir a un mayor desarrollo del tratamiento. La capacidad de diclofenac para inducir la actividad de arginasa en el estroma del tumor, los macrófagos peritoneales y las células blancas de la sangre proporciona una herramienta para estudiar un tema controvertido de los efectos pro-y antitumorales del agotamiento de arginina
Visto:. Mayorek N, Naftali-Shani N, Grunewald M (2010) Diclofenac inhibe crecimiento tumoral en un modelo murino de cáncer pancreático por la modulación de los niveles de VEGF y de arginasa de actividad. PLoS ONE 5 (9): e12715. doi: 10.1371 /journal.pone.0012715
Editor: Irene Oi Lin Ng, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 31 Enero, 2010; Aceptado: 6 Agosto de 2010; Publicado: 15 Septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Mayorek et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Facultad de Medicina de la Universidad hebrea-Hadassah (subvención#0463435). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La inflamación está altamente relacionada con la carcinogénesis y tanto a la progresión del crecimiento tumoral [1]. Los estudios epidemiológicos muestran que la inflamación crónica predispone a los pacientes al desarrollo del cáncer y el uso a largo plazo de los fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) reduce el riesgo de varios tipos de cáncer [2]
ciclooxigenasas (COX-1 y. - 2) son enzimas limitantes de la velocidad en la producción de prostaglandinas (PGs) a partir del ácido araquidónico.
COX-1 expresión es constitutiva en general, mientras que la COX-2 es generalmente inducida por estímulos implicados en las respuestas inflamatorias. La prostaglandina E2 (PGE2), un metabolito principal de la COX-2, se ha demostrado que la promoción de la supervivencia celular, la proliferación y la angiogénesis e inhibir la apoptosis y la respuesta inmune antitumoral, todos los procesos que promueven el desarrollo del cáncer [3].
pancreático el cáncer es una enfermedad letal con muy pocas opciones para el tratamiento. pancreatitis crónica predispone a los individuos a desarrollar adenocarcinoma ductal pancreático [4] y el estroma del tumor de páncreas se caracteriza por la variedad de células inflamatorias [5] que sugiere la participación de los procesos inflamatorios en este cáncer. COX-2 se sobreexpresa en aproximadamente el 75% de los carcinomas humanos, incluyendo las de los páncreas. Estudios recientes en ratones transgénicos [6], [7], [8] han demostrado que la sobreexpresión de COX-2 en el páncreas exocrinas pancreatitis inducida-como-estado. La aparición del cáncer en estos ratones fue impedido por el mantenimiento de los ratones en los inhibidores selectivos de la COX-2, demostrando además el importante papel de la inflamación en el desarrollo del cáncer de páncreas.
Los ensayos en humanos para prevenir el cáncer de colon fueron recientemente llevaron a cabo utilizando COX 2 inhibidores. A pesar de resultados alentadores en la prevención del cáncer de colon y la reducción de la incidencia de adenomas de colon, los AINE y los inhibidores selectivos de la COX-2 puede causar efectos secundarios cardiovasculares y gastrointestinales graves y por lo tanto no se recomiendan de forma rutinaria para estas enfermedades [9], [10].
el diclofenaco, uno de los AINE más antiguos ha estado en uso desde 1976. el diclofenaco inhibe la ciclooxigenasa no selectiva. Los estudios en seres humanos demostraron que reduce 94% de COX-2 y 49% de la COX-1 actividad [11]. In vitro se inhibe potentemente la fosfolipasa A2 (PLA2) [12], la enzima que libera ácido araquidónico y lisofosfolípido para generar una familia de eicosanoides pro-inflamatorias (incluyendo PGE2) y factor de activación de plaquetas. La evidencia adicional que sugiere que el diclofenaco inhibe también la PLA2 en
in vivo
. PLA2 se cree que juega un papel clave en los primeros pasos de la cascada inflamatoria que conduce a la pancreatitis aguda [12]. El estudio inicial [13], seguido por varios otros grupos, se ha demostrado que el diclofenaco puede disminuir significativamente la tasa de pancreatitis aguda causada por la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica.
A la luz de la capacidad para inhibir potentemente diclofenaco tanto la COX-2 y PLA2 hemos explorado su potencial contra el cáncer en un modelo de ratón de cáncer de páncreas. Aquí mostramos que el tratamiento diclofenaco provoca una disminución del 60% en el tamaño del tumor. Esto es debido al aumento de la apoptosis de las células tumorales. Ofrecemos pruebas de que este efecto es indirecto y opera a través de al menos dos mecanismos. En primer lugar, diclofenac produce un efecto antiangiogénico significativa, como lo demuestra una fuerte reducción en el contenido de tumor vascular factor de crecimiento endotelial (VEGF), disminución de la densidad microvascular y cambios morfológicos en los vasos sanguíneos del tumor. En segundo lugar, el tratamiento diclofenac aumenta notablemente la actividad de la arginasa en las células del estroma del tumor, los macrófagos peritoneales y células blancas de la sangre. Este es un hallazgo inesperado ya que se mostraron los inhibidores de la COX-2 para reducir el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la arginasa [14], [15] Nuestros resultados están en línea con estudios anteriores, que apuntan a antitumoral [16] y efecto antiangiogénico [17] de la arginina agotamiento y apoyar la vez controvertido enfoque del tratamiento contra el cáncer mediante el aumento de la actividad de la arginasa [18], [19].
Métodos
declaración de Ética
animales procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité ético de la Universidad hebrea, que actúa bajo la vigilancia de la AAALAC International.
Animales y PANCO2 línea celular
ratones hembra CB6F1 (9-10 semanas de edad) y ratas Sprague-Dawley (200 g) eran de Harlan, Israel. Femeninos CX3CR1
GFP /+ ratones [20] fueron generosamente proporcionadas por S. Jung (Rehovot, Israel). En estos ratones un reportero GFP es impulsado por el promotor CX3CR1. La actividad de este promotor del receptor de quimioquinas está restringida a las células mononucleares mieloides, incluyendo todos CD116 circulante
+ monocitos, y es esencialmente ausente en las células del linaje linfoide. Todos los experimentos excepto el experimento presentado en la figura S3 se realizaron utilizando ratones CB6F1.
Células
PANC02 fueron un generoso regalo de M Dauer (Múnich, Alemania). Las células se mantuvieron en RPMI con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina.
modelo ortotópico-singénico de cáncer de páncreas
Los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina-xilazina. El páncreas fue inyectado con 4 × 10
5 (ratones CB6F1) o 6 × 10
5 (CX3CR1
/+ ratones GFP) en células PANC02 30 l de fosfato (PBS). Los ratones se retiraron de un experimento si se sospecha que existe una fuga peritoneal. ratones operados Sham se sometieron al mismo procedimiento y se inyectaron con 30 l de PBS. Los ratones se dividieron en grupos de 6 a 8 animales por grupo. El grupo tratado recibió 30 mg /kg de peso corporal diclofenaco en el agua potable a partir del día 3 después de la inoculación. La dosis se calculó basándose en la estimación de que un ratón bebidas sobre 3 ml de agua por día. Los ratones se sacrificaron 14 días después de la inoculación a menos que se especifique lo contrario.
La sangre de células blancas de la sangre (WBC) preparación, óxido de VEGF y de nitrógeno (NO) la concentración fue tomado de corazón. cavidad peritoneal se lavó con 2 ml de PBS con albúmina de suero bovino al 0,1% (BSA) para la preparación de los macrófagos, para la medición de VEGF y de las concentraciones de NO.
células peritoneales y macrófagos peritoneales aislamiento
peritoneal las células se obtuvieron por centrifugación de ras cavidad peritoneal. Los macrófagos peritoneales se aislaron de las células peritoneales por adherencia diferencial al plástico. Los macrófagos se cultivaron en RPMI con 10% de FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina durante 20 horas. Para medir la actividad de arginasa, las células se lavaron con PBS y se disolvieron en 0,1% TritonX100 en agua durante 30 min a temperatura ambiente.
homogeneizados tumorales
homogeneizados tumorales se prepararon a partir de muestras de tumores que se almacenaron a -80 ° C, en agua que contiene 0,1% de Triton X 100 y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma P8340). Los homogeneizados se centrifugaron durante 30 min a 13.400 g y los sobrenadantes se utilizaron para medir la actividad de arginasa, arginasa 1, actina de músculo liso y el contenido de VEGF y la activación de la caspasa-3.
Bone células de la médula aislamiento
tibias y fémures de ratones portadores de tumores se retiraron y se lavan con PBS. Después de la centrifugación de las células recolectadas en un gradiente de Ficoll a 4.000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente las células mononucleares se aislaron con PE conjugado con el anticuerpo primario anti-CD 115 y microperlas anti-PE (Biolegends). Se analizaron las células positivas y negativas de CD-115 para la actividad de la arginasa.
glóbulos blancos aislamiento (CMB)
CMB se aislaron mediante gradiente de densidad de Ficoll (Amersham). fracción WBC se lavó, se contaron las células, se lisaron en agua que contiene 0,1% de Triton X 100 y se analizaron para el contenido de proteína arginasa 1.
anillo aórtico ensayo brotación
anillos aórticos se prepararon a partir aortas torácicas de ratas Sprague-Dawley, como se describe [21]. Anillos se embebieron en gel de colágeno y mantuvieron en medio Bio mpm (Biological Industries, Israel). El tratamiento con diclofenac 10 M comenzó un día después de la siembra y se prolongó durante 5 días. Anillos fueron fijadas en 4% de formalina tamponada, se tiñeron con 0,02% de cristal violeta en etanol absoluto. zona del brote se evaluó usando el programa Image Pro.
caspasa-3 de activación
La activación de caspasa-3 se midió en homogeneizados tumorales mediante la separación de la no escindida y se escindió de la caspasa-3 en un 20% acrilamida SDS-PAGE gel de electroforesis y transferencia con anticuerpos monoclonales anti-caspasa-3 (Señalización celular).
VEGF y contenido de NO
contenido de VEGF se midió en el suero, en el sobrenadante de ras cavidad peritoneal, en homogeneizados tumorales, PANC02 y macrófagos cultivados utilizando el kit de ratón VEGF Quantikine inmunoensayo (amp I +; D Systems).
contenido de NO se midió en el suero y en el sobrenadante de ras cavidad peritoneal usando un nitrato /nitrito colorimétrico kit de ensayo (Cayman Chemical Company).
actividad de arginasa
actividad de arginasa se midió como se describe [22]. 100 g de proteína se ensayó durante 10 minutos a 37 ° C para las células y los macrófagos peritoneales, 30 min para los homogeneizados tumorales y 2 horas para células de médula ósea. El contenido de proteína se midió en cada muestra usando el kit de ensayo de proteína BCA micro (Thermo Scientific).
Arginase 1 y actina de músculo liso contenido de proteína
Las proteínas de los homogeneizados tumorales, lisados de glóbulos blancos y células positivas para GFP aislado de tumores se separaron sobre 10% de gel de electroforesis de acrilamida SDS-PAGE y se transfirieron o bien con monoclonal arginasa-1 (BD Transduction Laboratories) o monoclonal actina de músculo liso (Sigma).
Aislamiento de células mieloides mononucleares de tumores
Los tumores se extrajeron de CX3CR1
GFP /+ ratones y se digirió con colagenasa (400 unidades /ml; Sigma y ADNasa 0,33 mg /ml; Sigma) durante 45 min a 37 ° C. población GFP positivas se purificó mediante clasificación de células de alta velocidad utilizando FACS Aria (Becton, Dickinson). Se contaron las células y se lisaron en agua que contiene 0,1% de Triton X 100 y se analizaron para la arginasa 1 contenido de proteínas.
células PANCO2 tasa de crecimiento de las células
PANC02 se sembraron en medio RPMI suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. se añadió Diclofenac (10 o 50 mM) el día siguiente y después de 4 días de tratamiento, se midió células de contenido usando un kit de proliferación celular (Biological Industries, Israel).
inmunohistoquímica, tinción de TUNEL y morfometría
secciones de parafina de los tumores se tiñeron utilizando los siguientes anticuerpos primarios: rata anti-ratón de F4 /80 (Serotec), monoclonal anti- arginasa-1 (BD Transduction Laboratories), monoclonal anti-α-actina de músculo liso (Sigma), monoclonales anti-Ki 67 (Neomarkers), conejo anti-H3 histona-fósforo (Señalización celular), de conejo anti-VEGF (Calbiochem) y anticuerpos monoclonales anti-factor de von Willebrandt (DACO). peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios se utilizaron para la detección cromogénico.
tinción TUNEL [23] se realizó usando en el kit de detección de muerte celular in situ (Roche).
Se realizó la cuantificación de los datos immunostaning ya sea por campo de alta potencia de conteo análisis de al menos 10 áreas /slide de 4 tumores diferentes en cada grupo o con la ayuda del sistema de análisis de imagen (Ariol SL-50).
el análisis estadístico
todos los datos fueron analizados con el software SigmaStat (software Aspire internacional). Se utilizó una prueba de Mann-Whitney para calcular diferencias significativas entre las muestras tratadas no tratados y diclofenaco. Un valor de p = 0.05 fue aceptado como significativo.
Tamaño de la muestra y el número de repeticiones se indican en las leyendas.
Resultados
El diclofenaco inhibe el crecimiento tumoral en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas en ratones
células PANC02 se inyectaron en la cola del páncreas. Después de 4 días las células cancerosas forman tumores pequeños de longitud aproximadamente 4 mm. Los tumores se desarrollaron rápidamente; en el día 8 se habían duplicado en longitud y metástasis constantemente a la zona peritoneal de la incisión abdominal ejecutado por la inoculación del tumor. En el día 14, los tumores que crecieron en el sitio de la inoculación (tumores primarios), se pesan 300-500 mg y fueron altamente vascularizado. Los tumores metastásicos en el corte abdominal y en el bazo también eran prominentes (figura 1A).
Los ratones fueron inoculados con 4 × 10
5 PANC02 células en la parte de la cola del páncreas. En el día 3 después de la inoculación (el día de la inoculación fue designado como día 1) los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos no tratados y tratados con diclofenac (7-8 ratones en cada grupo) y se inició diclofenac 30 mg /kg de tratamiento b.w. En el día 14 después de la inoculación de ratones murieron y se eliminaron los tumores primarios y metastásicos y se pesaron. A, A fotografías representativas de
In situ
primarios (
círculos
) y los tumores metastásicos (
flechas
). Los insertos muestran tumores primarios aislados. B, media ± SE de pesos de los tumores de 8 y 7 sin tratar ratones tratados con diclofenac * p≤0.01. Se muestra el experimento representativo de cuatro.
De tres a cuatro semanas después de la inoculación, la cavidad peritoneal estaba lleno de ascitis hemorrágica. Numerosos tumores metastásicos fueron encontradas en la cavidad peritoneal, incluyendo los ganglios linfáticos de la pista alimentario, y los ratones comenzaron a morir. No se detectaron tumores metastásicos en el hígado o los pulmones.
Por lo tanto, los experimentos se terminaron a los 14 días después de la inoculación. Los ratones parecían normales en esta etapa y no hubo pérdida de peso corporal.
El diclofenaco (30 mg /kg de peso corporal) fue administrada diariamente en el agua potable a partir de 3 días después de la inoculación. Sus efectos se examinaron después de 11 días de tratamiento. Como se muestra en la figura 1B, el peso del tumor primario (que crece en el páncreas) fue significativamente menor (60%) en los ratones tratados con diclofenac en comparación con los animales no tratados. Los tumores metastásicos que crecieron en el corte abdominal también pesaron menos en los ratones tratados con diclofenac, en todos los experimentos, sin embargo, este efecto no alcanzó significación estadística.
El diclofenaco aumenta la apoptosis de las células del tumor
in vivo
, pero no
in vitro
La disminución del peso del tumor observado en los ratones tratados con diclofenac nos llevó a examinar la proliferación y la apoptosis de las células tumorales.
Los tumores teñidos para Ki 67 (presente durante todas las fases activas del ciclo celular: G1, S, G2 y mitosis) y de fosfato histonas H3 (el marcador específico de las células mitóticas) no mostraron diferencias entre los ratones tratados y tratados con diclofenac, la figura S1
. Sin embargo, como se muestra en la figura 2, el tratamiento diclofenac aumento de la apoptosis por 6 veces, como se indica mediante la tinción de TUNEL de tumores y cuantificación (Fig 2A). Este hallazgo fue apoyada además por una mayor presencia de la caspasa 3 escindida en homogenados de los tumores extirpados de los ratones tratados con diclofenac (Fig 2B).
A y B, los ratones fueron inoculados con células PANC02 y tratados con diclofenac como se describe en Figura 1. A,
lef
t, la tinción de TUNEL superpositioned sobre DAPI de los tumores fijos,
derecha, media ± SE% de núcleos TUNEL positivas de los núcleos teñidos con DAPI. Acerca de 9000 núcleos de tumores de 4 sin tratar y 4 ratones tratados con diclofenac se contaron * p≤0.001. B, se midió la activación de la caspasa-3 en los homogeneizados tumorales de los ratones tratados con 4 sin tratar y 3 diclofenaco como se describe en Materiales y Métodos, uno de cada dos experimentos. C, PANC02 (3000 células /pocillo) se sembraron en 96-NUNC pozos. Se añadió el día 10 después de la siembra o 50 diclofenac mu M y las células se incubaron durante 4 días adicionales. Se midió el número de células utilizando un kit de proliferación celular. La media ± SE de OD de 6 pozos en cada grupo. Un experimento representativo de los 3.
La apoptosis mejorada causa diclofenac
in vivo
podría no ser recapitulado
in vitro
. células PANC02 cultivaron durante 4 días en presencia de 10 y 50 mM de diclofenac crecieron a la misma tasa que las células no tratadas (Fig 2C) que indica que el
in vivo
efectos de diclofenac requieren algunos mediadores que están ausentes en el
in vitro
sistema.
efecto antiangiogénico del diclofenaco
in vivo
y
ex vivo
Los tumores de los animales tratados eran muy diclofenaco pálido (Fig 1A), lo que sugiere que el tratamiento provocó un efecto antiangiogénico. De hecho, como se muestra en la figura 3A y B, la tinción para el marcador endotelial vascular von Willebrand Factor y el recuento de los vasos sanguíneos revelaron una caída de 4 veces en el número de vasos periféricos grandes y una caída de 2 veces en la densidad capilar en los tumores de los ratones tratados con diclofenac. Además, suave tinción actina de músculo (Fig 3C) reveló vasos finos, rectas en los tumores tratados en comparación con los numerosos y anchos, los vasos sanguíneos tortuosos de los tumores de los ratones no tratados. Análisis de la expresión de actina de músculo liso en los homogeneizados tumorales por Western blot mostró una disminución significativa (2,5 veces) en los ratones tratados con diclofenaco (Fig 3D y E).
A-F, los ratones fueron inoculados con células PANC02 y tratados con diclofenac como se describe en la Figura 1. a-D, el tratamiento diclofenac causa cambios morfológicos en los vasos sanguíneos del tumor. A, tinción de Von Willebrand de los vasos periféricos grandes (
arriba) Opiniones y capilares (
parte inferior). B, media ± SE de grandes vasos periféricos /diapositiva. contadas alrededor de la periferia de cada diapositiva (
Top of) y la media ± SE de capilares /área de contado en 10 áreas diferentes de tumores centrales con una lupa X40 (
parte inferior). Vasos recuento se evaluó en los tumores de 4 sin tratar y 4 ratones tratados con diclofenac, * p≤0.01. C, lisa tinción de actina de músculo reveló muy delgadas paredes de los vasos sanguíneos en los ratones tratados con diclofenac. D y E, contenido de proteína actina de músculo liso en los homogeneizados tumorales (50 mg de proteína cargada por calle) de 4 y 3 sin tratar ratones tratados con diclofenac medidos como se describe en Materiales y Métodos, media ± SE de unidades arbitrarias /carril, * p≤0.01. F, Diclofenac reduce el contenido de VEGF del tumor y la cavidad peritoneal, pero no el suero. Los niveles de VEGF se midieron como se describe en Materiales y Métodos en la proteína de los homogeneizados tumorales-pg /mg (
Top of), en la cavidad peritoneal-pg /ratón (
centro
) y en el suero -PG /ml (
parte inferior). Los resultados son la media ± SE de 4 a 6 ratones por grupo. *, ** Y#significativamente diferente de tratamiento, teniendo tumor ratones P≤0.02. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. G, Diclofenac inhibe la germinación vascular. La
ex vivo
efecto inhibidor de diclofenac en la brotación se midió en anillos de aorta de rata cultivadas en la ausencia o la presencia de 10 mM diclofenac durante 5 días como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados son la media ± SE de la zona del brote de 5 anillos en cada grupo medidos mediante el programa Image Pro. * Significativamente diferente del grupo no tratado p≤0.01 Las fotografías de los anillos representativos de tratar (
izquierda) y diclofenaco (
derecha) se incluyen los grupos tratados. Se obtuvieron resultados similares en 4 experimentos independientes.
VEGF se ha demostrado ser el factor proangiogénico importante en tumores [24]. Por lo tanto, hemos medido los niveles de VEGF tumoral de diclofenaco tratados y los ratones no tratados (Figura 3F). tumores de los ratones tratados contenían 3 veces menos de VEGF en comparación con los tumores de los ratones no tratados, lo que sugiere que la disminución en los resultados de la vasculatura del tumor de una regulación a la baja de VEGF (Figura 3F,
Top of). Dado que las células tumorales rápidamente propagan a través de la cavidad abdominal, el próximo midió contenido VEGF en el líquido peritoneal. La cantidad flushable de VEGF de la cavidad peritoneal de ratones portadores a tumores era 13 veces mayor que los ratones sanos con operación simulada. Esta cantidad se redujo en 2,8 veces después del tratamiento diclofenaco (Figura 3F,
centro
).
Estos efectos pronunciados sobre el contenido de VEGF, tanto en la cavidad peritoneal y en el tejido tumoral, se no se reflejan en los cambios en la concentración sérica de VEGF (figura 3F,
parte inferior). Por lo tanto, las concentraciones séricas de VEGF fueron similares en suero de ratones operados sana-sham, en ratones que llevan a tumores y en ratones portadores de tumores tratados con diclofenac.
Para determinar si el diclofenaco puede inhibir directamente la angiogénesis, que mide la brotación angiogénesis de anillos de aorta de rata
ex vivo en respuesta al tratamiento farmacológico. Como se muestra en la figura 3G, el área de la germinación fue inhibida por 2,5 veces, cuando los anillos aórticos se incubaron con 10 M de diclofenac (C max de los pacientes tratados con diclofenac), mostrando así que el diclofenaco puede inhibir directamente el desarrollo de los vasos sanguíneos.
Diclofenac aumenta la actividad de arginasa en los tumores de páncreas y en los macrófagos peritoneales, pero no en la médula ósea CD-115 células positivas y negativas de CD 115
Uno de los resultados de la COX-2 sobreexpresión por las células tumorales es una gran producción de PGE2 que conduce a un deterioro de la respuesta de las células T [14] [25]. PGE2 induce arginasa 1 actividad y la captación de arginina en las células mieloides supresoras derivadas (MDSCs), lo que provoca el agotamiento de arginina en el tumor circundante. La falta relativa de arginina causa un defecto en la expresión CD3 de las células T infiltrantes de tumor. Desde que se muestran los inhibidores de la COX-2 para detener parcialmente el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la arginasa en MDSC [14], [25] que mide la actividad de la arginasa en homogeneizados tumorales pancreáticas no tratados y los ratones tratados con diclofenac (Figura 4A,
top
).
a-C, todos los ratones excepto los indicados fueron inoculados con tumores en el día 1 y matado en el día 14. a, se midió la actividad de la arginasa como se describe en Materiales y Métodos en el homogeneizado del tumor
( superior)
, en macrófagos aislados por cavidad peritoneal ras y se cultivaron durante 20 horas (
centro)
, y en las células peritoneales recién aislados (
inferior)
. Los ratones fueron tratados con diclofenac 30 mg /kg durante 11 días (
parte superior y central
) o durante 2 días antes del final del experimento (
parte inferior). Los resultados son la media ± SE de la actividad de arginasa en los homogeneizados tumorales de 6-7 ratones en cada grupo (
top
) o en Triton-X 100 células disueltos obtuvieron 3-7 ratones a través de ras peritoneal y se midieron por cuadruplicado (
centro y abajo
). Cada experimento se repitió al menos 3 veces y los resultados del experimento representativo se muestran. * Significativamente diferente del grupo no tratado p≤0.01.#Significativamente diferente del grupo no tratado de ratones de libre a tumores. B, arginasa-1 tinción de tumores. tumores fijado se tiñeron para la arginasa 1 como se describe en Materiales y Métodos. Se tomaron fotografías de las secciones bajo X 10
(arriba)
o X 40 (
parte inferior) de aumento. C, la identificación de dos poblaciones separadas de células en el tumor (diclofenac-tratado) estroma: F4-80 células positivas positivas y arginasa. Las secciones seriadas se tiñeron para F4 /80
(
izquierdo) y de arginasa 1,
(derecha)
. Se identificaron las mismas zonas y se comparan para determinar la presencia de ambos marcadores. Las fotografías de las secciones se toman bajo x 20 aumentos. Un experimento representativo de 2. D, Diclofenac no induce la actividad de la arginasa cuando se incubaron con los macrófagos en el cultivo celular. Los macrófagos peritoneales se aislaron de ratones libres de tumor como se describe en Materiales y Métodos y se incubaron durante 48 horas con 10 o 30 M diclofenac seguido de la medición de la arginasa. La media ± SE de la actividad de la arginasa de 3 pozos en cada grupo. Uno de los experimentos, representante de 3.
Para sorpresa nuestra actividad arginasa no fue inhibida por el tratamiento diclofenaco, sino que más bien se activó significativamente en 2,4 veces.
tinción inmuno-histológico mostró arginasa 1 células positivas en la periferia de los tumores en ratones tratados no tratados y diclofenaco (Fig 4b). El número de arginasa 1 que expresan las células y su intensidad de la tinción parecían aumentar en tratamiento diclofenac. A, 1,8 veces de incremento significativo en la arginasa 1 contenido de proteína en los tumores de los ratones tratados con diclofenac también se midió por análisis de transferencia de Western de homogeneizados tumorales (Fig S2). El uso de un anticuerpo contra el marcador macrófago F4 /80 (figura 4C), no hemos podido detectar ninguna superposición con la arginasa 1 tinción.
Con el fin de caracterizar mejor los arginasa 1 células que expresan en los tumores PANC02, se inocularon células en PANC02 ratones transgénicos donde un reportero GFP es conducida por el promotor de CX3CR1. La actividad de este promotor del receptor de quimioquinas está restringida a las células mononucleares mieloides, incluyendo todos CD116 circulante
+ monocitos, y es esencialmente ausente en las células del linaje linfoide. Se aislaron células GFP positivas de tumores y se encontró que estas células expresan altos niveles de arginasa 1 (Fig S3).
Por lo tanto, el aumento de la actividad de la arginasa se encuentra en los tumores de los ratones tratados con diclofenac es debido al menos en parte a la activación de la arginasa 1 en monocitos deriva CX3CR1
+ células. la actividad de la arginasa estaba ausente en PANC02 cultivadas (resultados no mostrados) y la proteína arginasa 1 no se detectó en las células del tumor
in vivo fotos: por inmunotinción.
El sorprendente efecto del tratamiento con diclofenaco sobre la actividad de la arginasa en páncreas tumores nos llevó a examinar la actividad de arginasa en los macrófagos peritoneales. macrófagos peritoneales pueden estar involucrados en la vigilancia del tumor [26] y muestran una expresión de la arginasa mejorada en ratones portadores de tumores [27]. Macrófagos de lavado peritoneal se aislaron mediante la unión preferencial a las placas de cultivo y cultivadas durante la noche. La inmunotinción mostró que ambos eran F4 /80 positivas y arginasa 1 positivos (resultados no mostrados). se reguló la actividad de arginasa (4,8 veces) en macrófagos derivados de ratones portadores a tumores tratados con diclofenac durante 11 días, en comparación con los ratones no tratados, (Fig 4A
centro
).
Desde arginasa macrófagos expresión puede cambiar en respuesta a placa de cultivo de adhesión [28] también medimos la actividad de la arginasa en las células recién aisladas no cultivadas a partir de la cavidad peritoneal del ratón, lo que compromete en los macrófagos pureza, (Fig 4A
inferior)
.
diclofenac estimula eficazmente la actividad de la arginasa en las células no cultivadas derivadas de ambos y los ratones tratados con diclofenac durante 2 días solamente por 7 y 3 veces, respectivamente portadores de tumores libre de tumor. la presencia del tumor actividad de arginasa reforzada por 4 veces el aumento de la actividad a partir de 0,03 (células de ratones portadores no tumorales) a 0,12 mg de urea /min /mg de proteína (células de ratones portadores de tumores -bearing) que está en línea con la anterior informó de los resultados [27] .
también contó el número de células peritoneales extraídos de cada ratón y se encontró que un tratamiento diclofenac 2 días produjo un aumento de 3 veces en las células de los ratones libres de tumor. El número medio de células ± SE fue de 0,6 × 10
6 ± 0,06 × 10
6 extraído de ratones no tratados y 1,5 × 10
6 ± 0,4 × 10
6 de los ratones tratados con diclofenac (p ≤ 0,02, 7 ratones en cada grupo).
Esta observación muestra que después de un tratamiento corto diclofenaco, la actividad total de la arginasa en las células peritoneales (principalmente macrófagos) es extremadamente alto, tanto por el gran aumento de una actividad específica de esta enzima y por el aumento en el número de células activadas
.
la activación de la actividad de la arginasa por diclofenac no se ha demostrado
in vitro
. La incubación de los macrófagos peritoneales de 48 horas (Fig 4D) no aumentó la actividad de arginasa, sino más bien produjo una cierta disminución en la actividad específica de esta enzima. Los mismos resultados se obtuvieron cuando los macrófagos se incubaron durante 96 horas con diclofenac (resultados no mostrados). Por lo tanto, de manera similar al efecto de diclofenac en la apoptosis de las células tumorales, los mediadores presentes
in vivo
y ausente en macrófagos cultivados fueron requeridos para lograr la inducción de la actividad de arginasa por este medicamento.
también se investigó si la activación de arginasa por diclofenac puede ser detectada en los precursores de macrófagos de médula ósea. Se aislaron células mononucleares a partir de tibias y fémures de ratones portadores de tumor no tratados y tratados durante 11 días con diclofenac. Encontramos muy baja actividad de la arginasa en ambos CD 115
+ y CD - 115 células. Así, la activación de arginasa por diclofenac sucede, ya sea en macrófagos diferenciados o los mediadores necesarios para la promoción de la activación diclofenac- induced- de la arginasa no alcanzar el compartimento de la médula ósea.
Diclofenac disminuye nivel de NO en la cavidad peritoneal y en el suero
a continuación se investigó si la activación de la arginasa pronunciado tanto en el tejido tumoral y en los macrófagos peritoneales influenciado la producción de NO.