Extracto
Aplicaciones
Para examinar el
in vitro
y
in vivo
eficacia de la doble inhibidor de PI3K /mTOR NVP-BEZ235 en el tratamiento de
PIK3CA
de tipo salvaje del cáncer colorrectal (CCR).
Diseño Experimental
PIK3CA
CRC líneas celulares humanas de tipo salvaje y mutante fueron tratados
in vitro
con NVP-BEZ235, y los efectos resultantes sobre la proliferación, la apoptosis y se evaluaron de señalización. Los tumores del colon de un modelo de ratón genéticamente modificado (GEM) para esporádica de tipo salvaje
PIK3CA
CRC se trataron
in vivo
con NVP-BEZ235. Se examinaron los efectos resultantes sobre el crecimiento del tumor macroscópico /regresión, la proliferación, la apoptosis, la angiogénesis y la señalización.
Resultados
in vitro
tratamiento En líneas celulares de CRC con NVP BEZ235 resultó en bloqueo PI3K transitoria, disminuye sostenidos en la señalización /mTORC2 mTORC1, y una correspondiente disminución en la viabilidad celular (mediana IC
50 = 9,0 a 14,3 nM). Se observaron efectos similares en las líneas celulares de CRC isogénicas pares que difieren sólo en la presencia o ausencia de un activador
PIK3CA
alelo mutante.
In vivo
el tratamiento de ratones portadores de tumores de colon con NVP-BEZ235 como resultado la inhibición de PI3K transitoria y el bloqueo de la señalización /mTORC2 mTORC1 sostenida. vigilancia tumor Longitudinal por colonoscopia óptica demostró un aumento del 97% en el tamaño del tumor en los ratones de control (p = 0,01) frente a una disminución de 43% (p = 0,008) en los ratones tratados.
Ex vivo
análisis de los tumores tratados con NVP-BEZ235 demostró una disminución del 56% en la proliferación (p = 0,003), no hay efectos en la apoptosis, y una reducción del 75% en la angiogénesis (p = 0,013).
Conclusiones
Estos estudios proporcionan la lógica preclínico para los estudios que examinan la eficacia de la doble inhibidor de PI3K /mTOR NVP-BEZ235 en el tratamiento de
PIK3CA
de tipo salvaje CRC.
Visto: Roper J, Richardson MP, Wang Virginia Occidental, Richard LG, Chen W, café EM, et al. (2011) La doble PI3K /mTOR Inhibidor NVP-BEZ235 induce la regresión tumoral en un modelo de ratón de Genetically Engineered
PIK3CA sobre Wild-Type cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (9): e25132. doi: 10.1371 /journal.pone.0025132
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 14 Junio, 2011; Aceptado: August 25, 2011; Publicado: 26 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Roper et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer (2U01CA084301) y el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y renales (NIDDK) (5K08DK7803325, R03DK088014 y T32-DK07542). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en 2011, el cáncer colorrectal (CCR) seguirá siendo la tercera causa más común de muerte por cáncer en los EE.UU. [1]. A pesar del creciente arsenal de agentes quimioterapéuticos, la mediana de supervivencia para los pacientes con CCR metastásico sigue siendo inferior a 20 meses, lo que pone de relieve la necesidad urgente para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos [2].
diana de la rapamicina en mamíferos ( mTOR) es una serina /treonina quinasa que regula la proliferación celular y la apoptosis. mTOR une a la proteína reguladora asociada de mTOR (Raptor) y LST8 de mamífero /G-proteína β-subunidad como la proteína (mLST8 /GβL) para formar el complejo mTOR 1 (mTORC1), que promueve la traducción a través de la fosforilación de p70 S6 quinasa (S6K), proteína S6 ribosomal (S6), y factor de iniciación eucariota 4E proteína de unión 1 (4E-BP1). Alternativamente, mTOR puede unirse compañero rapamicina insensible de mTOR (Rictor), mLST8 /GβL, y de mamífero estrés proteína quinasa activada por interacción de proteínas 1 (mSIN1) para formar mTOR complejo 2 (mTORC2) [3], [4].
El fosfatidilinositol aguas arriba 3-kinasa (PI3K) vía de señalización mTOR puede activar. Las PI3K de clase Ia son activadas por factores de crecimiento tirosina quinasas receptoras (RTK) y se componen de un heterodímero que consiste en una subunidad reguladora p110α /p110β catalítico y una p85 [5]. El gen
PIK3CA
(fosfatidilinositol 3-quinasa, catalítica, α-polipéptido) que codifica p110α es frecuentemente mutado en muchos cánceres humanos, incluyendo CRC [6]. Las mutaciones puntuales en
PIK3CA
clúster en dos puntos: E545K en el dominio helicoidal (exón 9) y H1047R en el dominio quinasa catalítico (exón 20). Estas mutaciones aumentan la actividad p110α y promueven el crecimiento celular CRC, la invasión y la migración
in vitro
través de la activación de la vía PI3K [7]. Las mutaciones en los dominios helicoidales y catalíticas de
PIK3CA
confieren fenotipos esencialmente idénticas en las líneas celulares de CRC humanos [7]. AKT es un efector aguas abajo crítico de la ruta de PI3K y promueve el crecimiento celular y la supervivencia a través de un número de mecanismos, incluyendo la fosforilación de TSC2, lo que resulta en la activación mTORC1 [5]. plena activación de AKT se consigue después de la fosforilación en Thr308 y Ser473 por PDK1 y mTORC2, respectivamente [5], [8] - [11].
Debido a su papel central en la carcinogénesis, mTORC1 bloqueo es un atractivo terapéutica estrategia para la CRC. El tratamiento de ratones Apc Δ716 con el everolimus inhibidor mTORC1 inhibe la proliferación celular y la angiogénesis del tumor, dando como resultado una disminución en número y tamaño de los tumores intestinales [12]. Recientemente hemos informado de que el tratamiento de un modelo de ratón genéticamente modificado (GEM) para CCR esporádico con los resultados de rapamicina inhibidor de mTORC1 en una reducción del 80% en el crecimiento del tumor individual, como se observa por la vigilancia colonoscopia longitudinal [11]. Sin embargo, la eficacia clínica de mTORC1 bloqueo puede ser atenuada por la pérdida concomitante de un bucle de realimentación negativa mTORC1 dependiente de la señalización de PI3K (que se refleja por un aumento de la fosforilación de AKT en Thr308), y la activación mTORC2 mediada por AKT continuó a través de la fosforilación en Ser473 [9 ] - [14]. De hecho, un estudio de fase I de ensayos clínicos que examinaron la eficacia del inhibidor de everolimus mTORC1 en tumores sólidos avanzados demostró un beneficio modesto en sólo uno de los 16 pacientes con cáncer colorrectal y en general aumenta la fosforilación de AKT en Ser473 [13]. Tomados en conjunto, parece que las estrategias terapéuticas en las que PI3K y mTOR son inhibidas al mismo tiempo puede ser más eficaz.
NVP-BEZ235 (Novartis) es una clase de doble bandeja I PI3K y mTOR quinasa inhibidor que se ha demostrado que reducir el crecimiento del tumor en un número de diferentes modelos de ratón genéticamente modificado varias (GEM) y xenoinjerto y está actualmente en ensayos clínicos [14] - [50]. No ha habido sugerencia de que el uso de tales agentes puede estar limitada a los tumores con mutaciones activadoras en
PIK3CA
[51], [52]. Como activar
PIK3CA
mutaciones se observan en sólo el 17% de CRC, esto implicaría dichos agentes podrán haberse concentrado en sólo una pequeña proporción de los pacientes [53]. Debido a NVP-BEZ235 inhibe la de tipo salvaje y formas mutantes de
PIK3CA
con una eficacia comparable [32], la hipótesis de que NVP-BEZ235 puede tener una eficacia significativa en el tratamiento de
PIK3CA
silvestre escriba CRC.
en este manuscrito, se describen los resultados de
in vitro
estudios que demuestran la eficacia de tratamiento comparable de NVP-BEZ235 en contra de ambos
PIK3CA
de tipo salvaje y mutante CRC humana líneas celulares. También se describen los resultados de
in vivo
estudios de tratamiento que demuestran la eficacia significativa en un modelo GEM para esporádica de tipo salvaje
PIK3CA
CRC. Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan una justificación convincente preclínico para los ensayos clínicos para examinar el uso de NVP-BEZ235 en el tratamiento de
PIK3CA
de tipo salvaje pacientes con CCR.
Materiales y Métodos
El tratamiento in vitro Red de CRC líneas celulares
HCT116 humana (
PIK3CA
mutante; dominio quinasa en H1047R), DLD-1 (
PIK3CA
(
PIK3CA
de tipo salvaje) líneas CRC humanos dominio helicoidal en E545K), y SW480 células (ATCC) y isogénica DLD-1
PIK3CA
células mutantes y de tipo salvaje (obtenido a partir; mutantes B. Vogelstein) se mantuvieron en DMEM (Invitrogen) con 10% de FBS y 1 × penicilina /estreptomicina (Invitrogen). Las células se sembraron en diferentes densidades iniciales (HCT116: 3.000 células /pocillo, DLD-1: 5.500 células /pocillo, SW480: 4.500 células /pocillo, DLD-1
PIK3CA
mutante: 7.000 células /pocillo, y el sistema antibloqueo de frenos -1
PIK3CA
de tipo salvaje: 9.000 células /pocillo) para dar cuenta de la cinética de crecimiento diferenciales. Después de 16 horas, las células se incubaron con concentraciones crecientes de NVP-BEZ235 (Novartis), y medio de crecimiento que contiene el fármaco se cambió cada 24 horas. La viabilidad celular se evaluó 16 horas después de la placa inicial y 48 horas después de la iniciación del tratamiento con fármaco utilizando el CellTiter colorimétrico ensayo MTS 96® acuosa Una célula de soluciones Ensayo de proliferación (Promega), según las instrucciones del fabricante. La viabilidad celular después del tratamiento de drogas se normalizó a la de las células no tratadas también se cultivan durante 48 horas. IC
50 valores se calcularon utilizando 4 parámetros de regresión no lineal en GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Para el análisis de transferencia Western, las células se sembraron con 0 nM o dosis inhibitoria máxima (500 nM) NVP-BEZ235 para 2, 6, 24, o 48 horas.
La secuenciación de los tumores de colon de un modelo GEM esporádica CRC
C57BL /6J
Apc
ratones knock-out condicionales (Apc CKO) fueron tratados con adeno-Cre, tal como se describe anteriormente [11]. Tras la necropsia, se recogieron 10 muestras de tumores en 1 ml de ARN Más tarde (Invitrogen, Inc), almacenados durante la noche en 4 ° C, después se retiró del ARN Más tarde y está archivada en -80 ° C. Se extrajo ARN de las muestras utilizando RNeasy (Qiagen, Inc.), y el ADNc fue generado con transcriptasa inversa (Omniscript RT, Qiagen, Inc). Cebadores diseñados por los autores del estudio se utilizaron para crear 553 pb y 477 pb amplicones (PCR realizada utilizando Platinum PCR Supermix Alta Fidelidad, Invitrogen, Inc) que abarca los codones 532-554 del exón 9 (dominio helicoidal; 9F: 5 'GCAGTGTGGTGAAGTTTCCA 3', 9R: 5 'TGGCCAATCCTTTGATTTGT 3') y c1011-1062 del exón 20 (dominio quinasa; 20F: 5 'ACTGCGTGGCAACCTTTATC 3', 20R: 5 'TGATGGTGTGGAAGATCCAA 3') del
PIK3CA
gen, respectivamente, que incluyen regiones mutación hotspot. Sanger de secuenciación de los amplicones se realizó en el Centro de biopolímeros en la Escuela de Medicina de Harvard, y los resultados analizados con 4.10.1 Sequencher (Gene Codes, Inc).
En vivo
tratamiento de un modelo GEM CRC para
ratones Apc CKO esporádicos fueron tratados con adeno-Cre y seguido por colonoscopia óptica, tal como se describe anteriormente [11]. Como una métrica colonoscópica para el tamaño del tumor, el tamaño del tumor Index (TSI) se calculó como (área del tumor /área de la luz del colon) x 100 (%). Tumor-teniendo ratones fueron asignados aleatoriamente al tratamiento con vehículo de control solo (n = 8) o 45 mg /kg de peso corporal NVP-BEZ235 en 10% de 1-metil-2-pirrolidona /90% de PEG 300 (n = 8) por sonda oral diariamente durante 28 días. La dosis de tratamiento fue elegido sobre la base de la literatura indica que el peso de 40-50 mg /kg de peso corporal NVP-BEZ235 trata con eficacia los modelos de tumores murinos y sin efectos adversos [15], [24], [26], [28], [32], [ ,,,0],47]. Con base en estudios farmacocinéticos que demuestran concentración tisular máxima una hora después de la administración de NVP-BEZ235, los ratones portadores de tumor se sacrificaron una hora después de la dosis final de tratamiento [32]. volumen de los tumores de colon se evaluó mediante pinzas (anchura x longitud x altura) y los tumores se cosecharon tanto para el análisis de transferencia de Western e inmunohistoquímica.
Análisis de transferencia Western
Se determinaron las concentraciones de células tumorales completas o lisados por Bio-Rad ensayo de proteínas (Bio-Rad). 10 mg y 25 mg de lisado de proteína para las células totales y el tumor, respectivamente, se separó en 10% de gel de SDS /PAGE, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa, bloqueada en 1% de BSA durante una hora, se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas con el anticuerpo primario y una hora con anticuerpo secundario. La detección se realizó a través de ECL ™ ™ Western Blot reactivos de detección Amersham (GE Healthcare). p-AKT Thr308 (1:1000 dilución), p-AKT Ser473 (1:2000 dilución), AKT total de (1:1000 dilución), p-S6 Ser240 /244 (1:3000 dilución), p-S6 Ser235 /236 (1:1000 dilución), S6 (1:1000 dilución), caspasa 3 (1:1000 dilución) troceados, y PARP escindida (1:1000 dilución) se obtuvieron de Tecnologías de señalización celular (Beverly, MA). β-actina (1:5000 dilución) se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Peroxidasa AffiniPure burro anti- Ig de conejo anticuerpo secundario (1:10,000 dilución) se obtuvo de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) [11].
La inmunohistoquímica
Cinco micras secciones de tejido incluidas en parafina se desparafinaron en xileno, seguido de rehidratación alcohol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en 1 x tampón de citrato (pH 6,0) (Zymed) utilizando una cámara de destape médico (Biocare Médica). Los portaobjetos se bloquearon a temperatura ambiente con peroxidasa Reactivo bloqueante (DAKO), normal de burro /suero de conejo, y avidina /biotina Kit de bloqueo (Vector Laboratories). Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario y 30 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario. Se utilizó el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) para la detección de las instrucciones del fabricante. Las preparaciones fueron teñidas con el sistema DAB + Líquido sustrato cromógeno (Dako) según las instrucciones del fabricante y contratinción con solución de hematoxilina de Mayer y solución de azulado de Scott. p-AKT Ser473 (1:50 dilución), p S6-Ser240 /244 (1:50 dilución), p-S6 (dilución 1:100) Ser235 /236, se obtuvieron de Tecnologías de Señalización Celular (Beverly, MA). CD31 (1:100 dilución) se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). KI-67 (1:100 dilución) se obtuvo de los Estados Unidos Biológica (Swampscott, MA). ensayo de TUNEL (Apoptag) se adquirió de Millipore (Billerica, MA) [11]. El índice de proliferación KI-67 se calculó como la media del número de KI-67 células positivas /número total de células glandulares por campo de alta (media de 16 campos de alta potencia) × 100, y la densidad de microvasos (MVD) se calculó como el número de Las células CD31 positivas por campo de alta (media de 16 campos de alta potencia). índice de positividad TUNEL fue calculado como el número medio de células TUNEL positivas /número total de células glandulares por campo de alta (media de 16 campos de alta potencia) × 100. Las mediciones fueron realizadas por tres observadores independientes cegados, en cuatro campos de regulación y cuatro tumores tratados.
Estadísticas
Las comparaciones de volumen final del tumor, las células apoptóticas entre el control y NVP Ki-67, MVD, y cohortes tratadas con BEZ235 se calcularon utilizando los dos de cola T para muestras independientes de prueba. valores pre y post-tratamiento de la ETI se compararon con la prueba de Wilcoxon signed-rank. P & lt; 0,05 se consideró significativo para todos los análisis. Todos los análisis se calculó con el programa SPSS 18.0 para Windows (IBM, Inc).
Resultados
in vitro
tratamiento NVP-BEZ235 de líneas celulares de CRC humanos disminuye la proliferación celular, pero tiene ningún efecto sobre la apoptosis
Para examinar los efectos de
in vitro
tratamiento de NVP-BEZ235 sobre la viabilidad celular, tres líneas celulares de CRC humanos (HCT116, DLD-1 y SW480) fueron tratados con el aumento cantidades de NVP-BEZ235 durante 48 horas, y la viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo de MTS colorimétrico. Estos estudios revelaron una disminución dependiente de la dosis similar en la viabilidad después del tratamiento NVP-BEZ235 (media de IC
50 de tres experimentos separados = 14,3 ± 6,4, 9,0 ± 1,5, y 12,0 ± 1,6 nM para HCT116, DLD-1 y SW480 líneas celulares, respectivamente, p = 0,74) para todas las tres líneas celulares (Figura 1A). Para determinar si la disminución observada en la viabilidad celular después del tratamiento NVP-BEZ235 el resultado de una inducción de apoptosis, análisis de transferencia Western para la caspasa-3 escindido y se realizó PARP escindida, revelando ningún aumento en estos marcadores de apoptosis con tratamiento NVP-BEZ235 (Figura 1B ). Tomados en conjunto, estos estudios sugieren que
in vitro
tratamiento con resultados NVP-BEZ235 en una disminución equivalente en la proliferación celular en dos líneas celulares de CRC albergar distinta
PIK3CA mutaciones
(HCT116 y DLD-1) así como en un
PIK3CA
de células de cáncer colorrectal de tipo salvaje (SW480), sin efecto sobre la apoptosis.
(a) la viabilidad celular de HCT116, DLD-1, y la célula SW480 CRC líneas se evaluó mediante el ensayo de MTS después del tratamiento con concentraciones crecientes (0 a 500 nM) de NVP-BEZ235 durante 48 horas. Los resultados mostrados son la media de tres experimentos independientes. (B) Análisis de Western blot para p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, p-S6
Ser240 /244, p-S6
Ser235 /236, se escindió de la caspasa 3, y se escindió de PARP se llevó a cabo después de 2, 6, 24, y 48 horas de incubación con (-). 0 o (+) 500 nM NVP-BEZ235
in vitro tratamiento
NVP-BEZ235 de CRC líneas celulares humanas como resultado la inhibición mTORC1 y mTORC2 sostenida, pero PI3K transitoria bloqueo
Para examinar los efectos de los
in vitro
tratamiento NVP-BEZ235 de PI3K (p-AKT
Thr308) , mTORC1 (p-S6
Ser235 /236 y p-S6
Ser240 /244), y mTORC2 (p-AKT
Ser473) de señalización mTOR, se realizó análisis de transferencia Western. Después de dos horas de tratamiento NVP-BEZ235, los niveles de p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, p-S6
Ser235 /236, y p-S6
Ser240 /244 fueron significativamente disminuido. Mientras que se observó una disminución sostenida en los niveles de p-AKT
Ser473, p-S6
Ser235 /236, y p-S6
Ser240 /244, completa inhibición de p-AKT
Thr308 era perdido en tan sólo seis horas (Figura 1B). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que
in vitro de tratamiento: Resultados de la NVP-BEZ235 en la inhibición de la señalización sostenido mTORC1 y mTORC2, sino que el bloqueo de PI3K es transitorio.
La eficacia de
in vitro tratamiento
NVP-BEZ235 de líneas celulares de CRC humanos no depende de PIK3CA mutacional estado
La eficacia comparable del tratamiento NVP-BEZ235 en
PIK3CA
mutante (HCT116 y DLD-1) y
PIK3CA
líneas celulares de tipo salvaje (SW480) CRC humanos sugiere que su eficacia clínica no puede estar limitada a aquellos pacientes cuyos tumores contienen la activación de
PIK3CA
mutaciones. Para examinar esta posibilidad, se evaluó el efecto de NVP-BEZ235 sobre la proliferación celular y la señalización celular intracelular en
PIK3CA
líneas de células de tipo salvaje y mutante pareadas. El
PIK3CA
línea celular mutante se deriva de DLD-1 a través de la interrupción de tipo salvaje
PIK3CA
alelo por recombinación homóloga dirigida, mientras que el
PIK3CA
célula de tipo natural la línea se ha obtenido mediante la interrupción del mutante
PIK3CA
alelo (una especie de regalo de B. Vogelstein) [7]. Como tal, la composición genética de estas células se diferencia sólo en el
PIK3CA
locus, lo que hace estos controles isogénicas de otro modo perfecto. Encontramos similares de IC50 para NVP-BEZ235 tanto en
PIK3CA
células DLD-1 de tipo salvaje y mutante (media IC
50 de tres experimentos separados = 15,1 ± 6,0 y 12,1 ± 4,3 nM para DLD-1
PIK3CA
líneas de células de tipo salvaje y mutante, respectivamente; p = 0,82, Figura 2A). Western blot de p-AKT y p-S6 reveló inhibición de la sostenida p-AKT
Ser473, p-S6
Ser235 /236, y p-S6
Ser240 /244; sin embargo, la inhibición de la p-AKT
Thr308 fue transitoria en ambas líneas celulares (Figura 2B). Además, el tratamiento NVP-BEZ235 no aumentó los niveles de PARP escindido caspasa-3 y se escindió en cualquiera de las líneas de células (Figura 2B). En conjunto, estos hallazgos sugieren que
PIK3CA
estado mutacional no predicen la eficacia del tratamiento con NVP-BEZ235 en líneas celulares de CRC humanos.
(A) La viabilidad celular de tipo salvaje y mutante isogénica
PIK3CA
células se evaluó por el ensayo de MTS después del tratamiento con concentraciones crecientes (0 a 500 nM) de NVP-BEZ235 durante 48 horas. Los resultados mostrados son la media de cuatro experimentos independientes. (B) Análisis de Western blot para p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, p-S6
Ser240 /244, p-S6
Ser235 /236, se escindió de la caspasa 3, y se escindió de PARP se llevó a cabo después de 2, 6, 24, y 48 horas de incubación con (-). 0 o (+) 500 nM NVP-BEZ235
en vivo induce tratamiento
NVP-BEZ235 regresión tumoral en un modelo GEM para PIK3CA esporádica de tipo salvaje CRC
para examinar los efectos de
in vivo
tratamiento NVP-BEZ235 sobre el crecimiento tumoral del colon, se utilizó un novedoso modelo GEM de CCR esporádico que hemos descrito recientemente [11]. Adenovirus que expresan la recombinasa Cre (adeno-Cre) fue utilizado para inducir tumores de colon en floxed
Apc
ratones. Los tumores de los 10 ratones se analizaron para la presencia de mutaciones activadoras de la secuenciación directa de los exones 9 y 20 del gen
PIK3CA
. No se identificaron mutaciones, lo que sugiere que estos ratones son representativos de
PIK3CA
de tipo salvaje CRC. colonoscopia óptica se utiliza para cambiar aleatoriamente el tratamiento de los tumores de colon de tamaño comparable con el vehículo de la droga de control o 45 mg /kg NVP-BEZ235 por sonda oral al día durante 28 días. No observamos ningún efectos tóxicos o secundarios durante este régimen de tratamiento de drogas. crecimiento longitudinal posterior o la regresión de los tumores de colon individuales se determinó mediante colonoscopia óptica, tal como se describe anteriormente [11]. Para cada tumor, un Index (TSI) métrica relativo del tumor Tamaño se calculó como el tamaño del tumor (T) normalizado a área luminal del colon (L) (Figura 3A).
Los ratones con tumores de colon fueron aleatorizados para el tratamiento con el control diluyente (N = 8) o 45 mg /kg NVP-BEZ235 (N = 8) por sonda oral diariamente durante 28 días. Como resultado el crecimiento del tumor de colon o de regresión fue examinado en serie por colonoscopia óptica. (A) El tamaño del tumor Index (TSI) se calculó como área del tumor (T) dividido por Lumen Area (L) x 100. (B) colonoscopia tumor Representante imágenes fijas durante el período de tratamiento de 28 días. (C) El volumen del tumor de control y tumores NVP-BEZ235 tratos en la necropsia (media de 65 mm
3 frente a 5 mm
3; p = 0,01). (D) final TSI vs. volumen del tumor (R
2 = 0,89, P & lt; 0,0001). Cambio en la media de ETI (E) de control (tratamiento previo frente a 57% después del tratamiento el 32%, P = 0,01) y (F) tratados (32% vs. 20%, p = 0,02) cohortes.
Un curso temporal representativa de las imágenes de la colonoscopia para el control (n = 8) y los tumores tratados con NVP-BEZ235 (n = 8) se muestra en la Figura 3B. El volumen del tumor en la necropsia fue significativamente mayor en los grupos tratados frente al control (65 mm
3 frente a 5 mm
3; p = 0,01; Figura 3C). De acuerdo con nuestros análisis anteriores [11], la final ETI en ambos grupos de tratamiento se correlacionó positivamente con el volumen del tumor en la necropsia (R
2 = 0,89, p = 0,0001; Figura 3D). La ETI media en el grupo control aumentó significativamente durante el período de tratamiento (32% frente a un tratamiento previo 57% post-tratamiento, p = 0,01; Figura 3E), mientras que en la cohorte de NVP-BEZ235 disminuyó significativamente (36% vs. 20%, p = 0,008; Figura 3F). Cada tumor en el grupo control aumentó de tamaño; todos los tumores tratados disminuyeron en tamaño. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que
in vivo
tratamiento con resultados NVP-BEZ235 en una regresión significativa en
PIK3CA
de tipo salvaje tumores colónicos.
In vivo
tratamiento NVP-BEZ235 de un modelo GEM de resultados esporádicos CRC en la inhibición mTORC1 y mTORC2 sostenida, pero PI3K transitoria bloqueo
para examinar los efectos de los
in vivo del tratamiento
NVP-BEZ235 de PI3K y la señalización de mTOR, análisis de transferencia Western se realizó en tumores de colon que fueron cosechados una hora después de la dosificación de fármaco final en los días 5 y 28 de tratamiento. El análisis de transferencia Western para los niveles de p-AKT
Thr308, p-S6
Ser240 /244, y p-AKT
Ser473 se realizó como sustitutos para la activación de las vías PI3K, mTORC1 y mTORC2, respectivamente. Una disminución sostenida de los niveles de p-AKT
Ser473 y p-S6
Ser240 /244 se observó en los tumores de los ratones tratados con NVP-BEZ235, en comparación con el control de diluyente (Figura 4A y 4B). Estos resultados fueron confirmados por inmunohistoquímica del tumor (Figura 4C). Al igual que con nuestros
in vitro
estudios en, una disminución inicial en los niveles de p-AKT
Thr308 se observó a cinco días después del tratamiento, pero normalizado por 28 días (Figuras 4A y 4B). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que
in vivo
tratamiento da como resultado NVP-BEZ235 en la inhibición sostenida mTORC1 y mTORC2, pero el bloqueo de PI3K transitoria.
Los ratones con tumores de colon se asignaron al azar al tratamiento con diluyente control o 45 mg /kg NVP-BEZ235 por alimentación forzada oral diaria durante cinco días. Western blot de p-AKT
Thr308, p-AKT
Ser473, y p-S6
Ser240 /244 se llevó a cabo para los tumores tratados con (-) diluyente control o (+) NVP-BEZ235 para ( a) cinco y (B) de 28 días. (C) La inmunohistoquímica de p-AKT
Ser473, p-S6
Ser240 /244, y p-S6
Ser235 /236 se llevó a cabo para los tumores tratados con diluyente control o NVP-BEZ235 durante 28 días.
en vivo
tratamiento NVP-BEZ235 de un modelo GEM de CCR esporádico inhibe la proliferación, no tiene ningún efecto sobre la apoptosis y la angiogénesis tumoral bloques
para examinar los efectos de
in vivo
tratamiento NVP-BEZ235 sobre la proliferación celular, los tumores de colon fueron examinados por inmunohistoquímica para el marcador de proliferación Ki-67. Este análisis reveló que la proliferación disminuido en un 56% después de 28 días de tratamiento NVP-BEZ235 (p = 0,003, Figura 5A). Para evaluar el efecto del tratamiento NVP-BEZ235 sobre la apoptosis celular, los tumores de colon fueron examinados mediante el ensayo TUNEL. No se observaron diferencias entre los tumores tratados con diluyente de control y NVP-BEZ235 (p = 0,9, Figura 5B). Como las vías PI3K y mTOR desempeñan un papel importante en la angiogénesis del tumor [54], [55], se examinaron los efectos del tratamiento con NVP-BEZ235 en la densidad de microvasos (MVD) a través de inmunohistoquímica para el marcador CD31 endotelial. Este análisis reveló que MVD disminuyó en un 75% después de 28 días de tratamiento NVP-BEZ235 (p = 0,013, Figura 5C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que
in vivo
tratamiento con resultados NVP-BEZ235 en una disminución significativa en la proliferación de tumor, no induce la apoptosis celular, e inhibe la angiogénesis tumoral.
Representante
(A) inmunohistoquímica para el marcador de proliferación Ki-67 después del tratamiento con diluyente control o NVP-BEZ2355 durante 28 días (p = 0,003). índice de proliferación KI-67 se calculó como número medio de células tumorales positivas por campo de alta potencia. (B) TUNEL inmunohistoquímica se realizó en los tumores tratados con diluyente control o NVP-BEZ235 durante 28 días (p = 0,9). tinción TUNEL se cuantificó como porcentaje de células positivas por campo de alta potencia. (C) inmunohistoquímica Representante de la PECAM marcador endotelial después del tratamiento con diluyente control o 45 mg /kg NVP-BEZ2355 (p = 0,013). la densidad de microvasos se calculó como el número promedio de vasos positivos por campo de alta.
Discusión
Debido a su papel central en la iniciación y progresión del CRC, el bloqueo de la mTOR y PI3K las rutas de señalización se ha convertido en un objetivo atractivo para el desarrollo de nuevas terapias de CRC [10], [56] - [59]. Nosotros y otros han demostrado la eficacia de la inhibición de la vía mTORC1 en modelos preclínicos de CRC [11], [12]. Sin embargo, un ensayo clínico temprano examinar inhibidores mTORC1 en pacientes con CRC humanos demostró resultados modestos, quizás debido a la pérdida de un bucle mTORC1 dependiente de retroalimentación que limita la activación de PI3K y /o la continuación de la activación mTORC2 mediada por AKT [3], [60]. Tomados en conjunto, parece inhibidores duales de PI3K /mTOR, como NVP-BEZ235, son necesarios para la máxima eficacia terapéutica.
Algunos estudios han sugerido que
PIK3CA
cánceres mutantes son "oncogenically adictas" a la la señalización de PI3K, que conduce a aumento de la sensibilidad a la terapia de inhibidor de PI3K [7], [61], [62]. Sin embargo, un grupo ha informado de ninguna asociación entre el
PIK3CA
estado mutacional y la respuesta a los inhibidores de PI3K [63]. Sin embargo, otro grupo ha informado exclusivamente de orientación
PIK3CA
pacientes mutantes para la terapia de PI3K /mTOR [64]. Como
PIK3CA
mutaciones se observan en sólo el 17% de CRC humana, este enfoque podría limitar significativamente el impacto clínico de estos agentes [53]. Debido a NVP-BEZ235 igualmente inhibe las formas mutantes y de tipo salvaje de
PIK3CA
, la hipótesis de que NVP-BEZ235 tendría una eficacia significativa en humanos de tipo salvaje
PIK3CA
CRC [32]. En apoyo de esto, encontramos una sensibilidad comparable a
in vitro
tratamiento NVP-BEZ235 en
PIK3CA (dominio mutación HCT116, quinasa; DLD-1, helicoidales mutación de dominio)
mutante y
PIK3CA
de tipo salvaje (SW480) líneas celulares de CRC, así como en
PIK3CA
líneas celulares isogénicas de tipo salvaje y mutante emparejados. La secuenciación directa de las regiones de puntos calientes en los exones 9 y 20 de
PIK3CA Hoteles en los tumores de colon validado nuestro modelo GEM como un sustituto de
PIK3CA
CRC de tipo salvaje, que utilizamos en nuestro
in vivo estudios de tratamiento
NVP-BEZ235. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el tratamiento con NVP-BEZ235 puede tener un beneficio clínico en el 83% de los pacientes con CCR de tipo salvaje
PIK3CA
. A fin de evaluar esta función, hemos tratado de examinar si NVP-BEZ235 sería eficaz en un modelo GEM para esporádica
PIK3CA
de tipo salvaje CRC.
tradicional
in vivo
enfoques de validación de destino se basan en plataformas de xenoinjerto. Desafortunadamente, estos modelos no son verdaderamente predictivos de la respuesta en pacientes humanos, ya que se derivan de líneas de células tumorales de alto pasaje cultivadas
in vitro
. Estas líneas de células se implantan en sitios ectópicos que no se parecen el microambiente del colon, y por lo tanto no logran recapitular la naturaleza heterogénea de cáncer y su estroma de sostén [65]. Aunque los modelos de cáncer de GEM frente a estas carencias, la mayoría de los modelos GEM emplean la línea germinal o modificación de todo el tejido de los genes que se sabe están mutados en CRC humano. Además, muchos modelos CRC GEM principalmente presentes con pequeños tumores intestinales [66]. Para modelar con precisión humana CRC esporádica, hemos descrito recientemente un procedimiento en el que se administra adeno-Cre a floxed ratones para inactivar somáticamente la Red gen
Apc de una manera estocástica y restringir la formación de tumores en el colon distal. La localización anatómica reproducible de estos tumores permite el uso de la colonoscopia óptica para examinar tumores individuales de manera longitudinal [11].
Para examinar la eficacia de
in vivo
tratamiento NVP-BEZ235, nos utilizado nuestro modelo GEM de CCR esporádico. En nuestros estudios, hubo una fuerte correlación entre los tamaños finales de tumores evaluados por colonoscopia frente a la necropsia (R
2 = 0,89), validando así el tamaño del tumor nuestro protocolo basado en la colonoscopia. De acuerdo con nuestro
in vitro
tratamiento NVP-BEZ235 de CRC líneas celulares humanas, tumores del colon desde el modelo GEM disminuido en un 43% en el tamaño después de
in vivo
tratamiento con NVP-BEZ235, mientras tumores de control aumentaron de tamaño por 97% (p & lt; 0,0001). Resultados similares han sido reportados con otro inhibidor de PI3K /mTOR dual, PKI-587, en un modelo de xenoinjerto de CRC [67].