Extracto
pancreático adenocarcinoma ductal es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo, con ningún tratamiento satisfactorio hasta la fecha. En este estudio, hemos probado si la inhibición combinada de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y la clase I de histona desacetilasa (HDAC) puede resultar en un mejor control de adenocarcinoma ductal pancreático. El impacto de la HDAC concomitante y la inhibición de la COX-2 sobre el crecimiento celular, se evaluó la apoptosis y el ciclo celular primera
in vitro
de páncreas humano BxPC-3, PANC-1 o CFPAC-1 en las células tratadas con inhibidores químicos ( SAHA, MS-275 y celecoxib) o HDAC1 /2/3/7 siRNA. Para probar el potencial actividad antitumoral de esta combinación
in vivo
, hemos desarrollado y caracterizado, una chica refinada membrana corioalantoidea modelo de tumor histológicamente y que imita proteomically humana adenocarcinoma ductal pancreático. La combinación de HDAC1 /3 y la inhibición de la COX-2 altera significativamente la proliferación de células BxPC-3
in vitro Opiniones y estancado por completo el crecimiento del tumor BxPC-3 células en la membrana corioalantoidea
in vivo
. La combinación fue más eficaz que cualquiera de los fármacos se usan solos. En consonancia, se demostró que tanto HDAC1 y la inhibición HDAC3 induce la expresión de la COX-2 a través de la ruta de NF-kB. Nuestros datos demuestran, por primera vez en un modelo pancreático ductal Adenocarcinoma (PDAC), una acción importante de la HDAC y inhibidores COX-2 sobre el crecimiento de células de cáncer, que establece la base para el desarrollo de nuevas terapias combinatorias potencialmente eficaces para el adenocarcinoma ductal pancreático pacientes
Visto: Peulen. O, González A, P Peixoto, Turtoi A, D Mottet, Delvenne P, et al. (2013) El efecto antitumoral de HDAC inhibición en un modelo de cáncer de páncreas humano es significativamente mejorada por la simultánea inhibición de la ciclooxigenasa 2. PLoS ONE 8 (9): e75102. doi: 10.1371 /journal.pone.0075102
Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: May 7, 2013; Aceptado: August 12, 2013; Publicado: 11 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Peulen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Nacional de Investigación Científica Bélgica (http://www.frs-fnrs.be) y Télévie; el Centro Anti-Cancéreux près de l'Université de Liège (http://www.cac.ulg.ac.be). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. A. González es un compañero de Télévie. A. y D. Turtoi Mottet son, respectivamente, Investigador Postdoctoral e Investigador Asociado en el Fondo Nacional de Investigación Científica Bélgica
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
listas de páncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) entre la forma más mortal de los cánceres [1]. Early-etapa de la enfermedad es clínicamente silente y el diagnóstico de la enfermedad se hace sobre todo en una fase avanzada. Este diagnóstico tardío contribuye a uno de la tasa de supervivencia a 5 años más baja (sólo el 3%) [2]. Hoy PDAC son tratados por cirugía y /o terapia adyuvante con gemcitabina, aumentando sólo ligeramente la mediana de supervivencia de los pacientes. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas terapias eficaces para los pacientes PDAC.
Existen abundantes pruebas que indican que la desregulación de la acetilación de histonas contribuye al desarrollo del cáncer de páncreas y la progresión [3]. desacetilasas de histonas (HDAC) representan una familia de enzimas que regulan las actividades celulares incluyendo Paramount silenciamiento epigenético de genes supresores de tumores y la modulación de funciones de la proteína. Nosotros y otros han demostrado que la inhibición de HDAC ejerce tanto contra el cáncer y las actividades anti-angiogénesis [4] - [6]. expresión HDAC se altera en PDAC, incluyendo HDAC1, HDAC2, HDAC3 y HDAC7 [7] - [10]. Los estudios preclínicos han sugerido que la inhibición de HDAC tienen un potencial significativo para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer [11]. En consecuencia, varios inhibidores HDAC han sido recientemente aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos para el tratamiento de cutáneo de células T linfoma mientras que nuevas moléculas están actualmente en ensayos clínicos de fase III. Sin embargo, cuando se usa en monoterapia, los inhibidores de HDAC mostraron una eficacia limitada en diversos tumores malignos sólidos, incluyendo PDAC [3], [12], [13]. De hecho, LAQ824 o MS-275 se han evaluado en fase I de ensayos clínicos en los cánceres sólidos, incluyendo PDAC, sin ninguna respuesta clínica objetiva [14], [15]. Alternativamente, los inhibidores de HDAC se han utilizado en las estrategias de terapia combinada [16], [17], con algunas combinaciones de generar efectos prometedores para PDAC humano
in vitro
[18] - [21] o en tumores experimentales [22] . Por desgracia, estos resultados no se traducen en los ensayos clínicos [23], [24].
La falta de eficacia de los inhibidores de HDAC en el cáncer de páncreas podría estar relacionado con las actividades pleiotrópicos de las HDAC en biología celular [25], [26] conduce a efectos pro-cáncer no deseados. Por ejemplo, un estudio reciente ha demostrado que los inhibidores de pan-HDAC inducen la expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) en células de cáncer de pulmón, que conduce a una estimulación de la proliferación de las células endoteliales [27]. Desde COX-2 ha sido también asociado a la proliferación de páncreas de células de cáncer [28] o el crecimiento del tumor [29] - [31], la hipótesis de que la COX-2 sobreexpresión también puede ser inducida en PDAC cuando se tratan con inhibidores de HDAC, lo que lleva a la reducción de la eficiencia y el fracaso de ahí terapéutico.
Para probar la importancia biológica de la combinación de la clase I de HDAC y los inhibidores de la COX-2
in vivo
, ideamos un modelo refinado de pollo PDAC corioalantoidea membrana (CAM) en base a nuestra trabajos anteriores [32]. El modelo de CAM se ha utilizado con éxito con varias líneas celulares para producir tumores [33], [34]. Al igual que en el modelo murino, la mayoría de las etapas de la progresión tumoral se recapitulan en un período muy corto de tiempo [35]. Anteriormente, BxPC-3 células de cáncer de páncreas ya se demostraron para producir vascularizados 100 micras linfáticos tumorales largos en CAM [32]. Sin embargo, el pequeño tamaño de los nódulos representa una limitación significativa para la observación estructural, evaluación volumen exacto y el estudio de la eficacia del fármaco. Aquí, hemos establecido e implementado un modelo de BxPC-3 refinada PDAC que ofrece un aumento espectacular (64 veces) en el tamaño del tumor y la visualización de la arquitectura estructural y la expresión de proteínas que imitan PDAC humano. Este modelo se aprovechara para demostrar que la combinación de HDAC de clase I y los inhibidores de la COX-2 como resultado una inhibición del crecimiento tumoral completa.
Materiales y Métodos
Las células y productos químicos
BxPC-3 (ATCC CRL-1687), PANC-1 (ATCC CRL-1469) y CFPAC-1 (ATCC CRL-1918) son líneas celulares de cáncer pancreático humano derivados, respectivamente, de PDAC [36], páncreas conducto epitelioide carcinoma [37 ] y metástasis hepática PDAC [38]. BxPC-3 fueron un generoso regalo del Prof. Bikfalvi (u1029 Inserm, Burdeos, Francia), Panc-1 fueron un generoso regalo del Prof. Muller y Burtea (RMN Laboratory, Universidad de Mons, Bélgica). CFPAC-1 fueron comprados de ATCC. Celecoxib se obtuvo de la Universidad de Farmacia (Kemprotec Ltd, Middlesbrough, Reino Unido). MS-275 y SAHA fueron adquiridos de Enzo Life Sciences (Antwerpen, Bélgica). Otros productos químicos fueron adquiridos de Sigma (Bornem, Bélgica).
Cultivo de células BxPC página 3 línea celular de cáncer
pancreática humana se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con glucosa (2,5 g /L), sodio piruvato (1 mM) y FBS (10%). PANC-1 se mantuvieron en DMEM suplementado con FBS (10%). CFPAC-1 se mantuvieron en Iscove medio de Dulbecco modificado con FBS (10%). Las células se trataron con MS-275, celecoxib o combinación de ambos, así como con suberoilanilida ácido hidroxámico (SAHA) solubilizado en medio con 0,1% de DMSO.
pequeños ARN de interferencia transfección
HDAC específica pequeños ARN de interferencia (siRNA) se sintetizaron por Eurogentec (Seraing, Bélgica). NF-kB p65 SmartPool siRNA fueron comprados de Thermo Fisher-Dharmacon (Whaltham, MA). transfecciones mediadas por Lipofectamine se realizaron a una concentración de siRNA de 40 nM siguiendo las recomendaciones del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, NM). GL3 fue un irrelevantes siRNA dirigidos a luciferase. secuencias de siRNA fueron publicados anteriormente [5].
El crecimiento celular
La igualdad de las densidades de células se sembraron en medio completo y se cosecharon a los puntos de tiempo indicados. Los números de células se determinaron indirectamente utilizando Hoechst incorporación. Los resultados se expresaron como el contenido de ADN.
-transferencia Western
BxPC-3 células o tumores congelados se rompieron en tampón de lisis (1% de SDS, 40 mM Tris-HCl pH 7,5) en el presencia de inhibidores de la proteasa y fosfatasa. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE (6-12,5%), entonces electrotransfered sobre membranas de nitrocelulosa. Después de anticuerpos primarios fueron utilizados: anti-COX-2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI), anti-HDAC1 (Señalización Celular, Danvers, MA), anti-HDAC2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-HDAC3 (señalización celular, Danvers, MA), anti-acetilada-histona-3 (Millipore, Billerica, MA), anti-HDAC7 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-fosfo-IkBα (señalización celular, Danvers, MA ), anti-p65 (señalización celular, Danvers, MA), anti-p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-p27 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), anti-PRB (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ), anti-E2F1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti MEK2-(señalización celular, Danvers, MA), anti ORC2-(señalización celular, Danvers, MA), anti-caspasa-3 (señalización celular , Danvers, MA) y anti-HSC70 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). La inmunodetección se realizó con el anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano picante.
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR
Extracción de ARN total y cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó como se describió anteriormente [39] . La expresión humana COX-2 se detectó utilizando un ensayo TaqMan RT-qPCR comercial (Hs00153133-m1; Applied Biosystems, Carlsbad, NM). la expresión de IL-8 humana se detectó utilizando directo específico (5'-GAAGGAACCATCTCACTGTGTGTAA-3 ') e inverso (5'-ATCAGGAAGGCTGCCAAGAG-3') cebadores sintetizados por Eurogentec (Seraing, Bélgica).
Anexina V /propidio yoduro de tinción
las células apoptóticas se determinaron por el colorante yoduro de propidio anexina V-FITC y no vital (PI) de la tinción con un kit de detección de apoptosis FITC-anexina V I (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. Citometría de flujo se realizó en un citómetro II ™ y las muestras se analizaron utilizando el software CellQuest ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
análisis del ciclo celular
El porcentaje relativo de células en cada fase del ciclo celular se analizó como se describe anteriormente [33] por el análisis de citometría de flujo con el programa FACSCalibur ™ II y ModFit LT ™.
el crecimiento del tumor en CAM
huevos de pollo fertilizados se abrieron a lo descrito previamente [32]. En post-fertilización día 11, la superficie de CAM fue suavemente rascó con una aguja y 3,5 × 10
se injertaron 6 BxPC-3, PANC-1 o células CFPAC-1 en suspensión con 50% de Matrigel en un volumen final de 100 l en la CAM encerrada por un anillo de plástico de 6 mm. El día de la implantación se consideró como día 0 del desarrollo del tumor. Drugs (celecoxib 8 M y /o MS-275 0,2 M en un volumen final de 30 l) se aplicó diariamente directamente sobre el tumor a partir de día 2. En el día 7, los tumores fueron extirpados de la CAM y las imágenes digitales fueron tomadas usando un microscopio estereoscópico . El volumen del tumor se calculó usando una fórmula del elipsoide: Volumen = (4 × πxZ
1 × Z
2 × Z
3) /3 donde Z
1-3 son el radio principal del tumor.
Ética declaración
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección de los animales de la Universidad de Lieja (aprobación#1278).
Histología procedimiento
BxPC -3 tumores se lavaron en PBS y después se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos a 4 ° C. Los tumores fueron incluidos en parafina y 5 micras secciones se tiñeron con hematoxilina-eosina o tricrómico de Masson.
inmunoperoxidasa y Schiff tinción ácido-amilasa periódico (PAS) se realizaron en 5 secciones micras, respectivamente, con el punto de referencia XT IHC /ISH de tinción automatizado y las manchas Nexes Especial (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ) según las instrucciones del fabricante. Se utilizaron siguientes anticuerpos: anti-citoqueratina 7 (CK7 - Dako, Glostrup, Dinamarca), anti-citoqueratina 19 (CK19 - Roche Diagnostics, Vilvoorde, Bélgica), anti-citoqueratina 20 (CK20 - Dako, Glostrup, Dinamarca), anti- proteína de unión al factor de crecimiento transformante beta - (Roche Diagnostics, Vilvoorde, Bélgica CEA), anti-Ki67 (Dako, Glostrup, Dinamarca), anti-latente CD56 (Novocastra, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL), anti-antígeno carcinoembrionario 2 (LTBP2 - Santa Cruz Biotchnology, Santa Cruz, CA), anti-factor de crecimiento transformante beta-inducida (TGFBI - señalización celular, Danvers, MA), anti-myoferlin (Sigma, Bornem, Bélgica) y anti-desmina (Dako, Glostrup, Dinamarca) fueron utilizados para la reacción primaria.
Ki67 cuantificación se llevó a cabo en las fotografías tomadas al azar (3 fotos de cada tumor, 3 tumores en cada grupo experimental). Después de separarse de canal, azul canal cuadros fueron en binarios según el brillo. El tamaño de la superficie ocupada por todas las células o por las células Ki67 positivas se midió usando el software ImageJ 1.46r.
Con el fin de visualizar la vasculatura del tumor, las secciones de tejido de espesor rehidratadas (35 micras) se incubaron durante 30 min en la oscuridad con 0,05% de Triton X-100 en PBS que contenía 5 mg /ml
Sambucus nigra
aglutinina (SNA, vector Laboratories, Burlingame, CA). Las secciones se lavaron con 0,05% de Triton X-100 en PBS y se visualizaron con el microscopio confocal (Leica SP2). imágenes tridimensionales fueron reconstruidos con el software Imaris (Bitplane Scientific Software, Zurich, Suiza).
El análisis estadístico
Todos los resultados se presentaron como medias con desviación estándar. El análisis estadístico se realizó usando una sola vía o de dos vías ANOVA en función del número de factores de agrupación. medias de los grupos se compararon mediante la prueba posterior de una de Bonferroni. P & lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativo. Todos los experimentos se realizaron como 3 repeticiones biológica independiente.
Resultados
Clase I de HDAC inhibición de crecimiento de células cancerosas in vitro reducida páncreas
se han descrito
BxPC-3 células para expresar alterado niveles de clase I HDAC1, HDAC3 y clase II HDAC7 [40], [41]. Para evaluar el papel de éstas en la HDAC BxPC-3 células, lo primero que examinó su crecimiento dependiente del tiempo y dependiente de la concentración en presencia de SAHA, una clase I /II inhibidor (Figura 1A). Nuestros resultados confirmaron que BxPC-3 células fueron sensibles a SAHA, con una reducción de 50% de crecimiento (P & lt; 0,001) observada a 5 mM. HDAC1 A continuación, silenciados de forma selectiva, o -3 -7 utilizando siRNA para examinar la participación individual de éstos HDAC en la reducción del crecimiento inducida por SAHA. silenciamiento HDAC7 no afectó el crecimiento celular (Figura 1B). Sin embargo, HDAC1 y HDAC3 silenciamiento redujeron significativamente el crecimiento de células BxPC-3 de respectivamente 50% (P & lt; 0,001) y 20% (P & lt; 0,001) (Figura 1C). Para evaluar esta disminución en el crecimiento celular con el fármaco clínicamente compatible, se evaluó el crecimiento dependiente del tiempo y dependiente de la concentración de BxPC-3 células en la presencia de MS-275 (HDAC1 y el inhibidor HDAC3). MS-275 (1 M) redujo el crecimiento de células BxPC-3 en un 50% (P & lt; 0,001), mientras que 5 micras abolieron completamente el crecimiento (P & lt; 0,001). (Figura 1D)
(A) Tiempo de efectos dependientes y dependientes de la dosis de SAHA sobre la proliferación celular. (B) Efecto dependiente del tiempo de la clase IIa HDAC7 silenciamiento sobre la proliferación celular. HDAC7 expresión se detectó por Western-blot 48h después de siRNA transfección. HSC70 se utilizó como control de carga. (C) Efecto dependiente del tiempo de la clase I HDAC1 o -3 silenciamiento sobre la proliferación celular .. HDAC1 y HDAC3 expresión se detectó mediante 48h western-blot después de siRNA transfección. HSC70 se utilizó como control de carga. (D) los efectos dependientes de la dosis de MS-275 sobre la proliferación celular *** P & lt dependiente del tiempo y; .001 frente a condiciones de DMSO o GL3. Los resultados se expresan como media ± SD, n≥3 en cada condición.
Inducida por la COX-2 expresión
inhibición de la clase I de HDAC in vitro
La eficacia limitada de los inhibidores de HDAC en los ensayos clínicos incluyendo pacientes PDAC se podría explicar, al menos en parte, por el potencial hasta la regulación de la expresión de COX-2 en las células malignas pancreáticas. Para evaluar esta hipótesis, analizamos primera expresión COX-2 en las células BxPC-3 silenciados por HDAC1, HDAC2, HDAC3 o tratados con MS-275. HDAC1 o HDAC3 inducida por la represión, respectivamente, una de 6,3 veces y un aumento de 4,8 veces de la COX-2 de expresión a nivel de proteínas (Figura 2A), mientras que el silenciamiento HDAC2 reduce la COX-2 expresión (Figura 2B). HDAC1 silenciamiento inducido una sobreexpresión HDAC2.
(A) de detección de Western-blot de la COX-2 y HDAC en 20 g BxPC-3 proteínas HDAC1 o 48 horas después de la transfección siRNA HDAC3. (B) la detección de Western-blot de la COX-2 y HDAC en 20 g BxPC-3 proteínas 48 horas después de la transfección siRNA HDAC2. efectos (C) Dependiente de la dosis de 48h tratamiento de la EM-275 en expresión COX-2. -Histona H3 acetilado se utilizó como control de la eficacia del tratamiento. HSC70 se utilizó como control de carga. (D) expresión relativa dependiente del tiempo de la COX-2 mRNA en células BxPC-3 se trató con 1 M MS-275. Los resultados se expresan como media ± S.D., n = 3.
Tratamiento de BxPC-3 células con MS-275 mostraron efectos similares sobre la COX-2 en la acumulación de una operación de concentración dependerá (Figura 2C). Para determinar si la inducción de COX-2 se produce a nivel de la transcripción, se analizó la COX-2 mRNA nivel por RT-qPCR tras 6, 12 y 24 h de tratamiento de la EM-275. Se encontró que la COX-2 en la expresión de genes fue hasta reguladas tras el tratamiento de la EM-275 de una manera dependiente del tiempo (Figura 2D).
Para estudiar los mecanismos por los que la inhibición de clase I de HDAC induce la COX-2, exploramos la relación conocida entre el NF-kB y HDAC1 /3 [42], [43] y puesto a prueba la posibilidad de que inducida por MS-275 expresión de COX-2 podría ser NF-kB dependiente. En consecuencia, las células con EM-275 y BAY-11-7082, un IkBα quinasa (IKK) concomitante con inhibidores trataron. BAY-11-7082 reduce en un 30% a 90% la expresión de la COX-2 siguiente respectivamente 6h a 48h de tratamiento MS-275 (Figura 3A), lo que sugiere la expresión inducida por MS-275 de la COX-2 es, al menos en parte , NF-kB dependiente. Esta hipótesis fue apoyada por p65-silenciamiento y la translocación de p65 en el núcleo. COX-2 se indujo la expresión por un tratamiento de 24 horas con MS-275 y fue impedido por p65 siRNA (Figura 3B). Por otra parte, 24h tratamiento MS-275 indujo un aumento de 50% del nivel de proteína p65 en el citoplasma y en la fracción de cromatina de BxPC-3 células (Figura 3C). El mismo tratamiento MS-275 indujo la expresión génica de IL-8 (Figura 3D), un objetivo directo de NF-kB.
(A) Efecto de un inhibidor de IKK (10 M BAY-11-7082) el 1 de M EM-275-inducida por la COX-2 de expresión. Fosfo-IkBα se utilizó como control de BAY 11-7082-eficacia del tratamiento. HSC70 se utilizó como control de carga. Densitometría se expresó como una relación de COX-2 /HSC70 o IkBα /HSC70. (B) la detección de Western-blot de la COX-2 en 20 g BxPC-3 proteínas a partir del 1 M EM-275 tratamiento y p65 siRNA transfección. HSC70 se utilizó como control de carga. (C) de detección de Western-blot de p65 en 15 g BxPC-3 citoplasma, nucleoplasma o proteínas asociadas a la cromatina después del tratamiento 1 M EM-275. MEK2 y ORC2 se utilizaron como control de carga, respectivamente, en fracciones de citoplasma y la cromatina. Densitometría se expresó como una p65 /p65 o MEK2 /relación de ORC2. (D) expresión relativa dependiente del tiempo de IL-8 mRNA en células BxPC-3 se trató con 1 M MS-275, 10 mM Celecoxib o una combinación de los fármacos. Los resultados se expresan como media ± s.d. *** P & lt; 0,001, * P & lt; 0,05 frente a DMSO. n≥3 en cada condición.
inhibición combinada de la clase I de HDAC y COX-2 inhibe el crecimiento celular in vitro
Con el fin de validar nuestra hipótesis de que la clase I de HDAC inhibición mediada por la inducción de la COX-2 puede contribuir a la baja eficacia de la terapia a base de HDAC en pacientes PDAC, hemos combinado este último con celecoxib, un inhibidor selectivo de la COX-2 en IC50 (respectivamente 1 M de MS-275 y 10 mM de celecoxib). El inducida por MS-275 COX-2 sobreexpresión condujo a un aumento del 50% de la concentración de PGE2 en el medio de cultivo (Figura 4A). tratamiento con células BxPC-3 con celecoxib solo o en combinación con MS-275 redujo significativamente la PGE
2 concentración en el medio celular. A continuación, analizó el impacto de estos tratamientos sobre el crecimiento celular. La combinación de los dos fármacos redujo significativamente (& gt; 85%, P & lt; 0,001), el crecimiento de las células BxPC-3 en comparación con el uso de cualquiera de los fármacos solos (Figura 4B). A continuación pregunta la cuestión de si esta reducción se debe a la inducción de la apoptosis y se realizó una tinción con yoduro de anexina V /propidio a las 24, 48 y 72 h (Figura 4C) después del tratamiento. Ninguno de los fármacos individuales ni su combinación fueron capaces de inducir apoptosis. Estos resultados fueron confirmados por Western-blot, que muestra intacta la caspasa-3 en todas las muestras (Figura 4C). Para investigar más a fondo los mecanismos de la detención del crecimiento celular observada, se examinó el efecto de la EM-275 de combinación /celecoxib sobre el ciclo celular (Figura 4D). MS-275 solo, pero no el celecoxib, el aumento de la proporción de células en G1 en un 50% a las 48 h. Sin embargo, MS-275 /combinación celecoxib redujo significativamente (P & lt; 0,001) la proporción de células en fase S en 24 (-74%), 48 (-92%) y 72 h (-82%) y aumentó significativamente (P & lt; 0,001) la proporción en la fase G1 a 24 (+ 48%), 48 (+ 119%) y 72 h (+ 80%). Para validar estos resultados se analizaron por Western blot la expresión de marcadores de ciclo celular y encontramos una clara acumulación de p21
WAF1 y p27
Kip1, dos inhibidores del ciclo celular, a las 24h y 48h después de la coadministración de MS- 275 y celecoxib (Figura 4E). En consonancia, la forma hiperfosforilada de PRB fue menos abundante cuando las células BxPC-3 fueron tratados con co-EM-275 /celecoxib. La forma hypophosphorylated de PRB apareció con el co-inhibición de HDAC de clase I y COX-2. La proteína pRb entera desapareció a las 48 h después del tratamiento concomitante. Esta desaparición ya fue observado por otros después de una p21
WAF1 o p27
Kip1 acumulación [44]. El factor E2F1 transcripción, un orquestador de la fase S, se convirtió en 48h indetectable después de la coadministración de MS-275 y celecoxib. Estos resultados muestran que la inhibición del crecimiento celular se asocia a un bloqueo de fase G0 /G1.
ensayo (A) ELISA de PGE
2 en cultivo celular 24 horas después de los medios de comunicación y 48h 1 M MS-275 y 10 micras el tratamiento con celecoxib. (B) efectos dependientes del tiempo de MS-275 y celecoxib sobre el crecimiento celular. (C) los efectos dependientes del tiempo de 1 M MS-275 y 10 mM celecoxib en la proporción de células apoptóticas por la anexina V /PI citometría de flujo y en la caspasa-3 de escisión. (d) los efectos dependientes del tiempo de 1 M MS-275 y 10 mM celecoxib en el ciclo celular mediante la incorporación PI. (E) de detección de Western-blot de p21, p27, PRB ppRb y E2F1 en 20 g BxPC-3 proteínas de 6 a 48 horas después de 1 M EM-275 y 10 mM tratamiento con celecoxib. HSC70 se utilizó como control de carga. Los resultados se expresan como media ± s.d., *** P & lt; 0,001, ** P & lt; 0,01, * P & lt; 0,05 en comparación con DMSO o indicados condiciones. n≥3 en cada condición.
BxPC-3 es una línea celular PDAC se caracteriza por su tipo salvaje KRAS, mientras que las mutaciones del gen que codifica para esta proteína es la alteración genética más común observado en PDAC humano. Sin embargo, BxPC-3 células sobreexpresan la COX-2, una situación observó en 50% de los PDAC humano. Hemos decidido ampliar nuestras observaciones con respecto al interés del tratamiento combinado en el cáncer pancreático mediante el examen de la eficacia de dicho tratamiento combinado en dos líneas de células de páncreas humano con mutaciones KRAS reportados. La primera línea celular fue PANC-1 ([12 ASP] -KRAS) en la que no fue detectado COX-2 en el nivel de la proteína [45]. La segunda línea celular fue CFPAC-1 ([12 VAL] -KRAS) pero en el que se detectó la COX-2 en el nivel de proteína [45].
PANC-1 línea celular se cultivó con MS-275, celecoxib o ambos fármacos en combinación. Celecoxib 10 M no alteraron el crecimiento celular cuando MS-275 1 mM redujeron significativamente (p & lt;, 001) el crecimiento celular en un 32%. La combinación de los dos fármacos redujo el crecimiento de las células PANC-1 (49%, P & lt; 0,001). Sin embargo, la inhibición del crecimiento combinación inducida no fue significativamente diferente de la inducida por el MS-275 (Figura 5A). En esta línea celular, MS-275 no indujo la expresión de COX-2 (datos no mostrados)
.
(A) efectos dependientes del tiempo de MS-275 y celecoxib sobre el crecimiento celular PANC-1. (B) efectos dependientes del tiempo de MS-275 y celecoxib sobre el crecimiento celular CFPAC-1. (C) de detección de Western-blot de la Cox-2, p21, p27 en 30 g CFPAC-1 proteínas 48h después del 1 M EM-275 y 10 mM tratamiento con celecoxib. HSC70 se utilizó como control de carga. Los resultados se expresan como media ± s.d., *** P & lt; 0,001 frente a DMSO o indicadas condiciones. n≥3 en cada condición.
CFPAC-1 línea celular se cultivó en las mismas condiciones. Celecoxib 10 mM redujeron el crecimiento celular en un 54% (p & lt;, 001) y MS-275 1 mM redujeron el crecimiento celular en un 59% (p & gt;, 001). Aquí, la combinación de los dos fármacos redujo significativamente (79%, P & lt; 0,001) CFPAC-1 de crecimiento de células en comparación con cualquiera de los fármacos solos (Figura 5B). A continuación, analizó mediante transferencia Western la expresión de marcadores del ciclo celular de la COX-2 y en las células CFPAC-1 48h después de la administración de drogas. Hemos demostrado una acumulación inducida por MS-275 de la COX-2 como en BxPC-3 células (Figura 5C). Encontramos también una acumulación de p21
WAF1 y p27
Kip1 después de la coadministración de MS-275 y celecoxib (Figura 5C), lo que sugiere una detención del ciclo celular.
BxPC-3 tumoral CAM imita humana PDAC
la evaluación de nuevos fármacos o combinaciones de fármacos para el cáncer de páncreas serán aliviadas por la disponibilidad de fácil, los modelos animales éticamente sostenibles y económicamente. Por lo tanto, hemos llevado a cabo para perfeccionar un modelo de páncreas humano membrana corioalantoidea (CAM) basada en el trabajo inicial [32]. Incorporación de BxPC-3 células en matrigel antes de la implantación CAM genera una importante mejora en el volumen del tumor. De hecho, después de la implantación, el volumen del tumor aumentó linealmente (r
2 = 0,87) hasta el día 7 (Figura 6A). En el momento de la recogida del tumor (día 7), un volumen medio del tumor de 59,95 ± 15,34 mm se observó
3 (n = 10). tumores BxPC-3 CAM crecieron en el interior del tejido conectivo CAM como un nódulo esférico único. El mismo procedimiento se siguió para líneas de células CFPAC-1 BxPC-3, PANC-1 y. PANC-1 no creció en CAM cuando CFPAC-1 creció como nódulos muy pequeños (1 mm de largo).
Las células (A) se implantaron sobre la CAM en el día embrionario 11 y se recogieron 2, 4, 5, 6 o 7 días después de la implantación. Macroscópicas imágenes se obtuvieron con la misma ampliación de la parte superior, inferior y lateral. Los resultados se expresan como media ± S.D., n & gt; 5 en cada punto de tiempo. (B) histológica (hematoxilina-eosina o tinción tricrómica de Masson) el análisis de tumores recogidos de 2, 4, 5, 6 o 7 días después de la implantación. (C) inmunohistología de tumores 7 días después de BxPC-3 de la implantación en CAM y los tumores PDAC humanos. CK7 = citoqueratina-7, CK19 = citoqueratina-19, CEA = antígeno carcinoembrionario, PAS = amilasa-periódico de Schiff tinción ácida.
BxPC-3 histología del tumor CAM (Figura 6B) reveló grandes islotes de cohesión células, algunas de las cuales mostraron una naciente luz central y fueron aislados unos de otros por una matriz extracelular que contiene colágeno con varias células similares a fibroblastos dispersos que demuestran la presencia de un estroma intersticial.
a fin de validar nuestro páncreas humano cáncer de modelos de cámara, se comparó la expresión de la citoqueratina-7, -19, -20, CD56, CEA y Ki67 mediante inmunohistoquímica para PDAC humano. También se verificaron de mucina y la producción de proteoglicanos utilizando la tinción con PAS. las células tumorales tanto de BxPC-3 tumor CAM y muestras PDAC fueron fuertemente positivas para citoqueratina-7 y -19, CEA y Ki67 (Figura 6C) pero negativo para citoqueratina-20 y CD56 (datos no mostrados). Tanto los tumores fueron positivos para la tinción de PAS. En conjunto, los datos mostraron notables histología y expresión de biomarcadores similitudes entre el modelo CAM BxPC-3 y PDAC de pacientes humanos.
Además, nuestro reciente trabajo sobre los biomarcadores dirigibles en PDAC humana [46] identificaron varios biomarcadores candidatos entre los cuales myoferlin, factor de crecimiento transformante beta inducido y latente factor de crecimiento transformante beta-proteína de unión 2. la inmunohistoquímica y western-blot confirmó la presencia de estos nuevos biomarcadores PDAC en los tumores de CAM BxPC-3 (Figura 7A-B). Por último, mediante Western blot confirmó que HDAC1, HDAC2, HDAC3 y COX-2 se expresan en el tumor BxPC CAM-3 (Figura 7A).
(A) de detección de Western-blot de HDAC1, HDAC2, HDAC3 , HDAC7, COX-2, TGFBI, MYOF, LTBP2 en 20 g PDAC-CAM o BxPC-3 proteínas. HSC70 se utilizó como control de carga. (B) el etiquetado de inmunoperoxidasa MYOF, TGFBI, LTBP2, la COX-2.
A continuación demostró que los tumores eran funcionalmente vascularizado. BxPC-3 vasos sanguíneos CAM se tiñeron por SNA conjugado con FITC y 3D reconstruidas después de la adquisición confocal. BxPC-3 tumores de CAM muestran vasos sanguíneos alrededor de los islotes pancreáticos (Figura 8A). La fluorescencia de estroma tumoral después de la inyección de colorante fluorescente en la vasculatura de la CAM confirma que los vasos son funcionales (Figura 8B) y la detección de pericitos positivos desmina sugiere la estabilización recipiente (Figura 8C).
(A) la reconstrucción 3D Imaris a partir de una imagen de 35 micras apilados después de la tinción de SNA (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI contador (azul). (B) Imagen confocal después de la inyección FITC (verde) en los vasos sanguíneos CAM. Los núcleos se tiñeron con TOPRO contador (azul) (C) La desmina inmunodetección (rojo) en PDAC-CAM manchado con SNA (verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI contador (azul).
A continuación, BxPC-3 tumores fueron tratados comenzando el día 2 ya sea con 8 M celecoxib o 0,2 M EM-275 o con una combinación de dos fármacos en su concentraciones respectivas. la concentración de MS-275 fue elegido para encajar con la concentración plasmática medida en frente a un 5 mg /m
2 esquema de dosificación semanal [15]. Si bien celecoxib sí solo no afecta el crecimiento del tumor, MS-275 solo indujo una disminución del crecimiento del tumor en un 50% (P & lt; 0,001) e indujo la expresión de COX-2. La combinación de celecoxib y MS-275 completamente abolida (P & lt; 0,001) el crecimiento del tumor, dando lugar a ningún cambio en el volumen del tumor en comparación con el inicio del tratamiento (Figura 9A-B). Los tumores tratados con MS-275 sobreexpresa COX-2 (Figura 9C). Los tumores tratados con la combinación de celecoxib y MS-275 revelaron vacíos dentro del tumor. (Figura 9D). Luego preguntamos la cuestión de si esta reducción del volumen tumoral se debe a la inducción de la apoptosis o para detener la proliferación. Los tumores tratados con MS-275, celecoxib o ambos fármacos fueron sometidos a una escindido detección de caspasa-3 y se marcaron para Ki67. Se detectó la longitud completa de la caspasa-3 en todas las muestras, pero no se observó caspasa-3 escindido (Figura 9E).