Extracto
Antecedentes
El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de la interacción de pri let-7a-1-rs10739971 con
pepsinógeno C gratis (
PGC
) y
transversal de reparación por escisión del grupo complementando 6 gratis (
ERCC6
) polimorfismos de genes y su asociación con el riesgo de cáncer gástrico y gastritis atrófica. Esperábamos para identificar polimorfismos de los genes miARN o una combinación de varios polimorfismos que podrían servir como biomarcadores para predecir el riesgo de cáncer gástrico y sus enfermedades precancerosas.
Métodos
Se utilizó el método de plataforma Sequenom MassARRAY para detectar polimorfismos de pri-let-7a-1 rs10739971 G → A,
PGC
rs4711690 C → G,
PGC
rs6458238 G → A,
PGC
rs9471643 G → C, y
ERCC6
rs1917799 en 471 pacientes con cáncer gástrico, gastritis atrófica 645 pacientes y 717 controles.
resultados
Un efecto de la interacción de pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 con
ERCC6
ha observado polimorfismo rs1917799 fue para el riesgo de cáncer gástrico (
P
interacción = 0,026); y los efectos de interacción de pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 con
PGC
rs6458238 polimorfismo (
P
interacción = 0,012) y
PGC
rs9471643 polimorfismo (
P
interacción = 0,039) fueron observados por el riesgo de gastritis atrófica.
Conclusión
la combinación de pri let-7a-1-polimorfismo rs10739971 y
ERCC6
y
PGC
polimorfismos podrían proporcionar un mayor potencial de predicción de un único polimorfismo por sí solo. Se necesitan estudios a gran escala y la investigación mecanismo molecular para confirmar nuestros hallazgos
Visto:. Xu Q, Liu J-w, El C-Y, Sun L-p, Gong Y-h, Jing J-J, et al. (2014) El efecto de la interacción de pri dejar 7a-1-rs10739971 con
PGC
y
ERCC6
polimorfismos genéticos en el cáncer gástrico y gastritis atrófica. PLoS ONE 9 (2): e89203. doi: 10.1371 /journal.pone.0089203
Editor: Xiaoping Miao, MOE clave Laboratorio de Medio Ambiente y Salud, Escuela de Salud Pública, Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología, China
Recibido: noviembre 20, 2013; Aceptado 16 de enero de 2014; Publicado: 25 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa de Investigación básica clave Nacional de China (973 Programa Ref. 2010CB529304), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Ref Nº 31.200.968), y el Proyecto de Tecnología de la Ciencia en la provincia de Liaoning (Ref Nº 2011225002) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las personas con hábitos de vida similares y vivir en entornos similares poseen diferentes riesgos de cáncer. Identificar y predecir los individuos con alto riesgo de desarrollar cáncer puede indicar la necesidad de cambiar los hábitos de vida. polimorfismos de nucleótido único (SNP) desempeñan un papel fundamental en la predicción de los individuos con mayor riesgo de cáncer. En los últimos años, se informó de polimorfismos de pri-miARN ser biomarcadores para predecir el riesgo de cáncer, como el pri-miR-34b /c rs4938723 polimorfismo [1], pri-miR-218 polimorfismo rs11134527 [2] y pri-miR-938 polimorfismo rs2505901 [3]. Los estudios han encontrado que el número de polimorfismos de un solo gen se asoció con el riesgo de cáncer gástrico [4]. Sin embargo, el cáncer gástrico es una enfermedad compleja de múltiples pasos con muchos genes implicados, y SNPs individuales tienen una capacidad limitada para predecir el riesgo de cáncer gástrico [5] - [7]. Varios estudios han informado de que las interacciones gen-gen son más importantes que el efecto principal de un solo gen en enfermedades complejas, tales como tipos de cáncer [7] - [9]. El enfoque básico de la investigación de las interacciones gen-gen es investigar la combinación de dos o más polimorfismos con menor o ningún efecto de los estudios de SNP individuales anteriores [10], [11]. Sin embargo, la mayoría de los estudios anteriores se han centrado en el papel predictivo de un único SNP de genes y se pasa por alto la posible aplicación de las interacciones gen-gen.
En la actualidad, los investigadores se centran principalmente en genes interacciones SNP-SNP, que puede causar en proteínas interacciones de proteínas, y pocos estudios han investigado las interacciones entre los polimorfismos de genes miARN y polimorfismos de genes, que pueden causar interacciones proteína-ARN. miRNA se ha informado para participar en la red multi-gen de la carcinogénesis gástrica [12]. El mismo miARN se informó para regular múltiples proteínas diana, y las mismas proteínas podría ser modulada por múltiples genes miARN [13]. Como resultado, los efectos de los genes miARN y forman una red.
Nuestro anterior estudio de asociación del gen candidato investigó la asociación de
pepsinógeno C gratis (
PGC
) y
reparación por escisión de cruz grupo complementando 6 gratis (
ERCC6
) con el riesgo de cáncer gástrico, y se encontró que
PGC
rs4711690 del gen C → G, rs6458238 G → a, G y rs9471643 → C polimorfismos tuvieron efectos protectores contra la gastritis atrófica [4]. PGC tenía efectos protectores sobre el estómago normal y mostró una baja expresión en el cáncer gástrico, y la pérdida de protección se asoció con la aparición de cáncer gástrico [14]. ERCC6 es un miembro de la familia de reparación del ADN que participa en el daño en el DNA de reparación en la carcinogénesis [15].
ERCC6
rs1917799 T & gt; G polimorfismo en la región promotora se asoció con un mayor riesgo de cáncer gástrico en una población china [16]. Let-7a es un supresor de tumor, y estudios recientes se encontró que la función de maduro let-7a está estrechamente relacionada con la incidencia y el desarrollo de cáncer gástrico, y disminución de la expresión de let-7a se asocia con comportamiento biológico maligno [17], [ ,,,0],18]. Sin embargo, las variantes genéticas let-7a no fueron examinados por sus asociaciones y los riesgos de cáncer gástrico. Rs10739971 es un SNP localizado -559 pb aguas arriba de let-7a-1, que puede ser una región promotora de let-7a-1. En la base de datos Hapmap, la frecuencia del alelo mínimo de rs10739971 es ≥5% en ambos europeos y los asiáticos. Pero si existe una asociación entre rs10739971 y el riesgo de la enfermedad, y las interacciones entre rs10739971 y otros polimorfismos, sigue sin conocerse. La hipótesis de que las variantes antes mencionadas pueden ser candidatos óptimos para investigar las posibles interacciones SNP-SNP en dos o más loci que contribuyen a la etiología del cáncer gástrico.
En este estudio de casos y controles utilizando una población china, se determinó la asociación de pri-let-7a-1 rs10739971 con el riesgo de cáncer gástrico y los efectos de la interacción de los genes miARN-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 y
PGC
y
ERCC6
polimorfismos en muestras de la mismo grupo, y discutir sus perspectivas de aplicación en el cáncer gástrico y sus enfermedades precancerosas. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio tratar de evaluar posibles interacciones SNP-SNP de miARN SNPs y SNPs de genes en dos o más loci implicados en la susceptibilidad al cáncer gástrico. Esperábamos encontrar combinaciones de polimorfismos de genes-genes que podrían predecir el riesgo de cáncer gástrico y sus enfermedades precancerosas, y para proporcionar evidencia experimental para el diagnóstico precoz del cáncer gástrico.
Métodos
Los pacientes
en este estudio, un total de 1834 individuos, que incluyó 471 pacientes con cáncer gástrico, gastritis atrófica 646 pacientes y 717 controles, fueron reclutados de forma retrospectiva de pacientes sometidos a cribado examen gastroscopia en la región de Zhuanghe y los pacientes que se sometieron a examen o gastroscopia se recogió la cirugía gástrica en el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de china, la provincia de Liaoning, china entre la sangre venosa en ayunas 2002 y 2011. y todos los participantes inscritos se diagnostica basándose en su gastroscopia y los exámenes histopatológicos. El cáncer gástrico se diagnostica basándose en los criterios de la OMS, y la gastritis atrófica y superficiales gastritis se clasificaron según la clasificación de Sydney. controles elegibles fueron aquellos participantes con un estómago normal o sólo gastritis acuerdo con gastroscópicos y patológicos exámenes y no tenían otras enfermedades.
El diseño del estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humanos de la Universidad de Medicina China (Shenyang, China ). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. historiales médicos (incluyendo edad, sexo, tabaquismo y consumo de alcohol) se obtuvieron mediante un cuestionario y fueron informática de los registros. Cada persona que participe en el estudio escrito el consentimiento informado para la investigación epidemiológica. Características detalladas de los participantes se resumen en la Tabla 1.
ADN genómico extraído
ADN genómico fue extraído por medio de un método descrito previamente con ligeras modificaciones [19]. En breve, se añadió un coágulo congelado (500 l) a 800 l de tampón TE (triethanolamide), se mezcló bien y se centrifugó a 10.000 ×
g
durante 5 minutos para dispersar el coágulo. Después de la interrupción del coágulo, 400 l de TE, 25 l de 10% SDS y 5 l de 20 mg /ml se añadieron proteinasa K y se incubó a 37 ° C durante la noche. El sobrenadante se extrajo y se añadió un volumen igual de fenol. El tubo se coloca en un aparato rotatorio durante 15 minutos y después se centrifugó a 10.000 ×
g
de 15 min. El sobrenadante se retiró y una segunda extracción se realizó con la adición de un volumen igual de una mezcla de fenol y cloroformo (01:01). Después de la centrifugación, el sobrenadante se retiró y tercera extracción se realizó con la adición de un volumen igual de cloroformo. Después de la centrifugación, el sobrenadante se absorbe y se añadieron dos volúmenes de solución de precipitación de proteínas (dos volúmenes de etanol absoluto que contiene 10% de acetato de sodio /L 3 mol) y se incubó durante 2 horas a -20 ° C. Cada muestra se centrifugó a 10.000 ×
g
durante 10 minutos. Después de la centrifugación, el sedimento de ADN resultante se enjuagó con etanol al 75% y se centrifugó a 10.000 ×
g
durante 10 min. El etanol 75% se decantó y el tubo invertido sobre papel absorbente limpio para 30 min. El ADN resultante se reconstituyó en tampón TE y se almacenó a -20 ° C hasta su uso.
SNP genotipificación
muestras de ADN se diluyeron a concentraciones de trabajo de 50 ng /l antes de la determinación del genotipo. Los ensayos, diseño de cebadores, y el genotipado de 29 sitios de polimorfismo seleccionados para un estudio de genes candidatos asociados fueron llevados a cabo por CapitalBio (Pekín, China) usando la plataforma Sequenom MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, EE.UU.) entre mayo de 2011 y diciembre de 2011 en base a las instrucciones del fabricante [4], [20]. Cinco de los 29 polimorfismos fueron seleccionados para el análisis de la interacción aún más en el presente estudio. Para evaluar la calidad de la determinación del genotipo, 5% de las muestras repetidas se genotipo y los resultados fueron 100% compatible.
La detección de H. pylori en suero
Las pruebas serológicas para
H. pylori
se realizaron para comprobar el estado de
H. pylori
infección mediante ELISA (
H. pylori
-IgG kit ELISA, BIOHIT Plc, Helsinki, Finlandia), como se describe anteriormente [21]. Positivo fue juzgado como el título de
H. pylori
-IgG mayor que 34EIU (el valor de corte determinado por el protocolo). Brevemente, las muestras de suero se diluyeron 1:200 (5 l + 995 mu l) con tampón diluyente y se mezclaron bien. A continuación, se añadieron 100 l de solución en blanco, calibradores, controles y muestras diluidas a los pocillos. La placa se cubrió con la tapa de incubación y se incubó durante 30 min a 37 ° C. Después de la incubación, los pocillos se lavaron cinco veces con 350 l de diluido (1:100) tampón de lavado y la placa golpeó suavemente varias veces en papel de filtro. A continuación, se añadieron 100 l de solución de conjugado mixto a los pocillos y se incubaron durante 30 min a 37 ° C. Después de la incubación, los pocillos se lavaron de nuevo y se añadieron 100 l de solución de sustrato mixto a los pocillos antes de la incubación durante 30 min a temperatura ambiente (20-25 ° C) en un ambiente oscuro. Por último, se añadieron 100 l de solución de parada mixta y se leyó la absorbancia a 450 nm a los 30 minutos.
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 16.0 (SPSS, Chicago , IL, EE.UU.). χ de Pearson
2 pruebas se utilizaron para evaluar las diferencias entre sexos en los grupos de casos y controles. ANOVA se realizó para evaluar las diferencias entre las edades en los diferentes grupos. Se llevaron a cabo pruebas de coeficiente de probabilidad para evaluar los efectos de interacción sobre el riesgo de cáncer gástrico mediante la comparación del modelo que sólo participan los efectos principales y el modelo completo que también contenía el término de interacción. Un
P-valor
. & Lt; 0,05 para todas las pruebas de dos caras se consideró estadísticamente significativa
analiza
Resultados
Efecto principal de polimorfismos individuales
en nuestro estudio anterior, encontramos que la pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 se asoció significativamente con un mayor riesgo de gastritis atrófica (OR = 2,59,
P = 0,018
) en la población de estudio más pequeño, pero ninguna asociación significativa se encontró en el estudio de validación adicional de una población más grande (datos no publicados); PG
C
rs4711690, rs6458238, rs9471643 y polimorfismos se asociaron significativamente con un mayor riesgo de gastritis atrófica (
P = 0,093
, OR = 0,75;
P = 0,015
, OR = 0,73;
P = 0,033
, OR = 0,69, respectivamente) [4];
ERCC6
ha polimorfismo rs1917799 se asoció significativamente con un mayor riesgo de cáncer gástrico (OR = 1,38,
P = 0,035
) [20]
La interacción bidireccional. De pri rs10739971 -let-7a-1 y PGC, polimorfismos ERCC6 en el riesgo de cáncer gástrico /gastritis atrófica
Para investigar si los polimorfismos de genes y polimorfismos de los genes miARN tenían un efecto de interacción, se analizaron las interacciones entre los genes miARN polimorfismo y cada polimorfismo del gen . Se encontró que el polimorfismo de los genes miARN y
PGC
y
ERCC6
polimorfismos mostraron una fuerte asociación estadística con el cáncer gástrico o gastritis atrófica. Por lo tanto, se analizó el efecto de la interacción pri dejar 7a-1-polimorfismo rs10739971 y
PGC
y
ERCC6
polimorfismos, y sus asociaciones, con el riesgo de cáncer gástrico y gastritis atrófica. Los resultados indicaron que el pri-let-7a-1 rs10739971 polimorfismo y
ERCC6
polimorfismo rs1917799 tuvo efectos de interacción para el riesgo de cáncer gástrico (
P
interacción = 0,026, Tabla 2). Este par de SNP mostró un mayor riesgo de cáncer gástrico (OR = 2.59 IC 95% = 1,12-5,97). Pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 y
PGC
rs65458238 y rs9471643 polimorfismos tenido efectos de interacción para el riesgo de gastritis atrófica (
P
interacción = 0,012 y 0,039, respectivamente, Tabla 3). Para el polimorfismo rs65458238, el par de SNP mostró un aumento del riesgo de gastritis atrófica (OR = 2,77, IC del 95% = 1.25 a 6.13); mientras que el otro par de SNP mostró una disminución del riesgo de gastritis atrófica (OR = 0,52, IC del 95% = 0,28 a 0,97) para rs9471643 (Tabla 3).
interacciones SNP-SNP que implica múltiples SNPs mediante regresión logística
además, investigó la interacción SNP-SNP que implica tres SNPs positivos (pri-let-7a-1 rs10739971-
PGC
rs6458238-
PGC
rs9471643) y el resultado fue estadísticamente significativa (
P
interacción = 0,001, Tabla 4). La combinación de SNP mostró mayor riesgo de gastritis atrófica (OR = 23,55; IC del 95%: 3,73 a 148,71 =).
Discusión
Los polimorfismos de los genes miARN o podrían servir como biomarcadores potenciales para predecir el riesgo de enfermedad. Estudios previos han centrado principalmente en la asociación de un polimorfismo de un solo gen con riesgo de enfermedad, y el riesgo era a menudo de efecto débil (O & lt; 1,5). En cuanto a la combinación de dos o más interacciones SNP-SNP, el riesgo era a menudo de moderada (OR≥1.5) o fuerte efecto (OR≥2) [4], [10], [22] - [24]. El presente estudio, por primera vez, han investigado los efectos de la interacción de los genes miARN polimorfismo y
PGC
y
ERCC6
polimorfismos en una población del norte de China. El estudio tuvo como objetivo proporcionar evidencia experimental para el diagnóstico precoz y mecanismos del cáncer gástrico mediante la búsqueda de combinaciones de polimorfismos de genes-genes que podrían predecir el riesgo de cáncer gástrico y sus enfermedades precancerosas.
Entre los SNPs de nuestro grupo investigó durante nuestro estudio de asociación del gen candidato,
ERCC6
un solo locus mostró un efecto débil para el riesgo de cáncer gástrico (OR = 1,46) [16]; los tres
PGC
un solo locus demostró un efecto protector débil para el riesgo de gastritis atrófica (OR = 0,75 para rs4711690; OR para rs6458238 = 0,73; OR = 0,69 para rs9471643) [4]. Por lo tanto, la hipótesis de que estos polimorfismos pueden ser candidatos óptimos para investigar las posibles interacciones SNP-SNP en dos o más loci que contribuyen a la etiología del cáncer gástrico. Se realizó el análisis de los efectos de la interacción de los genes miARN polimorfismo de genes y polimorfismos y encontramos tres pares SNP-SNP asociados a las enfermedades, de las cuales la interacción de un par (pri-let-7a-1 rs10739971-
ERCC6
rs1917799) fue asociados con el riesgo de cáncer gástrico y las interacciones de los otros dos pares (pri-let-7a-1 rs10739971-
PGC
rs65458238 y pri-let-7a-1 rs10739971-
PGC
rs9471643) se asociaron con el riesgo de gastritis atrófica.
ERCC6
polimorfismo rs1917799 y
rs6458238 PGC y polimorfismos rs9471643 se ha informado anteriormente. En este estudio, se analizaron adicionalmente pri let-7a-1-polimorfismo rs10739971 en el mismo grupo. El par de pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 y
ERCC6
rs1917799 polimorfismo tuvo un OR de su interacción de 2,59 para el riesgo de cáncer gástrico, que era mayor que sus efectos individuales de un solo locus de 0,92 y 1,07, respectivamente. Del mismo modo, el par de pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 y
PGC
rs6458238 polimorfismo tenido un OR de su interacción de 2,77 para el riesgo de gastritis atrófica, que era más grande que sus efectos individuales de un solo locus de 0,74 y 1,23, respectivamente. El par de pri dejar 7a-1-polimorfismo rs10739971 y
PGC
rs9471643 polimorfismo tuvieron un OR de su interacción de 0,52 para el riesgo de gastritis atrófica. Curiosamente, sus efectos individuales de un solo locus eran contrarias a las conclusiones anteriores, con OR de 1,65 y 1,06, respectivamente, lo que merece la replicación independiente adicional de nuestros hallazgos.
Debido a que el polimorfismo pri-let-7a-1 demostró rs10739971 efectos de interacción con ambos
PGC
SNP sobre el riesgo de gastritis atrófica, se llevó a cabo además un análisis de interacción de los tres polimorfismos positivos. Los resultados mostraron que el OR para el riesgo de gastritis atrófica fue 23,55 (
P
= 0,001). En general, un solo locus tiene un efecto débil (O & lt; 1,5) sobre el riesgo de la enfermedad, y la combinación de dos o más interacciones SNP-SNP menudo demuestra una moderada (OR≥1.5) o un efecto fuerte (OR≥2). En el presente estudio, la OR de pri-let-7a-1 solo locus fue de 1,61; el OR para efectos de interacción con
ERCC6
y
PGC
eran ambos más de 2; la combinación de los tres loci positivo demostró una o incluso más de 23,55. Estos resultados indican las perspectivas de aplicación de una combinación de dos o más SNPs como potenciales biomarcadores para predecir el riesgo de enfermedad.
La investigación de los efectos de la interacción de los polimorfismos de genes miARN y polimorfismos contribuirá a la comprensión global de la red de genes y la papel de los genes miARN en el proceso patogénico. Los hallazgos de las interacciones SNP-SNP a menudo tienen mecanismos subyacentes en lugar de ser meramente resultados estadísticos [9]. Los tres pares de SNPs indicaron que los genes miARN podría interactuar con los genes en la carcinogénesis gástrica. proteína PGC tiene un efecto protector en el epitelio del estómago normal, y su expresión se redujo en un grupo de gastritis atrófica en comparación con un grupo normal [14], [25]. El papel exacto de PGC en gastritis atrófica todavía no está claro. ERCC6 está implicada en la vía de reparación del ADN, y se repite el daño y reparación del ADN puede conducir a la carcinogénesis celular [15]. Sobre la base de los hallazgos del presente estudio, es razonable sugerir que let-7a pueden participar en los procesos de inducción de PGC gastritis atrófica y ERCC6 inducción de cáncer gástrico. Según los resultados de software de predicción de genes miARN objetivo, hubo posibles sitios de unión de let-7a con 3'-UTR tanto para
PGC
y
ERCC6
. Si los efectos de la interacción SNP-SNP observados en este estudio fueron debido a la unión de miARN y sus genes diana todavía requiere experimentos funcionales adicionales.
Este estudio tiene algunas limitaciones. En primer lugar, aunque tuvimos una muestra de gran tamaño relativo de 471 pacientes con cáncer gástrico, gastritis atrófica 645 pacientes y 717 controles, este tamaño de muestra todavía puede ser insuficiente para detectar los efectos de interacción, en particular para los alelos raros. En segundo lugar, los mecanismos de las interacciones SNP-SNP asociados deben aclararse, y se requieren experimentos funcionales posteriores. En tercer lugar, varios estudios de asociación del genoma sugieren una integración de los datos de los estudios de asociación del genoma de cáncer gástrico de la población china; por lo tanto, los datos deben ser integradas, y pueden ser utilizados como sitios de polimorfismo candidato a ser estudiados en el futuro. En cuarto lugar, la interacción entre genes y medio ambiente para el riesgo de cáncer gástrico es un factor importante a considerar, tales como fumar y beber. En este estudio, hemos recopilado algunos datos sobre el tabaco y el alcohol, pero no queda casi un tercio de los datos que faltan de las muestras. Las interacciones entre los genes y el tabaquismo y la conducta de beber en el riesgo de cáncer gástrico deben ser examinados.
Conclusión
Este estudio, por primera vez, informa que el pri-let-7a-1 polimorfismo y rs10739971
ERCC6
rs1917799 polimorfismo podría tener un efecto de interacción sobre el riesgo de cáncer gástrico; y pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 podría tener un efecto de interacción con
PGC
rs6458238 y rs9471643 polimorfismos en el riesgo de gastritis atrófica. Algunos datos han sido recogidos por el que es posible la construcción de una vía de la red cáncer gástrico. Futuro estudios a gran escala y experimentos mecanismo se requieren para confirmar los hallazgos de este estudio.