Abstract> Objetivo
Para investigar el efecto inhibidor del ácido B pseudolaric en xenoinjertos subcutáneos de adenocarcinoma gástrico humano y los mecanismos moleculares subyacentes implicados en la resistencia a múltiples fármacos.
métodos
células de adenocarcinoma gástrico humano SGC7901 y células SGC7901 /ADR resistentes a los fármacos se inyectaron en ratones desnudos para establecer un modelo de xenoinjerto subcutáneo. Los efectos del ácido B pseudolaric con o sin tratamiento adriamicina se compararon mediante la determinación del tamaño del tumor y peso. La ciclooxigenasa-2, proteína kinaseC-α y de los niveles de expresión de P-glicoproteína se determinaron mediante técnicas de inmunohistoquímica y Western Blot.
Resultados
Pseudolaric ácido B suprimió significativamente el crecimiento tumoral inducida por las células y SGC7901 SGC7901 células /ADR. La combinación de ácido B pseudolaric y el tradicional adriamicina medicamento de quimioterapia exhibe efectos inhibidores más potentes en el crecimiento del cáncer gástrico in vivo que el tratamiento con ácido B o adriamicina pseudolaric solo. los niveles de expresión de proteínas de la ciclooxigenasa-2, proteína kinaseC-α y P-glicoproteína fueron inhibidas por el ácido B pseudolaric solo o en combinación con adriamicina en xenoinjertos de células SGC7901 /ADR.
Conclusión
ácido Pseudolaric B tiene un efecto inhibidor significativo y un efecto inhibidor aditivo en combinación con adriamicina sobre el crecimiento de cáncer gástrico in vivo, lo que invierte la resistencia a múltiples fármacos de neoplasia gástrica de los fármacos de quimioterapia mediante la regulación negativa de la Cox-2 /PKC-α /P- vía de señalización gp /MDR1
Visto:. Sun Q, Li y (2014) El efecto inhibidor de ácido Pseudolaric B en cáncer gástrico y de resistencia a múltiples fármacos a través de la Cox-2 Camino /PKC-α /P-gp. PLoS ONE 9 (9): e107830. doi: 10.1371 /journal.pone.0107830
Editor: Soumitro Pal, el Hospital de Niños de Boston & amp; Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de mayo de 2014; Aceptado: August 20, 2014; Publicado: 24 Septiembre, 2014
Derechos de Autor © 2014 Sun, Li. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Programa de Shenyang Municipal de Ciencia y Tecnología Mesa (1091136-9-02). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es uno de los cánceres más comunes en el mundo [1], y la quimioterapia es una importante estrategia contra el cáncer gástrico [2]. Debido a múltiples fármacos quimioterapéuticos de diferentes clases se usan para tratar el cáncer gástrico, la sensibilidad de los fármacos contra el cáncer para el cáncer gástrico disminuye gradualmente, y se puede producir resistencia a muchos fármacos diferentes con diferentes estructuras químicas y diferentes mecanismos de acción. Este tipo de resistencia se llama resistencia a múltiples fármacos (MDR) y disminuye significativamente la eficacia de la terapia en el cáncer gástrico. MDR se está convirtiendo en un problema importante para el tratamiento del cáncer con éxito [3]. Se ha descubierto que la razón principal de MDR en el cáncer es la sobreexpresión de P-glicoproteína (P-gp), un producto del gen MDR1 humano. P-gp es una bomba de eflujo dependiente de ATP que puede disminuir la acumulación del fármaco en las células cancerosas. Se propone que P-gp, un biomarcador bien aceptado de MDR, también se debe considerar como una diana molecular en el cáncer resistente a múltiples fármacos [4]. Estudios recientes han demostrado que en las células de cáncer con MDR, los niveles de expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y una isoforma de la proteína kinaseC (PKC-α) son ambos regulados por incremento, y su inhibición puede revertir neoplásica MDR [5] -. [10]
ácido Pseudolaric B (PAB, Figura 1), un ácido diterpeno aislado de la raíz y el tronco de corteza del árbol
Pseudolarix kaempferi
Gordon (Pinaceae), se utiliza en la medicina china tradicional por su amplia gama de características biológicas, tales como efectos anti-hongos y anti-fertilidad. Además, sus efectos anti-angiogénicos también han sido reconocidos progresivamente en los últimos años [11], [12]. Estudios recientes han demostrado que PAB induce la inhibición del crecimiento, detención del ciclo celular y la apoptosis. Por otra parte, PAB invierte la resistencia a múltiples fármacos de las células cancerosas [13], [14]. PAB suprime el crecimiento de la línea celular AGS neoplásica gástrica e induce su apoptosis [15]. Nuestra investigación anterior demostró que PAB también tiene un efecto inhibidor dramático sobre las células SGC7901 cáncer gástrico humano in vitro [16]. Sin embargo, los estudios in vitro del efecto anticancerígeno del PAB son raros, y ni la eficacia in vivo de este compuesto a base de hierbas novela contra los tumores ni su mecanismo molecular preciso contra la TB ha sido investigado a fondo.
El objetivo del presente estudio es evaluar el efecto antineoplásico del PAB en vivo, incluyendo la reversión de la MDR, utilizando un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos y explorar si el mecanismo molecular subyacente del PAB está relacionada con la inhibición de la TB a través de la Cox-2 /PKC-α /vía P-gp.
Materiales y Métodos
Materiales
RPMI-1640 medio de cultivo y suero fetal bovino (FBS) para el cultivo celular se adquirieron de Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.. anticuerpos de conejo anti-Cox-2 monoclonal, de ratón anti-PKC-alfa y el ratón anticuerpos monoclonales anti-P-gp se compraron desde Santa Cruz Corporation, CA, EE.UU.. Secundaria anticuerpos contra los anticuerpos de conejo y de ratón, estreptavidina-peroxidasa kits (SP), y 3,3-diaminobencidina (DAB) se obtuvieron de Pekín de Zhongshan Biotecnología, China. kits de ensayo de proteína BCA y kits de preparación de gel SDS-PAGE se obtuvieron del Instituto de Biotecnología Beyotime, Shanghai, China. PAB se adquirió en el Instituto de Control de Drogas de Liaoning, China No. 201003 (la pureza: & gt; 98%). Adriamicina (ADR) se obtuvo a partir de Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., China No. 120906. Tween 80 y polietilenglicol fueron adquiridos de Sigma Chemical, St. Louis, MO, EE.UU..
Cultivo de células
células de adenocarcinoma SGC7901 gástrico humano se cultivaron en el laboratorio central de Shengjing hospital afiliado a la Universidad médica de china [16], y las células SGC7901 /ADR adriamicina resistentes fueron dotados del Instituto de Enfermedades digestivas en Xijing hospital afiliado a la Cuarta Universidad médica Militar [17]. células de adenocarcinoma SGC7901 gástrico humano y células SGC7901 /ADR adriamicina resistentes se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con% de FBS 10 y antibióticos (100 U /ml de penicilina y estreptomicina) con 5% de CO
2 en un incubador humidificado a 37 DO. Se añadió ADR (1 mg /ml) al medio de cultivo de células SGC7901 /ADR para ayudar a mantener su MDR. Las células en la fase de crecimiento logarítmico, se centrifugaron y se diluyeron con medio RPMI-1640 para preparar suspensiones de una sola célula con una concentración de 2,5 × 10
6 /ml para la siembra.
Establecimiento de un modelo de xenoinjerto de ratones desnudos
El efecto antitumoral in vivo de PAB se examinó en un modelo de xenoinjerto murino. Para el modelo, 4-6 semanas de edad, macho y hembra inmunodeficientes BALB /c (nu /nu), con un peso de 18 a 22 g, fueron adquiridos de Beijing HFK Bioscience Co., Ltd. (China) y se mantienen en instalaciones acreditadas en condiciones estándar para roedores (grado SPF) en el Departamento de Ciencia Animal de Laboratorio. Se seleccionaron cincuenta ratones y asignados al azar en dos grupos (25 por grupo). Un total de 25 ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 2,5 × 10
6 /ml SGC7901 células en 0,2 ml de medio RPMI-1640 en la axila izquierda, y los otros 25 ratones fueron inyectados con células SGC7901 /ADR en la región axilar derecha en condiciones libres de gérmenes.
grupos experimentales y medicación
Siete días después de la implantación de células, los tumores se hicieron palpables (aproximadamente 3 mm x 3 mm de diámetro) y, a continuación, los dos grupos inyectados con dos tipos diferentes de células se dividieron aleatoriamente en cinco subgrupos (5 ratones por grupo): grupo de solución salina normal (NS) de control, del grupo de control TWEEN, grupo ADR, grupo PAB, y PAB + grupo ADR. Para los grupos PAB, PAB (25 mg /kg /d en 0,1 ml) disuelto en una solución acuosa de polietilenglicol 6%, 3% de etanol, y 1% Tween 80 se administró por vía intraperitoneal (i.p.) diariamente durante 20 días [13]. Un volumen idéntico de solución acuosa o NS se inyectó en el grupo de grupo de control o el control TWEEN NS, respectivamente. Para el grupo ADR, ADR (1,25 mg /kg en 0,1 ml) i.p. diluidos en NS se administró diariamente durante 20 días [18]. los ratones portadores del tumor se administraron tanto PAB (25 mg /kg /d) y ADR (1,25 mg /kg /día) i.p. para el mismo período en el grupo PAB + ADR. Después del tratamiento, los ratones de cada grupo se sacrificaron, y las muestras de tumor de las regiones axilares bilaterales se pesaron y se resecaron por inmunohistoquímica y análisis de transferencia Western. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentos con Animales de la Shengjing Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China (Número de Permiso: 2013PS144K). Los ratones fueron sacrificados bajo anestesia 10% de hidrato de cloral, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Medición y cálculo del volumen del tumor y el peso
El peso corporal se monitorizó cada día, y dos diámetros perpendiculares (longitud y anchura en milímetros) de los tumores se midieron cada dos días con calibradores de todo el período de tratamiento. volúmenes de los tumores se estimaron usando mediciones bidimensionales y calculan como sigue: volumen del tumor (mm
3) = longitud (mm) x anchura
2 (mm) /2. El volumen tumoral relativo (RTV) se calculó como sigue: RTV = (volumen del tumor durante la terapia media) /(volumen medio del tumor al inicio del tratamiento). Los efectos antitumorales de PAB y /o ADR se estimaron con la tasa de inhibición media (IR) del crecimiento del tumor utilizando la siguiente ecuación: IR (%) = [(1-media RTV de grupo tratado con fármaco /significa RTV de grupo de control NS ) × 100] [19]. El peso corporal relativo de los ratones se calculó utilizando la W
t /W
0 índice, donde W
t fue el peso corporal en el día de la medición, y W
0 se llegó al peso corporal en el primer día de tratamiento. El cambio en el peso corporal en los días 1 y 20, que representan el inicio y el final del experimento, respectivamente, se utilizó para evaluar y analizar los efectos de los fármacos sobre el peso corporal [20].
La tinción inmunohistoquímica para la expresión de la Cox-2, PKC-alfa y P-gp
Tumor especímenes fueron fijadas con paraformaldehído, se procesan de forma rutinaria por inclusión en parafina, y luego se cortan en secciones de 4 micras. Después de hematoxilina y eosina (HE) de la tinción, se observaron células de los xenoinjertos de cáncer gástrico bajo un microscopio de luz. Los niveles de expresión de la COX-2, PKC-α y P-gp en células tumorales recogidas se determinaron utilizando el método SP. En pocas palabras, después de ser desparafinado y rehidratadas, los portaobjetos se incubaron en H solución 0,3%
2O
2 y se secaron en un horno de microondas en tampón de ácido cítrico para 15 min para recuperar antígenos. Las rodajas se bloquearon con suero normal de cabra durante 30 min a 37 ° C y se sondaron con un anticuerpo monoclonal de conejo a los anticuerpos monoclonales de ratón de la Cox-2 y de PKC-α y P-gp en 4 ° C durante la noche (todos los anticuerpos se diluyeron en 1 :300). se añadieron biotinilado de IgG anti-conejo y anti-IgG de rata y se incubó a 37 ° C durante 30 min antes de añadir la enzima conjugado HRP-estreptavidina. Además, 3, 3'-diaminobencidina (DAB) se utilizó como cromógeno. Las diapositivas se counterstained con hematoxilina, se deshidrataron en alcohol, y montado en bálsamo neutro. Los controles fueron preparados usando solamente anticuerpos secundarios. Se seleccionaron cinco campos de cada sección de cada ratón en cada grupo para la colección de imágenes. Los resultados fueron analizados y comparados estadísticamente utilizando el software NIS-Elements 3.0 Br, y se obtuvo la densidad óptica media para cuantificar los niveles de expresión de la COX-2, la PKC-α y P-gp.
Western blot de Cox -2, PKC-α y P-gp en xenoinjertos de ratones desnudos
Un total de 100 mg de tejidos tumorales congeladas frescas procedentes de al menos tres ratones de cada grupo se pesaron y se complementó con ensayo de inmunoprecipitación de radio (RIPA) tampón de lisis [que contiene 100 mg /ml de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)]. Después de pulverizado con unas tijeras, extractos fueron homogeneizados utilizando ultrasonido. Después de centrifugar a 14.000 rpm a 4 ° C durante 30 min, una muestra de sobrenadante se congeló a -80 ° C para el Western Blot. La concentración de proteína de los extractos se determinó usando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA). Un total de 100 g de proteína por ratón en condiciones desnaturalizantes (100 ° C, 5 min) se sometió a electroforesis utilizando dodecilsulfato de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en gel de separación 8% y electrotransfirió a membranas de PVDF utilizando un sistema de transferencia en húmedo a 100 V (Cox-2, PKC-α, β-actina de 100 min, y P-gp de 3 h). Después de bloquear con leche descremada en polvo 5% en 1 x TBST durante 90 minutos (solución salina que contiene 0,1% de Tween 20 Tris-tamponada), las membranas fueron incubadas con el anticuerpo primario [anticuerpo de conejo monoclonal de Cox-2 (1:400) o el ratón anticuerpos monoclonales frente a la PKC-α (1:200) y P-gp (1:200), con β-actina como control interno para la carga de proteínas] durante la noche a 4 ° C. La unión de anticuerpo se visualizó usando un anticuerpo acoplado a peroxidasa secundario de cabra anti-conejo (1:2000) y el anticuerpo anti-ratón de cabra (1:2000) durante 1,5 h a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se visualizaron por quimioluminiscencia aumentada reactivo (ECL). Los resultados fueron analizados utilizando el software Image J.
El análisis estadístico
Todos los datos se presentan como los valores medios ± desviación estándar, y las comparaciones múltiples entre dos cualesquiera de los grupos tratados fueron evaluados por uno ANOVA de un factor, utilizando SNK y métodos de LSD con el software SPSS 17.0. La relación entre el cambio de peso corporal y el volumen tumoral se analizaron mediante análisis de correlación de Pearson. valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
El efecto inhibitorio del PAB en el crecimiento del cáncer gástrico humano
Los tumores en todos los grupos tratados forman fácilmente después la implantación de suspensiones de una sola célula, y la tasa de formación fue del 100%. Cuando los xenoinjertos se hicieron evidentes, no hubo diferencias significativas en el volumen promedio de los xenoinjertos entre los diferentes grupos (Tabla 1), y los volúmenes de los tumores se monitorizaron a diversos puntos de tiempo en todos los grupos. Las curvas del crecimiento del tumor de las dos líneas celulares se representan gráficamente (Figura 2A, 2B). Como se muestra en la Tabla 1, para los grupos tratados con células SGC7901, no se observó diferencia significativa entre el grupo PAB y el grupo ADR en los volúmenes relativos promedio de los xenoinjertos (p & gt; 0,05), y el IR era 56,4% y 59,0%, respectivamente. La adición de ADR para PAB resultó en una actividad antitumoral mayor que la de PAB solo o ADR sola (p & lt; 0,05) con un IR de 88,1%. El efecto inhibidor del grupo PAB era más fuerte en comparación con la del grupo ADR en los xenoinjertos de células SGC7901 /ADR, y los valores de IR fueron 64,1% y 21,9%, respectivamente (p & lt; 0,05). la inhibición del crecimiento del tumor fue más evidente en los ratones tratados con PAB en combinación con ADR, con un IR de 85,8%. Los resultados del peso del tumor en diferentes grupos apoyaron aún más nuestros resultados con respecto al volumen de xenoinjertos de ratones. Figura 2C y 2D muestran los cambios en el peso corporal relativo de los ratones en los diez grupos. El peso corporal fue similar entre los grupos de control y los grupos tratados con PAB. Sin embargo, el peso corporal disminuyó en los grupos de combinación de grupos tratados y de ADR, y la disminución de los grupos de ADR fue más evidente (p & lt; 0,05). Por otra parte, la Figura 3 proporciona una comparación directa de los tamaños de los tumores de las células y las células SGC7901 SGC7901 /ADR en los diferentes grupos. La relación entre el cambio de peso corporal y el volumen tumoral no fueron significativas (p & gt; 0,05). Las dosis probadas fueron bien toleradas por los ratones, y no se observó letalidad de los animales durante el experimento
A:. Curva de crecimiento de las células SGC7901 xenoinjertos B: curva de crecimiento de SGC7901 /ADR celulares xenoinjertos C: corporal relativo cambio de peso de ratones con xenoinjertos de células SGC7901 D: cambio de peso relativo de los ratones con xenoinjertos de células SGC7901 /ADR. SGC7901 células y células SGC7901 /ADR (2,5 × 10
/ml 6) se inyectaron por vía subcutánea en las zonas axilares de ratones desnudos, y cuando se observaron tumores evidentes, los ratones recibieron una dosis diaria de 25 mg /kg de ácido pseudolaric B y /o 1,25 mg /kg de adriamicina o solución salina normal (control) /solución de tween (control) (n = 5 por grupo). Los volúmenes tumorales se controlaron a diferentes puntos de tiempo (Day1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19). El IR del crecimiento tumoral en los grupos tratados con fármaco se comparó con la de los grupos control al final del experimento por ANOVA de una vía. *
p Hotel & lt; 0,05 frente al grupo de control
A:. Tumores aislados de células SGC7901 (arriba) y células SGC7901 /ADR (continuación) B: xenoinjertos subcutáneos de la línea celular SGC7901 en ratones desnudos C: xenoinjertos subcutáneos de la línea celular SGC7901 /ADR en ratones desnudos. (Grupo 1): grupo NS de control (grupo 2): grupo de control Tween (grupo 3): Grupo ADR (grupo 4): grupo PAB (grupo 5): grupo PAB + ADR
la tinción inmunohistoquímica para la expresión de la Cox-2, PKC-α y P-gp
Todos los tumores en cada grupo, a través de la tinción inmunohistoquímica, aparece la expresión positiva de la Cox-2, PKC-α y P- proteínas gp. Cox-2 y la expresión de PKC-α fue definida como positiva si la región manchada de las células tumorales fue en el citoplasma, y la tinción de P-gp se consideró positiva si se observó tinción en la membrana y el citoplasma. Las proteínas se tiñeron de color amarillo o marrón en observación al microscopio óptico (Figura 4). Para la línea celular SGC7901 /ADR, la tinción de estas proteínas en los grupos de control era más fuerte que en los otros grupos (p & lt; 0,05). tratamiento PAB redujo la tinción intracelular de Cox-2, PKC-α y P-gp en comparación con el grupo tratado con ADR (p & lt; 0,05). Después de PAB y tratamiento ADR, la tinción intracelular de estas proteínas fue más escaso y más débil en comparación con la de los otros grupos. Para los xenoinjertos de los dos grupos de control NS, la tinción de P-gp en las células SGC7901 fue significativamente menor que la de la SGC7901 /células de ADR (p & lt; 0,05). El análisis de la intensidad de la tinción de la Cox-2, PKC-α y la expresión de P-gp reveló los mismos resultados (Tabla 2) guía
A:. Expresión de la COX-2 en ratones xenoinjertos B: expresión de PKC α en ratones xenoinjertos C: expresión de P-gp en ratones xenoinjertos D: control negativo E: xenoinjerto de SE F: tejido gástrica normal de SE. Los tejidos se fijaron, empotradas, montados y se tiñeron por el método SP o tinción HE usando procedimientos estándar. Barra de escala, 25 micras.
Efecto de PAB sobre la COX-2, la PKC-α, y la expresión de P-gp en ratones xenoinjertos
Para dilucidar el mecanismo molecular implicado en los efectos de reversión de PAB en la SGC7901 /ADR xenoinjertos in vivo, la expresión de COX-2, la PKC-α, y P-gp en tumores de diferentes grupos tratadas con reactivo se determinaron por Western blot. Como se muestra en la Figura 5, para el grupo control NS, los niveles de expresión de la COX-2, PKC-α, y P-gp en los xenoinjertos de células SGC7901 fueron menores en comparación a los de los tumores de células SGC7901 /ADR (p & lt; 0,05) . Para los tumores de la SGC7901 /células de ADR, los niveles de expresión de las tres proteínas de interés en el grupo control y el control TWEEN grupo NS fueron significativamente mayor en comparación con los otros grupos (p & lt; 0,05), y no hubo diferencia significativa entre el dos grupos (p & gt; 0,05). Los niveles de expresión de la COX-2, PKC-α, y P-gp en el grupo tratado con PAB fueron significativamente más bajos en comparación con los del grupo tratado con ADR (p & lt; 0,05). La expresión de la β-actina se utilizó como control interno, y los niveles de expresión de la COX-2, PKC-α, y P-gp se redujeron de forma secuencial entre los grupos de control, el grupo ADR, grupo PAB y grupo PAB + ADR (p & lt ; 0,05)
R: inmunotransferencias representativas de la Cox-2, PKC-α, P-gp en comparación con β-actina en diferentes grupos de tratamiento.. (Carril 1): NS grupo de control (SGC7901 /ADR) (carril 2): grupo de control Tween (SGC7901 /ADR) (carril 3): Grupo ADR (SGC7901 /ADR) (carril 4): grupo PAB (SGC7901 /ADR) (carril 5): grupo PAB + ADR (SGC7901 /ADR) (carril 6): grupo de control NS (SGC7901). B: niveles relativos de expresión de la COX-2 (B1), PKC-α (B2), y P-gp (B3) en diferentes grupos de tratamiento. Los tumores se aislaron y se homogeneizaron para medir el nivel de proteína, y β-actina se utilizó como control interno. Cada inmunoblot representativo de tres experimentos distintos con resultados similares. *
p
. & Lt; 0,05 frente al grupo de control
Discusión
PAB es uno de los principales componentes biológicamente activos de la corteza de la raíz de la planta medicinal
Pseudolarix kaempferi Opiniones y presenta una gran citotoxicidad hacia varias líneas celulares de cáncer. En estudios in vitro también han demostrado que invierte la MDR de carcinoma mediante la inhibición de la sobreexpresión de P-gp sin efectos secundarios evidentes [13], [15], [20], [21]. También se ha demostrado que PAB tiene un efecto antitumoral en ratones han sido reportados modelos de xenoinjerto de cáncer humano de colon y carcinoma hepatocelular [13], [20], y no hay efectos secundarios conocidos de PAB en animales. Nuestro estudio anterior demostró que PAB tiene un potente efecto inhibidor sobre la línea celular SGC7901 in vitro e induce la apoptosis de células de cáncer gástrico a través de la ruta de la caspasa [16]. Nuestro presente estudio in vivo es una prueba más de que la PAB es protector contra los tumores gástricos en modelos murinos xenoinjertos utilizando SGC7901 células y células SGC7901 /ADR. Nuestros experimentos preliminares han demostrado que el PAB a 25 mg /kg no sólo inhibe el crecimiento de cáncer gástrico, pero también es bien tolerada por los ratones. Además, se incluyeron el grupo de control TWEEN para excluir la influencia de la solución acuosa que se utilizó para disolver PAB en tumores [13]. Para las células sensibles, los efectos anticancerígenos de la PAB no produjeron diferencias significativas en comparación con el ADR, un fármaco de quimioterapia tradicional. Además, PAB es un compuesto biológicamente activo que ejerce su efecto contra los tumores de marcha atrás de la línea celular SGC7901 /ADR por la orientación de la vía de señalización activada por la sobreexpresión de P-gp en vivo.
P-gp es una membrana de 170 kDa proteína que actúa como una bomba de eflujo de fármaco, lo que resulta en un defecto continua en la acumulación intracelular de fármacos [22]. El fenotipo de resistencia a múltiples fármacos es la principal causa de fallo de la quimioterapia de tumores y es principalmente el producto de la sobreexpresión de P-gp en la mayoría de tipos de cáncer, incluyendo cáncer gástrico [23]. Además, la inhibición de esta vía podría ser una manera de invertir la MDR de células de cáncer gástrico [3], [24].
Cox-2, una enzima inducible que cataliza la conversión de ácido araquidónico a prostanoides ( PG) y participa en varios eventos fisiológicos y patológicos, se induce por diversos estímulos inflamatorios y mitógenos [25]. Una fuerte asociación entre la MDR y la sobreexpresión de Cox-2 ha sido reportado en muchos tipos diferentes de tumores. Estos resultados anteriores sugieren que la Cox-2 modula la expresión y la actividad de P-gp y está implicado en el desarrollo del fenotipo MDR [26] - [28]. Además, la evidencia acumulada ha demostrado que los inhibidores de la Cox-2 son capaces de sensibilizar a las células cancerosas a los efectos antiproliferativos de los fármacos quimioterapéuticos mediante la alteración de la actividad de la proteína casete de unión a ATP. inhibidores de Cox-2 pueden incluso revertir la MDR mediante el bloqueo de la mediada por aumento de la Cox-2 en la expresión y la actividad de MDR1 en el cáncer, tanto in vitro como in vivo [6], [7], [29]. Por lo tanto, la hipótesis de que la COX-2 puede regular la expresión de P-gp en los tejidos tumorales y que la inhibición de esta vía es de gran importancia para revertir la resistencia del cáncer a los fármacos quimioterapéuticos.
Se encontró que para el SGC7901 los tumores de células /ADR, los niveles de expresión de la Cox-2 y P-gp en el grupo de control NS eran mayores que los existentes para los xenoinjertos de células SGC7901. Después de la inyección de PAB, se observó una disminución obvia en estos niveles de expresión. Sin embargo, ADR fue menos eficaz para la supresión de los niveles de Cox-2 y P-gp de expresión de la SGC7901 /xenoinjertos de células de ADR, y cuando se combina con PAB, se observó un menor nivel de proteínas. Por lo tanto, hemos propuesto que la modulación de la Cox-2 expresión por PAB podría disminuir la expresión y la actividad de P-gp, inhibir el crecimiento e inducir la apoptosis, además de actuar cooperativamente con ADR en la supresión de tumores resistentes a los fármacos e incluso la inversión de el fenotipo MDR del cáncer gástrico.
PKC es una quinasa de serina /treonina implicada en la transducción de señal requerido para la proliferación y diferenciación celular [30]. De las isoformas de PKC, la sobreexpresión y la mayor actividad de PKC-α se asocian más estrechamente con la regulación del fenotipo MDR en el cáncer gástrico humano [31]. Los resultados presentados aquí apoyan la noción de que la PKC-α fosforila la P-gp, modula la función de flujo de salida de la P-gp, y en última instancia conduce a la resistencia a los medicamentos [32]. La inhibición de la PKC-α con un inhibidor específico o derribar PKC-α con siRNA conduce a la expresión de MDR1 reducida, aumento de la toxicidad de los fármacos contra el cáncer, y revirtió MDR [8] - [10]. Por lo tanto, se especula que un sistema de transducción de señal de PKC-α puede desempeñar un papel en la modulación de la expresión de MDR1 en el cáncer gástrico.
En circunstancias normales, PKC es inactivo en las células, y su activación se relaciona con la activación aguas arriba PGE. Cox-2 está acoplado a la prostaglandina asociada a la membrana E2 sintasa (mPGES-1), y la síntesis de PGE mediada por estas proteínas aumenta y activa la corriente abajo vía PKC-α [33]. Se ha demostrado que la inhibición selectiva de la Cox-2 por inhibidores o siRNA específico tiene un efecto terapéutico en la inhibición de la expresión de PKC-α y P-gp, mientras que también, al mismo tiempo, la inversión de la MDR [26], [34]. Un estudio ha demostrado que la PGE2 media la inducción de la expresión de MDR1 través de la vía PKC [35]. Los resultados de nuestros experimentos demostraron que PAB puede inhibir la expresión de PKC-α de xenoinjertos de la línea celular SGC7901 /ADR, cuyo efecto era más fuerte que la de ADR. Además, cuando PAB se combinó con ADR, la eficacia de inhibición de la expresión de PKC-α fue incluso más fuerte. La tendencia de variación de la expresión de PKC-α es consistente con la de la Cox-2 y P-gp en varios grupos tratadas con reactivo de tumores SGC7901 /ADR resistentes a los medicamentos. Se ha demostrado que PAB induce la detención del crecimiento y la apoptosis a través de la inhibición de la vía de la COX-2 en células de cáncer [20], [21]. Se postula que el PAB inhibe la expresión de Cox-2 en SGC7901 xenoinjertos de células /ADR y que el acoplamiento entre la Cox-2 y mPGES-1 reduce la síntesis de PGE, lo que reduce la activación de PKC-α aguas abajo. Como se inhibe la fosforilación de P-gp, más fármacos se acumulan en las células de cáncer, la toxicidad de ADR se mejora y MDR se invierte. Estos resultados proporcionan información sobre una nueva estrategia que implica el uso de PAB para inhibir la MDR de los cánceres gástricos humanos.
Uno de los objetivos de nuestro experimento es el efecto inhibidor del ácido B pseudolaric en xenoinjertos subcutáneos de adenocarcinoma gástrico humano y la comparación de los efectos antitumorales de drogas entre los diferentes grupos de tratamiento. Por otra parte, la característica de SGC7901 células y células SGC7901 /ADR son diferentes. A través de nuestros dos pre-experimento y un experimento formal y todos nos pareció el volumen tumoral de las células SGC7901 /ADR no era mayor que el de las células SGC7901. Se postula el volumen del tumor podría estar asociado con el número de células, tiempo de crecimiento, característica de las células y otros tipos de factores. Por lo tanto, no hemos comparado el volumen del tumor entre los xenoinjertos de células SGC7901 y xenoinjertos de células SGC7901 /ADR. Además, se especula que el cambio de peso corporal de los ratones podría ser principalmente relacionados con la toxicidad de las drogas, y tienen relación no significativa al volumen del tumor en nuestro experimento
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El otro foco de nuestro experimento es el subyacente mecanismos moleculares implicados en la resistencia a múltiples fármacos. Por lo tanto sólo hemos diseñado grupo de control NS de xenoinjertos de células SGC7901 para contrastar y confirmar las expresiones de los tres tipos de proteína a partir de xenoinjertos de células SGC7901 /ADR son de hecho significativamente mayor que la de los xenoinjertos de células SGC7901. Además, puesto que la respuesta de las células SGC7901 de medicamentos contra el cáncer es bastante más sensibles que las células SGC7901 /ADR en ambos experimentos básicos y clínicos, cómo mejorar la sensibilidad de las células resistencia a múltiples fármacos a medicamentos contra el cáncer es nuestro enfoque de la investigación. Por lo tanto, no hemos comparado las expresiones de la Cox-2, PKC-α y P-gp para los tumores de SGC7901 y los diversos tratamientos de este grupo a excepción de NS grupo de control por Western blot y tinción inmunohistoquímica.
nuestro estudio descubrió que la base de hierbas diterpenoide PAB no sólo suprimió significativamente células SGC7901 de cáncer gástrico in vivo, sino también muestra efectos inhibidores obvias hacia tumores de células SGC7901 /ADR resistentes a los medicamentos. Por otra parte, la combinación de PAB con ADR podría inhibir el crecimiento de cáncer gástrico y el desarrollo de xenoinjertos en ratones desnudos. Vale la pena mencionar que, como un tipo de la medicina tradicional china, el efecto de PAB en el peso corporal de los ratones nude era bastante inferior a la de ADR en nuestro experimento, que es una ventaja evidente que hace PAB un fármaco más seguro y tolerable para terapia del cáncer. PAB no sólo podría ser un nuevo medicamento eficaz para la inhibición del crecimiento de cáncer gástrico y revertir su MDR, pero también puede ser utilizado como un excelente adyuvante con agentes quimioterapéuticos tradicionales y terapia quirúrgica siguientes mayor desarrollo y la investigación.
en el presente estudio, hemos examinado, por primera vez, el efecto inhibidor de PAB contra el cáncer gástrico humano y su efecto en la reversión MDR in vivo a través de un modelo de xenoinjerto de ratones desnudos. Se determinó que su inhibición de la MDR fue mediada a través de la vía /P-gp Cox-2 /PKC-α, que proporciona una base teórica cruciales con respecto a los mecanismos moleculares de la terapia del cáncer gástrico. Sin embargo, no hemos estudiado el mecanismo de MDR en cuanto a la expresión y regulación génica. Dado que los mecanismos moleculares de revertir la MDR son extraordinariamente complicadas y múltiples tipos de proteínas, genes y factores pueden estar implicados, el bucle que hemos propuesto puede ser sólo una parte del mecanismo para revertir la MDR. Más en profundidad y los mecanismos de regulación de hormigón que ser dilucidado en futuros estudios.
En conclusión, PAB tiene un efecto inhibidor significativo sobre el cáncer gástrico in vivo y puede revertir la MDR de cáncer gástrico para los medicamentos de quimioterapia. El mecanismo contra MDR está mediada al menos parcialmente a través de la vía /P-gp Cox-2 /PKC-α. Nuestro estudio ofrece amplias perspectivas para futuras investigaciones de PAB en la terapia del cáncer gástrico.
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doi:. 10.1371 /journal.pone.0107830.s001 gratis (DOC)