Extracto
Integración de virus del papiloma humano ADN (HPV) en el genoma huésped es un evento etiológico fundamental en la progresión de cuello uterino normal a intraepitelial neoplasia, y finalmente a cáncer invasor cervical. Sin embargo, ha habido muy poco trabajo sobre cómo el estado de la integración del VPH se refiere a los resultados del tratamiento de los carcinomas cervicales. En el estudio actual, el número de copias de genes E6 y E2 del VPH se midieron en 111 tejidos de cáncer de cuello uterino utilizando qPCR en tiempo real. patrones de integración se dividieron en cuatro grupos: sola copia-integrado con componentes episomales (grupo 1), sola copia integrada sin componentes episomales (grupo 2), múltiples copias en tándem repetición integradas (grupo 3), y bajo el VPH (grupo 4) grupos . Un modelo de predicción de recaída se construyó utilizando multivariable de Cox de riesgos proporcionales de clasificar a los pacientes en diferentes grupos de riesgo para la supervivencia libre de enfermedad (DFS). El modelo fue validado internamente usando remuestreo bootstrap. Se realizó el análisis de microarrays de oligonucleótidos para evaluar patrones de expresión génica en relación con los diferentes grupos de integración. tasa de SSE fue inferior en el orden de los pacientes del grupo 4, grupo 2/3, y el grupo 1. El análisis multivariado mostró que el grado histológico, estadio clínico grupo, y el patrón de integración fueron factores pronósticos significativos de mala DFS. El modelo de pronóstico actual predijo con exactitud el riesgo de recaída, con un área bajo la curva ROC (AUC) de 0,74 (en arranque corregida, 0,71). En conclusión, estos datos sugieren que el patrón de integración del VPH es un factor pronóstico potente para el tratamiento personalizado del cáncer de cuello uterino
Visto:. Shin HJ, Joo J, Yoon JH, Yoo CW, Kim JY (2014) El estado físico de Virus del Papiloma humano Integración en el cáncer cervical está asociado con el resultado del tratamiento de los pacientes tratados con radioterapia. PLoS ONE 9 (1): e78995. doi: 10.1371 /journal.pone.0078995
Editor: Anthony W. I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 12 Agosto, 2013; Aceptado: September 25, 2013; Publicado: 10 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Shin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional del cáncer, Goyang, Corea (Grant 1.310.300 y 1.110.033). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Integración de virus del papiloma humano ADN (HPV) se ha considerado como un evento crítico en el proceso de la carcinogénesis cervical. ADN de VPH se encuentra para estar presente en formas integradas en células huésped con el aumento de la frecuencia de epitelio cervical normal a intraepitelial neoplasias y cáncer invasivo del cuello uterino [1], [2], [3]. Sin embargo, hay informes que muestran que el ADN episomal VPH está presente en una porción sustancial de los cánceres cervicales invasivos, lo que sugiere la integración no siempre se requiere para la progresión maligna [4], [5]. copia de integración HPV resultados individuales en la interrupción de la fase de lectura abierta E1 o E2 (ORF) [2], [4],. Como alternativa, la integración de múltiples copias de VPH puede ocurrir como repeticiones en tándem de cabeza a la cola [6], [7]. Cuando esto ocurre, sólo la copia viral que flanquean el ADN celular se interrumpe en la región E1 o E2, mientras que las copias internos tienen E1 intacta y marcos de lectura abierta E2 (ORF de). Mientras que la pérdida de la E2 ORF puede desregular la transcripción de E6 y E7, es posible que ORFs E2 intactos, que se encuentran con los genomas integrados multicopia tándem VPH, pueden expresar y reafirmar el control transcripcional de E6 /E7. En el presente estudio, se evaluó la importancia pronóstica de diferentes patrones de integración del VPH para DFS de cáncer de cuello uterino. A continuación se utilizó el análisis de microarrays para comparar las diferencias en la expresión genética total entre estos diferentes patrones de integración.
Materiales y Métodos
Características de los pacientes
Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Nacional del cáncer, Corea, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes. 111 pacientes consecutivos fueron reclutados de julio 2003 a julio 2008 con diagnóstico de VPH 16, 18, 58 o escamosas positivo, adeno, o carcinoma de células adenoescamosa del cuello del útero. Las características clínicas de estos pacientes se presentan en la Tabla 1. Diagnóstico de las intervenciones se incluyen rectosigmoidoscopía en todos los pacientes, imágenes por resonancia magnética (IRM) de la pelvis ± abdomen en 110 pacientes, y, o bien la tomografía por emisión de positrones (TEP) o PET /CT (tomografía computarizada) escanear en 93 pacientes. Todos fueron tratados con radioterapia que consiste en radioterapia de haz externo (RHE) y la braquiterapia de alta tasa de dosis. Durante la radioterapia externa, concomitante con cisplatino semanal de 40 mg /m
2 se le dio a todos los pacientes, excepto 9 pacientes que tenían una escala de rendimiento pobre. Después de la finalización del tratamiento primario, los pacientes fueron seguidos cada 3 meses durante los 2 primeros años, cada 4 meses durante el tercer año y cada 6 meses después. Los detalles de la radioterapia se han descrito anteriormente [8].
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real de los genes del VPH E6 y E2
La extracción, amplificación y genotipado de ADN se realizaron como anteriormente informado [8]. PCR en tiempo real se llevó a cabo con ABI Prism 7900HT Sistema y TaqMan PCR Universal Master Mix (PE Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Foster City, CA). Los cebadores y sondas fueron diseñados para la amplificación específica de las regiones de bisagra de E2 que se sabe que ser interrumpido con mayor frecuencia durante el proceso de integración viral [2]. La información de la secuencia de cada uno de los cebadores utilizados están disponibles en el cuadro S1. Se utilizaron cincuenta nanogramos de ADN diana de cada espécimen de biopsia por reacción y las curvas de calibración fueron producidos por la amplificación de una serie de dilución de 10
6 -10
3 copias de un clon de ADN de VPH en pBR322. Al menos tres no-plantilla mezclas de reacción de control se incluyeron en cada ensayo y todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Clasificación de los tumores cervicales con el estado físico de los genomas de HPV
Sobre la base de la el número de copias relativas de E2 y E6, los pacientes se clasificaron en 4 grupos; copia-integrado con componentes episomales (grupo 1) y único sin componentes episomales (grupo 2), múltiples copias en tándem repetición integradas (grupo 3), y bajo el VPH (grupo 4) grupos. Grupo 1 tumores todavía contienen VPH episomal con la amplificación de ambos E6 y E2 aunque se reducen los niveles de E2. Grupo 2 tumores no tienen amplificación E2. Grupo 3 tumores tienen los mismos niveles de E2 y E6 lo que indica multicopia tándem integración VPH repetida. Grupo 4 tumores no tienen amplificaciones E2 y E6. Estos cuatro grupos fueron finalmente volver a clasificar en tres grupos en función de sus diferentes resultados clínicos (grupo 1 frente a grupo de 2/3 frente a grupo 4).
Análisis de microarrays
Se realizó el análisis de microarrays para 39 pacientes de los cuales se pudieron obtener muestras tumorales frescas congeladas. Sólo los pacientes con infección por HPV 16 se incluyeron en el experimento de microarrays para evitar la heterogeneidad causada por diferentes genotipos de VPH. Como resultado, 14, 9, 12, y 4 muestras de grupos1 integración a 4, respectivamente, fueron analizados utilizando toda la expresión de genes v.1.0 microarray 44K humana (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA). Todos los datos numéricos se normalizaron con per-spot y por el chip de normalización (normalización dependen de la intensidad), y la normalización por-gen (la mediana) usando GeneSpring 7.3.1. Se utilizó el análisis de tendencia lineal clasificación basada en poner a prueba la tendencia lineal en las expresiones de genes entre diferentes patrones de integración ordenados por los resultados clínicos. método de permutación con 250.000 re-muestreo se realizó para evaluar el correspondiente
p-valor
. Los niveles de expresión en escala log 2 se utilizaron en el análisis, y la tasa de falso descubrimiento (FDR) [9] se controló a 0,05. los datos de microarrays se han depositado en la Expresión Génica Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y son accesibles a través de la Expresión Génica Omnibus número de serie GSE49288.
El análisis estadístico
Las características demográficas y clínicas se presentan como frecuencias y porcentajes para las variables categóricas, y la mediana y rango para las variables continuas. Las diferencias de distribución entre los grupos se evaluaron mediante la prueba de Chi-cuadrado de Pearson o la prueba exacta de Fisher. se obtuvo correlación de Spearman para medir la asociación entre el VPH carga viral y copiar números. Las diferencias en el número de copias entre los grupos se sometieron a pruebas de Kruskal-Wallis. Se empleó el modelo de riesgos proporcionales de Cox multivariable para predecir la DFS después de ajustar los efectos de otros posibles factores de confusión tales como la edad, la fase de grupos, el estado ganglionar, el grado histológico, y el tipo histológico. El modelo final se elige basándose en el resultado del análisis univariable así como la consideración de la importancia clínica o biológica de las variables. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SAS versión 9.1 (Cary, NC) y el software estadístico R, versión 2.12. Todos los reportados
p
-valores son de doble cara.
Validación del modelo de predicción utilizando remuestreo bootstrap
La capacidad de discriminación del modelo de Cox multivariable para predecir la enfermedad de 2 años gratis la supervivencia se evaluó mediante la estadística C, una medida de concordancia análogo al área bajo la curva de características operativas del receptor (ROC). La calibración del modelo se evaluó mediante la prueba de chi-cuadrado Tipo de Hosmer-Lemeshow mediante la comparación de la diferencia entre las tasas de supervivencia a 2 años observadas y predichas por el modelo desarrollado para los pacientes en cada quintil. Sobre la base de la tasa de supervivencia se predijo, tres grupos fueron formados por la división de los pacientes en terciles. La diferencia en las distribuciones de supervivencia de estos tres grupos se compararon mediante la prueba de log-rank. El modelo predictivo se validó utilizando muestras de arranque 1000 como una validación interna para corregir el sesgo al alza en la estimación estadística de C debido a la re-sustitución de los datos.
Resultados
número de copias de genes E6 y E2 y patrón de integración
clasificación de los pacientes en función de la cantidad relativa del número de copias E2 y E6 se tradujo en 31, 24, 37, y 14 pacientes de los grupos 1 a 4, respectivamente. Las relaciones de ciclo umbral (Ct) de E2 /E6 de los pacientes en cada grupo se muestran en un gráfico de dispersión (Fig. 1). 5 pacientes tenían patrones inclasificables. número de copias de E6 y E2 mostraron una correlación positiva en group3 (r = 0,83,
p
& lt; 0,0001) y con el grupo 1 (r = 0,43,
p = 0,02
) pero no en grupo2 ( r = 0,008,
p = 0,97
) ni en el grupo 4 (r = 0,26,
p = 0,37
).
las relaciones E2 /E6 computarizada de los pacientes en cada grupo se representan como puntos en el gráfico de dispersión. Las barras horizontales representan el valor de la mediana con rango intercuartil.
Univariable y análisis multivariable de los resultados del tratamiento
Durante el seguimiento, 33 pacientes (29,7%) desarrollaron progresión de la enfermedad incluyendo 25 metástasis a distancia o 10 recurrencias locales. Entre estos pacientes, tres tenían ambos. Trece pacientes murieron y la causa de la muerte de 2 pacientes entre ellos fueron las enfermedades cardiovasculares y desconocido, respectivamente. Ellos fueron censurados en la fecha de la muerte. Los pacientes fueron seguidos durante la mediana de 29 meses (rango, 2-67 meses). La mediana del período de seguimiento de los pacientes sin recurrencia fue de 36 meses (rango, 6-67 meses). Cuando los cuatro grupos se volvieron a clasificar en tres grupos, la tasa de SSE de los pacientes del grupo 1 fue la más alta, seguida por los grupos 2/3 y grupo 4 en un orden descendente. Los cocientes de riesgo (HR) y el intervalo de confianza fue de 1,90, intervalo de confianza (IC) 0,70 a 5,15,
p = 0,207
para el grupo 2/3 contra el grupo 1, HR 3,52, IC 1.11 a 11.14,
p = 0.
032 para el grupo 4 contra el grupo 1, respectivamente (
p = 0,083
mediante la prueba de log-rank, Fig. 2 y en la Tabla 2) en el análisis univariable. Otros parámetros pronósticos significativos de DFS incluyen la fase de grupos, metástasis ganglionar, el grado histológico, tipo histológico, y el tabaquismo mediante análisis univariable. En el análisis multivariable, patrón de integración (en general
p = 0,014
; para el grupo 2/3 vs el grupo 1,
p = 0,03
, HR 3,15, IC del 01/12 a 08/09; para el grupo 4 vs . el grupo 1,
p = 0,004
, HR 6,78; IC 1,86-24,79), el grado histológico, estadio clínico grupo, y la edad se mantuvo significativa (Tabla 2)
grupo 1.; la integración copia VPH solo con componentes episomales, Grupo 2; la integración sola copia del VPH sin componentes episomales, Grupo 3; Multicopia tándem repite la integración, Grupo 4; bajo el VPH.
El rendimiento de los modelos de resultados y la predicción de validación interna
El estadístico C del modelo para predecir la supervivencia de 2 años fue del 74% (IC del 95% , el 65% -83%) y el sistema de arranque validado C-estadística fue del 71%. El tipo de Hosmer-Lemeshow estadística de la prueba de Chi-cuadrado fue 9.02 con el correspondiente
p = 0,435
lo que indica un buen ajuste. El log-rank test resultó en una diferencia significativa entre distribuciones de supervivencia de los tres grupos de pacientes definidos por la tasa prevista de supervivencia (
p Hotel & lt; 0,0005). (Fig. 3 y en la Tabla 3)
análisis de microarrays de las 39 muestras de cáncer de cuello uterino
654 genes fueron seleccionados como muestra significativamente diferentes expresiones entre los grupos de integración clasificados por el estado físico del ADN del VPH (grupo 1 frente a grupo 2 /3 frente a grupo 4). Debido a que las tasas de supervivencia de los pacientes tienden a disminuir desde el grupo 1 a 4, se examinaron los genes que mostraron una tendencia correlativa en sus niveles de expresión. Como resultado, las expresiones promedio de 429 genes entre ellos demostraron ser en aumento gradual (241) o disminuir (188) en el orden del grupo 1 al 4 (Fig. 4). Después de una selección rigurosa sobre la base de la tasa de error sabia familia (corrección de Bonferroni) menos de 5%, los moduladores de transmembrana de la adhesión celular tales como claudin, ocludina, y syndecan permaneció como genes que muestran una disminución significativa del grupo de 1 a 4. Los reguladores de pequeña GTPasa señal de transducción mediada por proteínas tales como el control de la división celular 42 (CDC42) las proteínas efectoras, las proteínas activadoras de GTPasa Rho, y p21 (CDC42 /Rac) quinasa activado por 2 (PAK2) también se redujo significativamente. Estos genes son conocidos por jugar un papel importante en la reorganización de las fibras de actina estrés, la adherencia de célula a célula, la célula a la matriz extracelular. Entre los genes con el aumento de la tendencia de la expresión del grupo 1 a 4 eran de reguladores de la transcripción, como el factor X MYC-asociado (MAX) y el factor de necrosis tumoral (TNF). Además, había moléculas asociadas con la remodelación de la cromatina como rica en AT 1A dominio interactiva (SWI-like), rica en AT dominio interactivo 4B (RBP1 similar, BRCAA1), y el ADN helicasa chromodomain proteína de unión. Las funciones biológicas de estos genes fueron examinados utilizando la versión de Recursos DAVID Bioinformática 6,7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). La información detallada de los genes y
p-valor
de la tendencia lineal se enumeran en la Tabla S2. análisis Gene ontología uso de esta herramienta indica que el nivel de expresión de genes relacionados con la diferenciación de queratinocitos y linfocitos T fue muy baja en el grupo 4. Especialmente, retinoide X receptor alfa (NM_002957) se redujo significativamente en el grupo 4, mientras que fue más altamente expresado en el grupo 1 (datos no presentados). Esto apoya la observación de la falta de diferenciación del epitelio en los tumores con niveles bajos de DNA del VPH.
Discusión
En el estudio actual, el valor pronóstico de la condición física del VPH fue examinado en forma local tumores cervicales avanzadas. Nuestro estudio revela que los tumores cervicales con componentes tienen episomales supervivencia post-radioterapia superior en comparación con los que tienen VPH puramente integrado. Se encontró también que el pronóstico de cáncer de cuello uterino se reduce de manera significativa en los tumores con nivel no detectable de ADN de VPH.
Se ha demostrado anteriormente que los tumores invasivos no siempre se componen de células con ADN de VPH integrado 100%. Hay aproximadamente 17~20% de los pacientes con cáncer invasivo con episomal mezclado y formas integradas de HPV [4], [5] o incluso formas episomales sólo en 7% de los pacientes [4]. Además, varios estudios han demostrado que el estado físico de HPV en el cáncer cervical está asociado con los resultados del tratamiento [4], [10], [11]. patrones de integración virales han sido evaluadas por transferencia de Southern de E1 sitio /E2 [10] o por en el método de amplificación de señal de DNA viral in situ [11] o ambos de estos métodos [4].
cantidades relativas de E2 y E6 se utilizaron en este estudio y, sorprendentemente, se encontró que un tercio (37/111) de las muestras tenía la integración multicopia HPV. La presencia de VPH multicopia genomas de repetición en tándem en los tumores se sabe que es producido por el método de replicación por círculo rodante de HPV [12]. Si bien el pronóstico de los pacientes con VPH tanto la integración de copia única sin componentes episomales y multicopia integración repetida en tándem era pobre en nuestro estudio, la importancia biológica de esta observación necesita ser aclarado.
A pesar de genotipos del VPH y real rigurosa PCR en tiempo, hubo 14 pacientes con niveles indetectables de VPH E2 y E6 en sus tumores que mostraron la peor tasa de supervivencia entre los 4 grupos de integración. Es posible que los tumores con sin ADN de HPV pueden representar aquellos con más características de las células madre de cáncer que carecen de la diferenciación epitelial que la replicación viral se restringe con la replicación de HPV abortivo [13]. Consistente con esta hipótesis, el análisis de microarrays mostró una baja expresión de genes relacionados con la diferenciación de queratinocitos y linfocitos T. Por otra parte, sobre la base de estos datos, se asumió también que las diferencias intergrupales en remodelación de la cromatina pueden inducir la expresión diferencial de los diferentes genes. Especialmente, las moléculas asociadas con la señalización de Rho-GTPasa pueden contribuir al desarrollo en el fenotipo metastásico través de debilitamiento de la adhesión celular y la alteración morfológica como EMT (transición epitelio-mesenquimal) en los tumores con bajas tasas de supervivencia como se sugiere en nuestro estudio anterior [14] . Más estudios deben realizarse para probar esta idea
Los datos actuales son consistentes con nuestro trabajo anterior, que describe la carga viral alta. (HC2test; Digene Corp.) está fuertemente asociada con un buen pronóstico, mientras que los pacientes con una carga viral más baja ido mucho peor después de la radioterapia [8]. En resumen, hemos determinado patrones de integración HPV utilizando un nuevo método de PCR cuantitativa de análisis de la estequiometría de VPH E2 y E6 y determinado su relación con el resultado clínico después de la radiación. patrones de integración se encuentran por lo tanto ser un fuerte factor pronóstico que muestra una buena correlación con otros factores pronósticos conocidos como escenario, el estado ganglionar, tipo histológico y el estado de diferenciación. Se necesitan más estudios utilizando los números de muestra más grandes y métodos adicionales de análisis de patrones de integración del VPH en el cáncer cervical para confirmar estos hallazgos.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Primer y secuencias de la sonda para el gen E2 y E6-PCR en tiempo real
doi:. 10.1371 /journal.pone.0078995.s001 gratis (DOC) sobre Table S2.
Los genes que mostraron aumento de (a) y decreciente (b) la tendencia lineal del grupo 1 a al grupo 4; El nombre, función, factor de cambio (FC) de los genes y el valor p de la tendencia lineal se muestran en virtud de clasificación de genes ontología
doi:. 10.1371 /journal.pone.0078995.s002 gratis (DOC)