Extracto
Antecedentes
tensión mecánica a la compresión producida durante el crecimiento en una matriz de confinamiento limita el tamaño de esferoides tumorales, pero se sabe poco sobre la dinámica de la acumulación de estrés, cómo el estrés afecta el fenotipo de las células cancerosas, o las vías moleculares implicadas.
Metodología /Principales conclusiones
co las células cancerosas individuales -embedded con fluorescentes micro perlas en geles de agarosa y, utilizando microscopía confocal, registran la distribución 3D de micro perlas que rodean esferoides en crecimiento. El cambio en la densidad de microperlas a continuación se convirtió a la tensión en el gel, de la que se estimó la distribución espacial de la tensión de compresión alrededor de los esferoides. Se encontró una fuerte correlación entre la distribución peri-esferoide sólido estrés y forma esferoide, un resultado de la supresión de la proliferación celular y la inducción de la muerte celular apoptótica en las regiones de alta tensión mecánica. Mediante la compresión de esferoides que constan de células cancerosas que sobreexpresan los genes anti-apoptóticos, se demuestra que la apoptosis inducida por el estrés mecánico se produce a través de la vía mitocondrial.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados proporcionan una visión detallada y cuantitativa en el papel del estrés mecánico micro-ambientales en la dinámica de crecimiento del tumor esferoides, y sugieren cómo los tumores crecen en lugares cerrados donde el nivel de estrés se convierte en sólido alta. Una implicación importante es que la apoptosis a través de la vía mitocondrial, inducida por el esfuerzo de compresión, pueden estar implicados en la latencia del tumor, en el que el crecimiento del tumor se mantiene bajo control por un equilibrio de la apoptosis y la proliferación
Visto:. Cheng G, Tse J, Jain RK, Munn LL (2009) El estrés mecánico micro-ambientales Controla el tamaño del tumor y la morfología del esferoide por la supresión de la proliferación y la inducción de apoptosis en células cancerosas. PLoS ONE 4 (2): e4632. doi: 10.1371 /journal.pone.0004632
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 21, 2008; Aceptado: 2 Enero 2009; Publicado: 27 Febrero 2009
Derechos de Autor © 2009 Cheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH P01CA80124, R01CA085140 y R01CA126642. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El crecimiento de tumores sólidos está fuertemente influenciada por su microambiente. parámetros microambientales Además bien estudiadas, tales como la hipoxia [1], [2] y la angiogénesis [3] - [5], las tensiones mecánicas también juegan un papel importante. Para un tumor sólido crezca en un espacio cerrado definido por el tejido circundante, se debe superar las fuerzas de compresión resultantes. Se ha demostrado que los tumores y su estroma asociado son mecánicamente más rígido que el correspondiente tejido huésped normal [6], y que la compresión mecánica en un entorno tal puede colapsar la sangre y los vasos linfáticos [7]. Sin embargo, nuestra comprensión de cómo esta compresión influye directamente en el crecimiento del tumor es limitado. Se han propuesto diversas hipótesis con respecto a la implicación de los esfuerzos mecánicos en el desarrollo de tumores [8] - [11], y Helmlinger et al. [12] llevó a cabo la primera cuantificación de la inhibición del crecimiento de esferoides en geles de agarosa. Encontraron que esferoides carcinoma de colon humano pueden crecer hasta un tamaño máximo de 400 mm (diámetro) en 0,5% (w /v) de agarosa, pero sólo 50 micras de 1,0% de agarosa (que es menos compatible). Esto se asoció con un aumento en el embalaje celular y una disminución en la proliferación celular. También demostraron que tal inhibición del crecimiento tumoral puede ser revertida por la liberación de los esferoides del gel. Sin embargo, varias preguntas clave siguen sin respuesta, incluyendo: (1) ¿Cuál es la naturaleza del campo de esfuerzos en torno creciendo esferoides tumorales? (2) ¿Puede local de distribución de la tensión sólido afectar a la forma de esferoides tumorales? (3) ¿distribución de la tensión sólido también afecta el fenotipo de células en diferentes regiones del esferoides individuales? (4) ¿Cuál es la vía intracelular que regula el sólido cambio fenotípico inducido por el estrés (s)? Estas preguntas son fundamentales para una comprensión fundamental de la dinámica de crecimiento de tumores sólidos.
En este estudio, mostramos que la acumulación de estrés sólida en geles de agarosa alrededor crecientes esferoides tumorales (células de carcinoma mamario murino 67NR no metastásicos salvo indicación en contrario ) se puede medir usando co-incrustado fluorescentes micro perlas (diámetro = 1 m) como marcadores para la cepa en el gel: geles de agarosa son resistentes a la degradación por proteasas celulares de cáncer [13], y por lo tanto permitir que los estudios de sólido acumulación estrés independiente de la invasión de células. Se demuestra que la forma de la campo de esfuerzos sólido dicta la forma de esferoides tumorales y que este efecto es debido a la supresión de la proliferación celular y la inducción de apoptosis de las células en las regiones de estrés sólido de alta. Por último, dilucidar el mecanismo molecular por el sólido apoptosis inducida por el estrés.
Resultados
Cultivo esferoides tumorales comprimen progresivamente la matriz circundante
Fig. 1
Un
muestra el crecimiento de un esferoide típicos de los tumores (verde) co-integrado con micro perlas (rojo) en gel de agarosa al 0,5% durante 30 días (ver configuración experimental en la figura complementaria. S1
). Análisis mediante microscopía confocal 3D reveló que el gel de agarosa se comprime progresivamente por el crecimiento de esferoides (Fig. 1
B Opiniones). En los puntos de tiempo tempranos, había mucha fluctuación en la densidad de micro-talón (
ρ
perlas), principalmente debido a que el esferoide todavía era bastante pequeña y, como resultado, el volumen de muestreo para la medición de
ρ
cuentas era limitado. Los aumentos significativos en
ρ
cuentas comenzaron a aparecer en el día 17, cuando el diámetro esferoidal (
D
SPHD) fue sólo ~ 150 micras. Para el día 30,
D
SPHD habían llegado a ~ 250 micras y
ρ
cuentas en el primer micras de espesor de cáscara de gel de agarosa al 10 (
ρ
perlas, 1) se ~1.6 veces la de geles no acentuadas, que corresponde a una cepa 37,5% (
ε
gel, 1). tensión significativa se limitaba a las inmediaciones del esferoide:
ρ
cuentas disminuyeron a su nivel de control dentro de ~ 50 m de la superficie de esferoides (Fig 1
B Opiniones, día 30. curva). La relación entre el crecimiento de esferoides y la cepa resultante en el gel agrose es lineal en el rango de
D
SPHD medido en nuestro estudio (Fig. 1
C
). De propiedades mecánicas publicadas de 0,5% en gel de agarosa [14], se estimó que el esferoide en la Fig. 1
A
impuso ~28 mmHg de estrés sólida en la matriz inmediatamente adyacente al día 30, similar al valor estimado teóricamente por Helmlinger et al. [12]. Para esferoides cultivados en gel de 1,0%, el volumen de muestreo para la cuantificación de la densidad de micro-grano era demasiado pequeña porque la mayoría de esferoides no podrían crecer más grande que 50 micras de diámetro.
(
A
) Un esferoide crecimiento (verde) y sus micro perlas circundante (rojo). Barra de escala = 100 micras. (
B Opiniones) Cuantificación de la densidad relativa de microperlas (
ρ
perla) en 10 m de espesor conchas de gel de agarosa en torno a la creciente esferoide se muestra en la
como una función de la distancia de la cáscara del centro del esferoide (
dist
). (
C
) Correlación entre el diámetro del esferoide (
D
SPHD
) y la cepa en la primera cáscara gruesa de 10 micras de gel de agarosa (
ε
gel, 1) alrededor de esferoides.
R
es el coeficiente de regresión lineal; pendiente de la recta de regresión es significativamente mayor que cero (
p Hotel & lt; 0,0001).
esferoide forma del tumor se correlaciona fuertemente con la forma del campo de esfuerzos locales sólida
En las inmediaciones de algunos esferoides, el gel no bajo la tensión producida por el crecimiento de esferoides. Esto dio lugar a grietas planas micro-escala en el gel (Fig. 2
Un
, puntas de flecha). Aunque los esferoides seleccionadas para el análisis en la Fig. 1 no residían dentro de tales grietas y eran todos, casi de forma esférica, esferoides que no existen dentro de las grietas formas adoptadas achatados (es decir, aplanado esferas, la figura 2
Un
;. También ver la película S1 para el procesamiento 3D). La cuantificación de la densidad de micro-talón alrededor de esferoides típicos esféricas y achatados reveló una fuerte correlación entre la forma esferoide y la forma del campo de tensión mecánica local (Fig. 2
B, 2C
). Esto fue confirmado por los resultados de los análisis similar en ~ 25 esferoides de distintas formas (Figs. 2
D
). Helmlinger et al. observado un fenómeno similar por esferoides de crecimiento en tubos de vidrio capilar 1 mm:. los esferoides alargados a lo largo del eje del tubo, presumiblemente en respuesta al campo de tensión local [12]
(
A
) gel de agarosa puede fallar bajo tensión de esferoides tumorales en crecimiento (verde). puntas de flechas rojas indican el borde de grietas planas en el gel de agarosa (BF: imagen de campo brillante tomada en modo de Nomarski). Barra de escala = 50 micras. (
B Opiniones) esferoides (verde) de diferentes formas y sus campos de esfuerzos circundantes visualizadas mediante micro perlas (rojo). Barra de escala = 150 micras. (
C
) Relación entre la cepa local en gel de agarosa (
ε
gel, 1, local) y la deformación esferoide local (
λ
SPHD, local) de los esferoides (verde, recuadro) que se muestran en
Un
.
dist
seg es la distancia de los segmentos esferoides de centro esferoide normalizada sobre la longitud del eje mayor. (
D
) Correlación entre la asimetría en forma de esferoides y en la cepa correspondiente en el gel de agarosa circundante, lo que demuestra que los esferoides se deforman más a lo largo de la dirección del esfuerzo mayor. Cada punto de datos es para un esferoide.
R
es el coeficiente de regresión lineal; pendiente de la línea de regresión es significativamente mayor que cero (
p
& lt; 0,0001). Los métodos para el análisis de imágenes en
C
y
D ¿Cuáles son los métodos descritos en S1, que complementa la figura. S2, Película S2 y S3 de la película.
High sólida estrés suprime la proliferación celular e induce la muerte celular por apoptosis en esferoides tumorales
Para investigar el potencial cambia fenotípica que el estrés sólida induce en las células cancerosas, se evaluó la proliferación celular y la apoptosis en los esferoides. La división celular cerca de las regiones de la tensión más alta (es decir, en la dirección del eje menor de esferoides achatados) se redujo en comparación con las regiones de tensión inferior (Fig. 3). Para comprobar cómo el estrés afecta a la compresión de la viabilidad celular, se analizó la apoptosis y la necrosis en esferoides vivo cultivadas en 0,5% (Fig. 4) o geles de agarosa 1,0% (Complementario. Fig S3). En el gel de 0,5%, la apoptosis y la necrosis aparecieron cuando los esferoides fueron sólo ~ 50 micras de diámetro (Fig. 4
Un
, día 12) y continuó aumentando, llegando a ser extensa a día 28. Posteriormente, la apoptosis áreas fueron reemplazados gradualmente por necrosis hasta que, el día 45, la necrosis casi había alcanzado la superficie del esferoide. En gel de agarosa al 1,0%, el esferoide no podía crecer más grande que ~ 30 m de diámetro, y se detectaron apoptosis y necrosis incluso en estas pequeñas esferoides (Complementario. Fig S3). Estas observaciones en vivo esferoides se confirmaron mediante tinción inmunohistoquímica de muestras fijadas (Fig. 4
B Opiniones). Además, había una fuerte correlación entre la fracción local de la muerte celular en esferoides y la cepa local en el gel de agarosa (Fig. 5).
Las puntas de flecha indican las regiones con más proliferación celular. Barra de escala = 50 micras.
(
Un
) El desarrollo de la apoptosis (verde) y la necrosis secundaria (rojo) en un esferoide creciente incrustado en gel de agarosa al 0,5%. Barra de escala = 100 micras. (
B Opiniones) La tinción inmunohistoquímica (TUNEL y hematoxilina) que confirma los resultados en
Un
. Imagen en el panel inferior muestra el detalle de la zona dentro de la línea de puntos en la imagen en el panel superior. Barra de escala = 50 micras.
(
Un
) esferoides vivo (verde) de diferentes formas, la muerte celular interna (rojo), y sus campos de esfuerzos circundantes visualizado por micro cuentas (gris). La línea verde en la columna de la derecha muestra el borde de esferoides. Barra de escala = 100 micras. (
B Opiniones) Relación entre la cepa local en gel de agarosa (
ε
gel, 1, local) y la fracción de necrosis local en esferoides (
δ
SPHD, local) para las dos esferoides se muestran en
Un
. (
C
) Correlación entre la asimetría en la fracción necrótico esferoide y la cepa correspondiente en el gel de agarosa circundante, mostrando que hay más muerte celular a lo largo de la dirección de la mayor tensión de compresión. Cada punto de datos es para un esferoide.
R
es el coeficiente de regresión lineal; pendiente de la línea de regresión es significativamente mayor que cero (
p
& lt; 0,0001). Los métodos para el análisis de imágenes en
B Opiniones y
C
se describen en métodos complementarios, adicionales Fig. S2, S3 y la película de la película S4.
Para verificar que las limitaciones de nutrientes, factores de crecimiento o el oxígeno no eran responsables de la muerte celular por apoptosis en la Fig. 4, se evaluó la apoptosis en esferoides crecido a tamaños similares en suspensión libre (gotitas colgantes). Los cultivos de suspensión libres tenían ninguna matriz de confinamiento externo y poca apoptosis (Fig. 6
Un
, Condición 1). Para comprobar si las interacciones célula-agarosa contribuido a la muerte celular, se transfieren esferoides de suspensión libres en el 0,5% geles de agarosa donde se les permitió aclimatarse durante 3 días. A diferencia de los esferoides cultivadas a partir de células individuales en gel de agarosa (Fig. 6
Un
, condición 3), los esferoides transferidos no tienen tiempo para acumular niveles significativos de estrés sólida, y tenían mucho menos la muerte celular ( Fig. 6
Un
, Condición 2). Por lo tanto, es poco probable que la toxicidad de gel o limitaciones de nutrientes, factores de crecimiento o de oxígeno son responsables de la apoptosis observada en los esferoides estresados.
(
A
) caspasa-3 actividad (verde) en esferoides tumorales (rojo) en cultivo en suspensión libre (Condición 1), se transfirió a gel de agarosa al 0,5% durante 3 días después de alcanzar la meseta de fase en suspensión libre (Condición 2), o cultivadas a partir de células individuales en gel de agarosa al 0,5% (Condición 3 ). Barra de escala = 100 micras. (
B Opiniones) La cuantificación de la fracción de células apoptóticas en esferoides tumorales cultivadas en las 3 condiciones en
Un
.
inducida por el crecimiento aplicado externamente imita compresión estrés
Si la tensión de compresión causa la muerte celular por apoptosis en esferoides tumorales, no debería importar si se trata de un crecimiento inducido o externamente aplicado. Por lo tanto, para cuantificar el efecto del estrés sólida sobre la apoptosis de las células bajo condiciones controladas, que primero comprimimos monocapas de células de cáncer de 17 h con presiones que van desde 0 mmHg a 60 mmHg (véase la configuración experimental en complementario Fig. S1
B
) y se observó aumento de la apoptosis con mayor nivel de estrés (Fig. 7
Un
). entonces transferimos esferoides aproximadamente 300 micras de diámetro de la suspensión libre en gel de agarosa al 1% y las cultivadas en tres condiciones: medio normal sin compresión externa, medio de inanición (sin glucosa, sin suero y 1% de oxígeno) sin compresión o medio normal con externo de compresión (ver configuración experimental en la figura complementaria. S1
C
). Se evaluó la actividad de caspasa-3 en 1 hora, 3 horas, 5 horas y 7 horas (Figura 7
B, 7C
;. los tiempos de compresión relativamente cortos fueron elegidos para minimizar el potencial complicación de nutrientes /factor de crecimiento /oxígeno limitaciones en la cultura 3D). La compresión aumenta drásticamente la actividad de caspasa-3, que se estabilizó después de 5 horas. Los esferoides que se mueren de inanición pero un-estresado tenido mucho menos apoptosis que los de las muestras comprimidas, indicando de nuevo que las limitaciones de glucosa, suero y oxígeno solo no dan cuenta de los niveles de muerte celular demostrados en la figura. 4.
(
Un
) la actividad de caspasa-3 aumenta en monocapas de células de cáncer en respuesta al aumento de la tensión externa. Las células se comprimen durante 17 horas. (
B Opiniones) Actividad de la caspasa-3 en esferoides hechas a partir de dos líneas celulares de cáncer diferentes en respuesta a diferentes tensiones externas (0 mmHg o 15 mmHg) y las condiciones de nutrientes (Normal: medio normal; inanición: sin glucosa, sin suero y 1% de oxígeno). (
C
) la actividad de caspasa-3 Típica (verde) en esferoides (rojo) se cultivaron en 3 de las condiciones en
B Opiniones. Barra de escala = 100 um. (
D
) Bcl-2 sobre-expresión inhibe la apoptosis inducida por el estrés, pero crmA transducción no. Esferoides se comprimieron con 15 mmHg durante 7 horas mientras se suministra con medio normal.
La vía mitocondrial regula la apoptosis celular inducida por el estrés mecánico en esferoides tumorales
Por último, se determinó cuál de las dos principales vías de apoptosis [15] regula el sólido apoptosis de las células inducida por el estrés. Transduced células cancerosas para sobreexpresar crmA que inhibe caspasas iniciadoras incluyendo caspasa-1 y la caspasa-8 en la vía de la muerte del receptor [16], o Bcl-2, un inhibidor bien conocido de varias caspasas en la vía mitocondrial [17]. esferoides de suspensión libres de tipo salvaje o células transducidas crecido hasta ~ 300 micras de diámetro se transfirieron a gel agrose 1% y se comprimen como se ha descrito antes. Higo. 7
D
muestra que la sobreexpresión de Bcl-2 reduce significativamente la muerte celular inducida por la compresión de los esferoides, mientras crmA sobreexpresión tiene poco efecto. Del mismo modo, la sobreexpresión de crmA en una línea celular de carcinoma de mama murino altamente metastático EMT6, que tiene un alto nivel de endógeno expresión Bcl-2 [18], no proteger más lejos de la actividad de compresión inducida por la caspasa-3 (datos no presentados), lo que sugiere que la vía mitocondrial de la apoptosis regula sólida inducida por el estrés.
Discusión
en el presente estudio abordó varias cuestiones pendientes en relación con el efecto de la tensión de compresión en la dinámica de crecimiento de los tumores sólidos. Aunque los modelos matemáticos empíricos tales como la curva conocida gompertziano crecimiento [19] y el más reciente "ley de crecimiento universal" [20] - [22] puede predecir la ampliación de muchos tumores sólidos con buena precisión, que no consideran explícitamente celular dinámica dentro de los tumores. En particular, la aparición invariable de una fase de meseta después de tumores han alcanzado un cierto tamaño no se ha explicado satisfactoriamente. Como la mayoría de los tumores sólidos de más de 1 mm de diámetro inducen la angiogénesis [3], nutriente o el agotamiento del oxígeno no deben limitar el crecimiento del tumor. Nuestro estudio muestra que el estrés sólido crecimiento inducida puede afectar el fenotipo celular, y sugiere que puede ser un "equilibrio dinámico" de la proliferación y la apoptosis que mantiene el tamaño del tumor en la fase de meseta, como se propone por Holmgren et al [23].
La muerte celular por apoptosis causada por dicha tensión es de particular interés. La apoptosis durante el desarrollo general se piensa que es provocada por factores de crecimiento y otras señales del medio ambiente [24], [25], y el papel de la tensión mecánica en este proceso ha sido recientemente considerado [26], [27]. Nuestros resultados sugieren que la falta de homogeneidad en las propiedades mecánicas del tejido de confinamiento pueden guiar cambios morfológicos en el crecimiento tumoral, independientemente de la migración de células, mediante la inducción de la apoptosis en las regiones de alta tensión de compresión y permitir la proliferación en las regiones de baja tensión. Por otra parte, la apoptosis inducida por compresión se produce a través de la vía mitocondrial, un mecanismo de control reglamentario que las células cancerosas con niveles elevados de actividad de Bcl-2 pueden escapar de producir tumores más malignos.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y células
no metastásico murino de carcinoma mamario 67NR se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se utilizaron para la mayoría de los experimentos en este estudio. las células metastásicas de carcinoma mamario murino EMT6 se ofrecen generosamente por el Dr. James Freyer (Laboratorio Nacional de Los Alamos, Los Alamos, Nuevo México). 67NR células se mantuvieron en alta glucosa (4,5 mg /ml) de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) suplementado con ácidos 1% no esenciales aminoácidos (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 10% de bovino fetal suero (FBS). células EMT6 se mantuvieron en medio esencial mínimo alfa (Mediatech, Manassas, VA) suplementado con 10% FBS. Para los experimentos que requieren libre de glucosa y libre de suero y el medio ambiente hipóxico (indicado el "medio de inanición"), los esferoides se cultivaron en DMEM libre de glucosa (Invitrogen) suplementado con FBS no, y en 5% de CO
2-1% O
2-N
2 biomédica de aire (Airgas Medio, Salem, NH).
transducción anti-apoptótica de Bcl-2 y crmA
se sembraron un millón de células cancerosas en una placa de Petri de 10 cm de diámetro y se transfectaron mediante la adición de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y el ADN plásmido que contiene la longitud completa murina Bcl-2 (ATCC) o modificador de la respuesta de citoquinas a (crmA, generoso regalo del Dr. Brian Seed en Massachusetts hospital general, Boston, MA) de ADNc y el marcador seleccionable puromicina. Veinticuatro horas después de la transfección, se pasaron las células y se añadió medio de selección que contiene 20,0 mg /ml de puromicina. Después de 7-10 días de cultivo en este medio, sólo unas pocas colonias se mantuvieron; estos se agruparon y se propagan en presencia de puromicina a nivel de selección. La expresión de Bcl-2 y crmA en las células transfectadas se determinó por cuantitativa en tiempo real PCR (Bcl-2) o PCR (crmA) con los cebadores apropiados. Una vez que se estableció una línea de células transfectadas estables, las células se mantuvieron en presencia de puromicina a nivel de selección.
ensayos de PCR
Cuantitativo en tiempo real PCR (ABI Prism 7300, Applied Biosystems, Foster City, CA) se utilizó para determinar el nivel de ARNm de Bcl-2 gen transfectado en células cancerosas. Las condiciones de los ciclos térmicos consistieron en 35 ciclos de amplificación PCR (desnaturalización: 95 ° C 30 seg, hibridación /extensión: 68 ° C, 1 min). El nivel de mRNA del gen crmA se evaluó usando el ensayo de PCR convencional. Los siguientes cebadores sentido y antisentido fueron diseñados utilizando software Primer2 (Applied Biosystems): Bcl-2: 5'-GGGATGCCTTTGTGGAACTATATG y CTGAGCAGGGTCTTCAGAGACA-3 '; crmA: 5'-AAGCTTATGGATATCTTCAG y GCCTGCCGCTTAATTAGTTGT-3 '; y GAPDH:. 5'-ACAGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG y GGCCTTGACTGTGCCGTTGAATTT-3 '
Cultura de esferoides tumorales co-integrado con micro perlas en geles de agarosa
Para controlar el crecimiento de esferoides y la acumulación de estrés, las cantidades apropiadas de GFP o RFP células cancerosas de marcaje único, 1 mm (diámetro) perlas fluorescentes carboxilato modificados (Molecular Probes, Eugene, OR), 2,0% (w /v) de agarosa (tipo VII, baja temperatura de gelificación, Sigma, St. Louis , MO) solución madre (1X PBS) y medio de cultivo celular se mezclaron de manera que las concentraciones finales de las células, micro-cuentas y agarosa eran 3,5 × 10
3 células /ml, 4,5 x 10
5 perlas /ml y 0,5% o 1,0%, respectivamente. La parte inferior de un 10 mm x 2 mm (diámetro x profundidad) cilíndrica bien en un portaobjetos de vidrio de 5 mm de espesor (a medida) se revistió primero con 50 l de 1,0% en gel de agarosa libre de células para evitar la fijación de células. 300 l de la mezcla de células /micro-cuentas /agarosa después se añadieron al pocillo y se dejaron polimerizar durante 10 minutos a temperatura ambiente. El portaobjetos de vidrio se colocó en un 100 mm × 25 mm placa de Petri llena de 40 ml de medio de cultivo celular (ver la configuración experimental en complementario Fig. S1
A
). El medio se repone cada 5 días.
Imágenes y cuantificación de compresión de matriz alrededor de esferoides crecimiento
Se midió el volumen de esferoides crecimiento y la distribución 3D de sus micro perlas que rodean cada 5-7 días utilizando un sistema de 500 microscopio confocal Olympus FlouView (Olympus, Center Valley, PA). En cada punto de tiempo, un volumen de 638 micras x 638 micras x 250 micras Se obtuvieron imágenes de manera que el ecuador del esferoide se centró en la superficie inferior del volumen; el tamaño del paso en Z fue de 1 m. Tres pilas de imágenes de control de micro-perlas se adquirieron usando el mismo procedimiento, pero en las zonas libres de esferoides cercanos al menos 500 m de distancia de cualquier esferoide (de modo que la densidad del grano no se vio afectada por la compresión crecimiento inducida). Para determinar la densidad de microperlas local como una función de la distancia desde el esferoide, un Matlab (Mathworks, Natick, MA) rutina calcula la distancia mínima de cada micro-talón a la superficie esferoidal y, posteriormente, la densidad relativa de micro- granos gruesos en "conchas" de 10 micras de todo el esferoide (
ρ
perlas, normalizadas con respecto a la densidad de micro-talón en las pilas de imágenes de control). La cepa de gel de agarosa en esos proyectiles se calcula entonces como
ε
gel = 1-1 /
ρ
Perlas. Este procedimiento conserva el efecto de la variación microscópica en forma de la superficie del esferoide en la deformación de la matriz.
Cultura de esferoides tumorales en gotas colgantes
Para crear esferoides tumorales para los experimentos de compresión aplicadas externamente, se utilizó el método de gota colgante. Brevemente, 20 gotas mu l de suspensión de células de cáncer (3,0 × 10
5 células /ml para 67NR y 2,0 × 10
5 células /ml para EMT6) se añadieron en el interior de una cubierta de placa de Petri de 10 cm de diámetro . Después de colocar la cubierta posterior en el plato lleno con 10 ml de medio de cultivo, el plato se colocó en la incubadora (5% de CO
2, 37 ° C) para permitir el crecimiento de esferoides dentro de cada una de las gotas. Esferoides suele alcanzar aproximadamente 300 micras de diámetro después de 3 días de cultivo.
Compresión de monocapas de células de cáncer y esferoides tumorales
Para la compresión de las monocapas de las células cancerosas, las células se sembraron sobre la membrana de un 6 pocillos transwell inserte con 0,4 micras poros (Corning, Lowell, MA). se añadieron 1,5 ml y 2,5 ml de medio de cultivo celular a las cámaras superior e inferior del pozo, respectivamente. Después de la incubación durante la noche (para la adhesión celular a la membrana), una capa de 2 mm de espesor de gel de agarosa al 1% se colocó en la parte superior de las células y los pistones de peso deseado a continuación, se aplicaron en el gel de agarosa para la compresión (véase la configuración experimental en complementario La Fig. S1
B Opiniones). Durante la compresión, los poros de la membrana transwell insertar permitido convección del fluido fuera del gel y también la difusión de nutrientes, factores de crecimiento y oxígeno a los esferoides. Para la compresión de esferoides tumorales, se recogieron los esferoides cultivados en gotas colgantes y re-suspenden en solución de agarosa 1,0%. A continuación se añadió 1 ml de la solución en un 6 pocillos Transwell insertar con 0,4 micras poros en su membrana, haciendo que el espesor de gel ~ 2 mm. La mezcla de esferoide-agarosa se dejó gelificar durante 20 min a temperatura ambiente, después de lo cual se añadieron 1,5 ml y 2,5 ml de medio de cultivo celular a las cámaras superior e inferior del pozo, respectivamente. A continuación, el constructo esferoide-gel se comprime con un pistón de peso deseado (ver configuración experimental en la figura complementaria. S1
C
).
tinción y la imagen de la proliferación, la caspasa-3 actividad y necrosis en esferoides tumorales
se detectaron células proliferantes en esferoides con un Kit de la proliferación de células de fluorescencia (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) por el protocolo del fabricante. Brevemente, esferoides se marcaron con un reactivo de marcaje BrdU, fija (1% de formalina, 0,1% de Triton en PBS), se incubaron con un reactivo anti-BrdU /nucleasa y finalmente se incubaron con Cy5 etiquetados de cabra anti IgG de ratón. La caspasa-3 actividad y necrosis en las células cancerosas o esferoides se detectaron con Nucview 488 caspasa-3 Kit de ensayo para células vivas (Biotium, Hayward, CA) y yoduro de propidio (PI, Molecular Probes, Eugene, OR), respectivamente. Las monocapas de células se tiñeron durante 15 min y construcciones esferoide-gel teñido durante 45 minutos a 4 ° C y se enjuagaron dos veces con medio fresco. Las células marcadas fueron imágenes utilizando un sistema de 500 microscopio confocal Olympus FlouView (Olympus, Center Valley, PA). Los resultados se cuantificaron como el porcentaje de la caspasa 3 células /PI positivas en la población.
Los ensayos inmunohistoquímicos para apoptótica en esferoides tumorales
Los esferoides se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 4 horas y luego embebido en parafina. 5 m secciones fueron cortadas de los bloques de parafina y las células cancerosas se tiñeron para apoptosis con ApopTag® (Chemicon International, Temecula, CA). Las células fueron contra el teñidas con hematoxilina.
Estadísticas
Los valores se caracterizan por la media aritmética y error estándar de la media (SEM). Las diferencias significativas entre las diferentes poblaciones de datos se pusieron a prueba con el estudiante
t-test para
observaciones no pareadas.
Apoyo a la Información
métodos complementarios S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0004632.s001 gratis (DOC 0,05 MB)
Figura S1.
montajes experimentales. esferoides (A) El cultivo tumorales co-integrados con micro perlas de gel de agarosa. (B) exógeno Aplicar, bien definido esfuerzo de compresión a una monocapa de células cancerosas. (C) La aplicación exógena, bien definido tensión de compresión en esferoides tumorales crecido a un tamaño deseado en gotas colgantes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s002 gratis (14.63 MB TIF)
figura S2 . Análisis FODA de imágenes 2D. (A-G) Cuantificación de deformación local en un esferoide tumor (verde, GFP transducción) y la cepa local correspondiente en el gel de agarosa utilizando micro-perlas (rojo). (H-K) La cuantificación de la fracción local del área necrótica (rojo, yoduro de propidio tinción) en un esferoide (verde, GFP transducción). (L) La correlación de las asimetrías en la forma esferoidal y en la cepa de gel. (M) La correlación de las asimetrías en la necrosis esferoide y en la cepa de gel
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s003 gratis (5.25 MB TIF)
Figura S3. Francia El desarrollo de la actividad de caspasa-3 (verde, columna izquierda) y la necrosis (rojo, columna central) en el crecimiento de esferoides tumorales (imagen transmitida superpuesta con las caspasa-3 y necrosis imágenes, columna derecha) en agarosa al 1%. Barra de escala = 20 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s004 gratis (7.48 MB TIF)
película S1. renderizado 3D
de un esferoide achatado tumor cultivadas en gel de agarosa al 0,5%
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s005 gratis (MOV 3.13 MB)
película S2. El análisis de imágenes
para cuantificar la deformación local de esferoide tumoral
doi: 10.1371 /journal.pone.0004632.s006 gratis (MOV 0.45 MB)
película S3. El análisis de imágenes para cuantificar
cepa local en gel de agarosa causada por el crecimiento del tumor esferoide
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s007 gratis (MOV 0.56 MB)
película S4. El análisis de imágenes
para cuantificar la muerte celular del tumor local en esferoide
doi:. 10.1371 /journal.pone.0004632.s008 gratis (MOV 0.31 MB)
Reconocimientos
gracias a los Dres. Patrick Au, Yves Boucher, Emmanuelle di Tomaso, Igor Garkavtsev, Shan Liao, Tim Padera, y Xu Lei (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) para contribuir experiencia para este estudio, el Dr. Brian Seed (Massachusetts General Hospital, Boston, MA ) para los plásmidos CRMA y el Dr. James Freyer (Laboratorio Nacional de los Alamos, los Alamos, Nuevo México) para las células EMT6.