Extracto
antitumoral CD8
+ células T son un determinante clave para la supervivencia global en los pacientes después de la resección quirúrgica de tumores sólidos. El uso de un modelo de ratón de la vacunación del cáncer (melanoma antígeno asociado a tumor adenovirus que expresa (TAA) -dopachrome tautomerasa (AdDCT) y la resección resultante en el estrés de cirugía mayor (nefrectomía abdominal), se demuestra que los resultados de estrés quirúrgico en una reducción en el número de CD8
+ de células T que producen citoquinas (IFN, TNF, granzima B) en respuesta a TAA. Este efecto es secundario a la proliferación reducida y deterioro de la función de las células T después de unión a antígeno. en un modelo profiláctico, estrés quirúrgico abroga completamente protección tumor conferida por la vacunación en el postoperatorio inmediato. en un modelo de resección quirúrgica clínicamente relevante, los ratones vacunados sometidos a una resección de márgenes positivos con el estrés quirúrgico habían disminución de la supervivencia en comparación con los ratones con la resección de márgenes positivos solo. inmunoterapia preoperatorio con IFN se extiende significativamente la supervivencia en ratones estresados quirúrgicamente . Es importante destacar que las células supresoras mieloide derivados (MDSC) las cifras de población y el deterioro funcional de TAA-específica CD8
+ células T se vio alterada en los ratones quirúrgicamente subrayó. Nuestras observaciones sugieren que la progresión del cáncer puede resultar de la supresión inducida por cirugía de tumor específico de CD8
+ células T. inmunoterapias preoperatorios dirigidas a la orientación de los efectos de la cirugía del cáncer prometastatic reducirá recurrencia y mejorar la supervivencia en pacientes de cirugía de cáncer
Visto: AA. Ananth, Tai LH, Lansdell C, Alkayyal AA, Baxter KE, Angka L, et al . (2016) Estrés quirúrgico abroga preexistentes T protectora celular mediada por la inmunidad antitumoral que lleva al postoperatorio recurrencia del cáncer. PLoS ONE 11 (5): e0155947. doi: 10.1371 /journal.pone.0155947
Editor: Hiroyoshi Nishikawa, exploratoria Investigación Oncológica & amp; Centro de Ensayos Clínicos, Centro Nacional del Cáncer, JAPÓN
Recibido: 9 Octubre, 2015; Aceptado: 6 Mayo de 2016; Publicado: 19 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Ananth et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Investigación Terry Fox, New Investigator Award (RCA); Canadian Institutes of Health Research Fellowship (LHT); Instituto Canadiense de Cáncer de la Sociedad de Investigación, Innovación e Innovación de Impacto Grant (RCA)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La importancia de la vigilancia inmune en el control de derivación de células malignas ha sido conocido durante décadas. El principio de que existen células T presentes en la naturaleza con potencial antitumoral en el cáncer humano ha llevado a el campo emergente de la inmunoterapia del cáncer. Tumores sí mismos, sin embargo, son capaces de secuestrar el sistema inmunitario para suprimir el control inmune, creando un ambiente favorable, no sólo para el principal, sino también para consecuencia metastásico. Este último proceso se ha denominado "instigación sistémica" [1]. La comprensión de este entorno tumoral inmunosupresor y revertir con agentes dirigidos está demostrando ser una estrategia de tratamiento de gran éxito [2].
La resección quirúrgica es el pilar de el tratamiento con intención curativa en tumores malignos sólidos. Incluso con resección completa, muchos pacientes desarrollan recurrencia local o metástasis y finalmente mueren de su enfermedad [3-6]. la evidencia acumulada muestra una asociación entre la presencia de CD8
+ células T efectoras y mejorado el pronóstico y la supervivencia en una serie de tumores malignos sólidos, incluyendo cáncer de mama, de ovario, colorrectal, carcinoma de células renales y el melanoma maligno [7-9].
Esta asociación sugiere que la presencia de un robusto anti-tumor inmune respuesta, en particular antitumoral CD8
+ células T efectoras, puede prevenir o eliminar la enfermedad residual mínima o micrometástasis después de la resección quirúrgica completa del tumor primario.
Nuestro grupo y otros han demostrado que el postoperatorio inmediato periodo es un tiempo particularmente susceptibles para el desarrollo de metástasis recurrencia del cáncer [3, 4, 10]. Hay una serie de mecanismos propuestos para explicar este efecto incluida la difusión de células tumorales en la circulación [11], la liberación local y sistémica de mediadores pro-angiogénicos y mitogénicos (factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento endotelial vascular) [3, 10, 12 ] y profunda inhibición de la inmunidad mediada por células [3, 10]. Hemos implicado previamente la supresión inducida por la cirugía de las células asesinas naturales (NK) en el desarrollo de metástasis postoperatorias [3, 4] en un modelo animal validado de estrés quirúrgico y las metástasis [13]
.
Mientras que los estudios anteriores han informado de una reducción en CD8
+ células T y la disminución de la secreción de citoquinas en respuesta a la estimulación no específica [14-17], ninguno ha explorado la naturaleza de los efectos del estrés quirúrgico en antígeno CD8
+ respuestas específicas de células T ni han demostrado la derogación de un antitumoral protectora preexistente CD8
+ T cell respuesta. En este manuscrito, se exploran los efectos del estrés quirúrgico en un CD8 protectora
+ células T efectoras mediadas por la inmunidad antitumoral. Para lograr esto, se utiliza una vacuna antitumoral basada en vectores virales llamada AdDCT. Este es un incompetente para la replicación tipo humano con deleción de E3 E1 /5 Adenovirus (Ad) que expresa la Dopachrome tautomerasa (AHFC) gen humano de longitud completa [18] como un antígeno asociado a tumor (TAA). Se ha demostrado previamente que la vacunación profiláctica AdDCT puede conferir protección contra la vía subcutánea (sc) implantado en un melanoma CD8
+ T dependiente de células de manera [18-21]. Proporcionamos preclínica
in vivo
resultados que indican claramente que la cirugía mayor puede atenuar de manera significativa una respuesta inmune de células T de protección preexistente después de la vacunación del cáncer y proporcionar el nuevo uso de la inmunoterapia preoperatoria para revertir este efecto.
Materiales y Métodos
ratones
C57BL /6, BALB /c, y desnudos CD1 ratones fueron adquiridos de The Jackson Laboratory (Bar Harbor). Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos y de todos los estudios realizados fueron de conformidad con las directrices institucionales en las instalaciones de Cuidado de Animales Servicio de Veterinaria de la Universidad de Ottawa (Ontario). El Consejo Canadiense de Protección de los Animales y el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Ottawa aprobó este estudio.
Generación de estrés quirúrgico
Cuidado de rutina perioperatoria (incluyendo la anestesia y el tratamiento del dolor) y el estrés quirúrgico eran realizado como se describe anteriormente [3, 13]. Brevemente, los ratones fueron sometidos a 2,5% de isofluorano (Baxter Corp.) para la inducción y mantenimiento de la anestesia. estrés quirúrgico fue inducida en ratones mediante una laparotomía abdominal (3 cm incisión en la línea media) y nefrectomía izquierda (Nx). Todos los animales sometidos a procedimientos quirúrgicos recibirán inyecciones de buprenorfina pre y post-operatorio (0,05 mg /kg) administrada SC. Antes de la operación, los ratones se inyectan SC 1 hora antes de la cirugía. Después de la operación, los ratones se inyectan SC cada 8 horas durante 2 días. El peso corporal y otros aspectos del bienestar de los animales se registran todos los días después de la cirugía (Tabla S1). los datos no se recoge la sangre. Los ratones fueron sacrificados mediante inyección intraperitoneal (ip) de pentobarbital sódico (65 mg /kg).
Las líneas celulares
B16F10LacZ se obtuvo línea celular de melanoma del Dr. K. Graham (Ciencias de la Salud de Londres, Ontario , originalmente de la American Type Culture Collection) y se mantuvieron en DMEM completo. Las células se resuspendieron en DMEM sin suero para (iv) la inyección intravenosa a través de la vena de la cola lateral. Las células tumorales en & gt; 95% de viabilidad se inyectaron en un volumen de 0,1 ml /ratón
La vacunación de ratones
ratones anestesiados fueron vacunados con 1x10
6 unidades formadoras de placas (UFP) de. AdDCT (reconstituido en 100 pl de PBS) o PBS solo por vía intramuscular (IM) de la inyección en cada muslo (50 l por cada muslo).
modelos de tumores de vacunación profiláctica
Los ratones fueron vacunados con AdDCT o PBS en el día 0. en el día 7, los ratones fueron inyectados con células tumorales, ya sea sc o iv cirugía anterior. tumores de melanoma Sc se establecieron mediante la inyección de 3x10
5 células B16F10lacZ en medio libre de suero, en el flanco posterior derecha; el tamaño del tumor se midió dos veces por semana y los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula 1/2 (L x W
2). Los ratones se determinó que tenía punto final alcanzado cuando el volumen del tumor alcanzó 1600 mm
3. modelos de diseminación sistémica fueron sembradas a 1x10 células
6 B16F10lacZ a través de la administración iv vena de la cola. Portadores de tumores pulmones se tiñeron con X-gal para visualizar las micrometástasis de tumores como se describe anteriormente [3].
La vacunación terapéutica modelo de tumor
Los ratones fueron inyectados sc con 1x10
5 células en B16F10lacZ medios libres de suero en el flanco trasero derecho en el día 0. en el día 7, los ratones se trataron con PBS o AdDCT a la dosis indicada (pfu). El día 14, los tumores sc fueron resecados con un margen positivo de 2x2 mm, con la mitad de recibir el estrés quirúrgico adicional en forma de una laparotomía abdominal y nefrectomía izquierda. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana y los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula 1/2 (L x W
2). Los ratones se determinó que tenía punto final alcanzado cuando el volumen del tumor alcanzó 1600 mm
3. Para el tratamiento preoperatorio IFN (R & amp; D Systems), los ratones recibieron 1 dosis alta (10000 UI) en el día 10 y 3 dosis bajas (1000 UI) en los días 11 a 13.
Los péptidos
el péptido inmunodominante de DCT que se une a H-2K
b (DCT
180-188, SVYDFFVWL; compartida por DCT humana y murina). se sintetizó Biomer Tecnología (Pleasanton, California)
la citometría de flujo
para la tinción extracelular, los esplenocitos se incubaron durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad con anticuerpos conjugados fluorochrome- (diluido 1: 100) específicos para antígenos de superficie celular y se fijaron con 1% PFA. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: CD3-PerCP (Biolegend), CD8α- FITC (BD Biosciences), CD4-PE (BD Pharmingen), Gr-1-FITC (eBioscience), CD25-FITC (Biolegend), FoxP3-APC (eBioscience ), CD11c-PeCy7 (eBioscience) y CD11b-PE (eBioscience). Para la tinción intracelular, 1-2x10
6 esplenocitos se estimularon con péptidos DCT (2μg /ml) en presencia de brefeldina A (GolgiPlug; BD Pharmingen, 1μg /ml añadido después de 1,5 horas de incubación). Después de 6 horas de incubación, las células fueron tratadas con anti-CD16 /CD32 y los antígenos de la superficie celular fueron marcadas con anticuerpos conjugados con fluorocromo. Las células fueron entonces permeabilizaron y se fijaron con Cytofix /Cytoperm (BD Pharmingen) y se tiñeron para las citocinas intracelulares: IFN-PE (BD Biosciences), TNF-PeCy7 (Biolegend) y granzima B-APC (eBioscience). Los datos fueron adquiridos utilizando un flujo Cian-ADP 9 citómetro con el software Summit 4.3 (Beckman Coulter) y se analizaron con el software de Kaluza 1.2 (Beckman Coulter).
Análisis DCT-específica MHCI tetrámero y ELISPOT
Los esplenocitos se trataron con anti-CD16 /CD32 y se marcaron con PE conjugado con DCT
180-188 MHC-I tetrámero cargado con péptido (Baylor College), PerCP-CD3 y FITC-CD8a (eBioscience) durante 30 minutos en FACS tampón (1% PBS, suero de ternera fetal al 5%, 2,5% NaZ). Para los análisis ELISPOT, el número exacto de DCT-MHC-I tetrámero
+ /CD8
+ células T se calcula a partir de los resultados de citometría de flujo proporción y se añade a un IFN ELISPOT siguiendo las instrucciones del fabricante (Mabtech).
T apoptosis de las células de ensayo
Los esplenocitos fueron tratados con anti-CD16 /CD32 y los antígenos de la superficie celular fueron marcadas con PE-CD3 y FITC-CD8a (eBioscience). Las células se marcaron a continuación con APC-AnnexinV y 7-AAD (BD Pharmingen) durante 15 minutos y los datos fue adquirida en el Cyan-ADP (Beckman Coulter) en una hora.
BrdU T proliferación de las células de ensayo
los esplenocitos se volvieron a estimular in vitro con péptidos (2μg /ml) a 37 ° C en presencia de brefeldina a (GolgiPlug; BD Pharmingen, 1μg /ml añadido después de 1,5 horas de incubación). Después de 3,5 horas de incubación, las células fueron marcadas con BrdU (BD Pharmingen) y se incubaron durante una hora adicional. Después de 6 horas de incubación, las células fueron tratadas con anti-CD16 /CD32 y los antígenos de la superficie celular fueron marcadas con PerCP-CD3 y PE-CD8a. Siguiendo las instrucciones del fabricante, las células se trataron a través de una serie de permeabilizations y fijaciones y se tiñeron para intracelular FITC-BrdU.
MDSC-T supresión de células de ensayo
Se aislaron células T del bazo de ratones que recibido la vacunación AdDCT 7 días antes de la cosecha. MDSCs fueron aisladas de los bazos de ratones control y estresados quirúrgicamente (18 horas después de la cirugía). Las células T se seleccionaron positivamente para el uso de microperlas CD90.2 (Miltenyi Biotec) y MDSC se seleccionaron positivamente para usar el kit de aislamiento de células Supresor de origen mieloide (Miltenyi Biotec), ambos siguiendo los protocolos del fabricante. Las células se resuspendieron a 1 x 10
6 células /50 l cRPMI y cocultivadas en varios MDSC: relaciones de T (0,25: 1, 0,5: 1, 1: 1). CD3 /CD28 Dynabeads (Life Technologies) se añadieron al cultivo en una proporción 1: 1 de células To- Microesfera además de 30 U /ml de interleucina-2 de ratón recombinante según la recomendación del fabricante. Las células fueron cultivadas durante 4 días en un CO
2 incubadora a 37 ° C. Después de 4 días, las células se transfirieron a una placa de 96 pocillos de fondo en V para la estimulación con el péptido re- DCT mediante el protocolo indicado anteriormente para la tinción intracelular.
El análisis estadístico
Una forma de análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba de Bonferonni post hoc se realizaron para todos los datos. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo. La significación estadística de las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se determinó mediante pruebas de log-rank.
Resultados
Estrés quirúrgico daña la inmunidad antitumoral que resulta en la metástasis de pulmón y el crecimiento de los tumores subcutáneos
Para determinar el impacto del estrés quirúrgico en las células T-TAA específicos, hemos desarrollado un modelo de cirugía de la vacunación AdDCT. Utilizando nuestro B16F10lacZ melanoma en los pulmones modelo establecido cirugía de metástasis [3, 13], que se administra AdDCT neoadyuvante seguida de 7 días más tarde con la inoculación del tumor mediante inyección intravenosa y cirugía mayor con una laparotomía y la nefrectomía (Figura 1a). La vacunación con 1x10
6 pfu de AdDCT confirió una disminución de 3 veces en las metástasis en comparación con los tratados con PBS ratones de control. Sin embargo, los ratones vacunados sometidos a cirugía mayor demostraron un aumento de 5 veces en las metástasis en comparación con la vacunación sola (Fig 1b). Esto sugiere que la cirugía atenúa la inmunidad antitumoral conferida por la vacunación AdDCT
.
(a) B6 ratones se les administró AdDCT neoadyuvante en el 1 × 10
7 pfu. En el día 7, los ratones fueron desafiados con 3x10 iv
5 de las células B16F10lacZ el fin de establecer metástasis de melanoma de pulmón singénicos, y luego se sometieron a laparotomía abdominal y la nefrectomía (Nx) o sin cirugía. (B) Los pulmones extraídos en el día 10 (3 días después de la inoculación de células tumorales) de PBS, Nx, AdDCT, AdDCT + Nx y cuantificadas mediante tinción con X-Gal. N = 5 /grupo. (C) B6 ratones fueron vacunados con AdDCT, después se expusieron en el día 7 con sc 1x10
6 células B16F10lacZ, a continuación, se sometió a una cirugía o sin cirugía. (D) El volumen del tumor de los ratones portadores de tumores tratados sc B16F10lacZ se controló diariamente. (E) La supervivencia de ratones portadores de tumores tratados B16F10lacZ sc se muestran en las curvas de Kaplan-Meier. Porcentaje de ratones vivos se indica. N = 7-8 /grupo, (* P & lt; 0,05, *** P & lt; 0,001).
Se ha demostrado previamente que iv inyectado células de melanoma son más susceptibles a la lisis por NK mediada por células en comparación con el melanoma sc, en gran parte debido a las diferencias en el microambiente del tumor y las proporciones de células inmunes [22, 23]. Para descartar un papel mediador de las células NK, se realizó la exposición al tumor mediante una inyección subcutánea de células tumorales B16F10lacZ en el flanco trasero (figura 1c). En los ratones vacunados con AdDCT que no estaban sometidos a estrés quirúrgico, 100% rechazó un desafío posterior del tumor, mientras que todos los ratones que se sometió a una cirugía mayor en el momento de desafío desarrollado tumores en los flancos del tumor a una velocidad similar a los ratones no vacunado al control de (1d y 1e figura). Además, se observó la atenuación de la inmunidad preexistente anti-tumor por el estrés quirúrgico en un modelo de cáncer colorrectal CT26 (S1 Fig), lo que sugiere que la disfunción inducida por la cirugía de la inmunidad específica de tumor no es exclusivo de nuestro modelo de melanoma. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el estrés quirúrgico en ratones vacunados-AdDCT abroga una respuesta inmunitaria antitumoral protectora.
Cirugía inducida por la abrogación de la protección conferida por la vacunación AdDCT es dependiente de CD3
+ T cell
para demostrar el papel de mediador para el sistema inmune adaptativo en el deterioro inducida por la cirugía de la vacunación AdDCT protectora, se repitió el modelo de tumor desafío pb en el CD-1 ratones desnudos que son deficientes en células T y B, pero que conservan las células NK función [24] (Fig 2a). En ratones desnudos, la vacunación AdDCT no protegió a los ratones forman un desafío tumoral y estrés quirúrgico no dio como resultado una diferencia significativa en la supervivencia en los ratones vacunados-AdDCT (Fig 2b). Esto sugiere que el sistema inmune adaptativo es esencial para los efectos protectores de la vacunación AdDCT y los efectos negativos del estrés quirúrgico sobre el crecimiento de tumor en nuestro modelo. Establecer las células T como mediador tanto para la protección del tumor después de la vacunación y AdDCT para la susceptibilidad al crecimiento del tumor después de una cirugía mayor, que forma adoptiva transferidos 1.0x10
7 purificada esplénica CD3
células de los ratones vacunados con AdDCT y desde T + quirúrgicamente hincapié en ratones vacunados-AdDCT en ratones receptores no tratados previamente. 1 día después de la transferencia de células T, los ratones receptores fueron desafiados con tumores sc B16F10lacZ (figura 2c). Se controló la supervivencia en el tiempo. Los ratones que recibieron células T de los donantes vacunados fueron 90% protegido de la exposición al tumor B16, mientras que los que recibieron el mismo número de células T de los donantes vacunados quirúrgicamente estresado todos los tumores de flanco progresivas desarrollados (Fig 2d). Por traslación subrayado quirúrgicamente las células T y volver a crear el efecto de la cirugía sobre la vacunación protectora, se estableció que el efecto perjudicial de la cirugía en la vacunación AdDCT es mediada por células T.
(a) CD-1 ratones desnudos fueron vacunados con 1 x 10
7 AdDCT pfu. En el día 7, los ratones fueron desafiados con tumores sc B16F10lacZ y luego se sometieron a cirugía o no la cirugía. (B) La supervivencia de B16F10lacZ portadores de tumores CD-1 ratones desnudos tratados se muestran en las curvas de Kaplan-Meier. Porcentaje de ratones vivos se indica. N = 7-8 /grupo. (C) los ratones B6 fueron vacunados con 1x10
7 AdDCT pfu y en el día 7, los ratones se sometieron a cirugía o sin cirugía. En el día 8, el bazo CD3 + células T
se aislaron y se transfiere a ratones B6 receptor ingenuo. En el día 9, los ratones receptores fueron desafiados con tumores sc B16F10lacZ. (D) La supervivencia de ratones portadores de tumores tratados B16F10lacZ se muestran en las curas de Kaplan-Meier. Porcentaje de ratones vivos se indica. N = 7-8 /grupo.
Resultados de estrés quirúrgico en una disminución de CD8
+ T producción de citoquinas de células en respuesta a TAA
Dado que el estrés quirúrgico dio lugar a la atenuación de aclaramiento de las células T mediada por las células tumorales
in vivo
, se cuestionó si AdDCT inducida T producción de citoquinas de células en respuesta a TAA (DCT) se ve afectado por la cirugía. Utilizando el mismo modelo de la vacunación AdDCT neoadyuvante seguida de la inoculación del tumor y el estrés quirúrgico importante 7 días más tarde, se evaluó la secreción de citoquinas en DCT-específica CD8
+ células T aisladas del bazo en 18 horas después de la cirugía. Se observó una disminución significativa en las proporciones de CD8
+ células T secretoras de IFN (Fig 3a y 3b), TNF (Fig 3c) y granzima B (figura 3d) en respuesta a la estimulación péptido DCT y una reducción en el número de CD8
+ células T secretoras de IFN en respuesta a la estimulación no específica con PMA e ionomicina (S2 Fig). Además, se realizó un ensayo ELISPOT de IFN para corroborar nuestra citometría de flujo resultados y encontramos una atenuación similar en el número de DCT-específica CD8
+ células T productoras de IFN después de la cirugía mayor (Fig 3E y 3F). Estos datos sugieren que el estrés resulta quirúrgicas en una disminución en el número de TAA específicos CD8
+ T cell que secretan citoquinas tras la estimulación péptido DCT.
B6 ratones recibieron la vacunación neoadyuvante con 1 × 10
7 pfu AdDCT. Al día 7, los ratones fueron desafiados con 3x10 iv
5 de las células B16F10lacZ el fin de establecer metástasis de melanoma de pulmón singénicos, y luego se sometieron a cirugía o no la cirugía. En el día 8, los ratones fueron sacrificados y la evaluación de células inmunes del bazo se sometieron. Porcentaje de DCT-específico (a) IFN
+, (c) TNFa
+, (d)
+
células granzima B CD8 + T que reaccionan a DCT
exposición 180-188 péptido . (B) Representante flujo citometría de gráficos de puntos de IFN
+ /CD8
+ células T que reaccionan a DCT
180-188 exposición péptido DCT-específica. (E) La cuantificación de SFU en el ensayo de IFN ELISPOT. (F) Corresponde imágenes representativas de ensayo ELISPOT IFN de células CD8
+ T-reaccionando a DCT
180-188 exposición péptido. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001) guía empresas
quirúrgicamente destacaron las células T exhiben reducida secreción de citoquinas, la proliferación y la infiltración tumoral en respuesta a TAA
informes anteriores han demostrado una reducción global de las CD8
+ T después de la cirugía [10, 14]. Usando nuestro modelo de la vacunación AdDCT seguida de cirugía mayor de 7 días más tarde, también demostró una reducción del número de células CD8 globales
+ T aisladas de bazo 18 horas después de la cirugía (Figura 4a). Esta reducción no era secundario a un aumento de la muerte celular, como se mide por AnnexinV y tinción 7AAD (Fig 4b), pero se asoció con una reducción en la proliferación de células T, medida por la incorporación de BrdU después de la estimulación DCT-péptido (Fig 4C). A continuación trató de determinar si la disminución del número de CD8
+ células T secretan citoquinas en respuesta a DCT era secundario a una disminución en la proporción de
células DCT-específicos CD8 + T (es decir, células T capaces de DCT de unión ) o una alteración funcional de la secreción de citoquinas siguiente DCT-estimulación. El uso de un tetrámero MHC de clase I DCT-específico, hemos demostrado ninguna reducción en la proporción de DCT-específica CD8
+ células T después de estrés quirúrgico en ratones vacunados (4d y 4e Fig). Con el fin de confirmar que DCT-específica CD8
+ células T fueron perjudicados funcionalmente después de la cirugía, se plateó el mismo número de DCT tetrámero de unión CD8
+ células T en un ELISPOT después de la estimulación de péptidos DCT y observó una reducción significativa de la la secreción de IFN (figura 4f). Además, se evaluó la cinética de expresión de IFN en DCT-específica CD8
+ T células en diversos puntos de tiempo después de la vacunación y de la cirugía y se observan un período de recuperación de la funcionalidad de las células T entre el día postoperatorio (POD) 7 y POD 28 ( s3a y S3b figura). La recuperación observada de la función de las células T en el POD 28 también se correlaciona con una respuesta inmune antitumoral como los ratones de cirugía-recuperados fueron capaces de rechazar un desafío tumoral B16lacZ sc con la misma eficacia que la cirugía no hay controles (Fig S3c). Finalmente evaluamos si CD8
+ migración de células T en el tumor se vio afectada por el estrés quirúrgico. Para solucionar esto, vacunamos a los ratones con AdDCT seguido de 7 días más tarde por inyección sc de células tumorales mezclados con un tapón de matrigel y cirugía mayor. tapones de Matrigel Se evaluó la infiltración de linfocitos de 3 días después de la implantación. Nuestros datos demuestran que las células CD8
+ T se redujeron a la mitad en los tumores de los ratones estresados quirúrgicamente, lo que indica que la cirugía afecta infiltración inmune tumor (Fig 4 g). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que los principales resultados de la cirugía en una reducción global en CD8
+ células T que no es secundario a un aumento de la muerte celular, pero que se asocia con la inhibición de la proliferación. La proporción de células DCT-T específicas no se reduce con respecto al número global, pero las células T DCT-específicos restantes son disfuncionales en su capacidad de secretar IFN en respuesta a antígeno tumoral. Por último, CD8
+ T infiltración de células de tumores también se deteriora tras el estrés quirúrgico.
B6 ratones recibieron la vacunación neoadyuvante con 1 × 10
7 AdDCT pfu. Al día 7, los ratones fueron desafiados con 3x10 iv
5 de las células B16F10lacZ el fin de establecer metástasis de melanoma de pulmón singénicos, y luego se sometieron a cirugía o no la cirugía. En el día 8, los ratones fueron sacrificados y la evaluación de células inmunes del bazo se sometieron. (A) Número total de células CD8
+ T, (b) el número total de Anexina V
- /7-AAD
- /CD8
+ T (en vivo), Anexina V
+ /7-AAD
- /CD8
+ T (a principios de la apoptosis), Anexina V
+ /7-AAD
+ /CD8
+ T (finales de la apoptosis) de las células, (c ) el porcentaje de BrdU
+ /CD8
+ células T, (d) el porcentaje y (e) gráfico de puntos representativos de la DCT-tetrámero
+ /CD8
+ células T que reaccionan a DCT
180-188 exposición péptido, (f) la cuantificación de la SFU de DCT-tetrámero
+ /CD8
+ células T que reaccionan a la exposición DCT
180-188 péptido en el ensayo ELISPOT IFN. (G) Número total de CD8
+ /CD3
+ T células por mg de tumores de los ratones B6 desafiados con tumores sc B16F10lacZ mezclados con matrigel en el día 7. El día 10, los tapones de Matrigel se retiraron y se evaluó la inmunológico infiltración de células por citometría de flujo. N = 4-6 /grupo. (* P & lt; 0,05, *** P & lt; 0,001).
Cirugía altera la función de la vacuna en un modelo B16 terapéutico de la enfermedad mínima residual (EMR) y pueden ser rescatados parcialmente con IFN perioperatoria
Teniendo en cuenta las limitaciones de un modelo profiláctico de la vacunación del cáncer, hemos desarrollado un modelo terapéutico del melanoma B16 clínicamente relevante de la enfermedad residual mínima (ERM) (figura 5a). En este modelo, todos los ratones tenían tumores en los flancos implantados en el día 0 seguido de vacunación AdDCT en día 7, la resección del tumor primario con un margen positivo 2 mm en el día 14 para simular MRD en pacientes de cirugía de cáncer humano, seguido por el estrés quirúrgico adicional. Al igual que en el modelo profiláctico, se observó que los ratones vacunados con AdDCT que recibieron resección solo sobrevivieron significativamente más que los ratones vacunados con AdDCT con estrés quirúrgico adicional (Fig 5b). Teniendo en cuenta los efectos supresores de la cirugía en DCT-específica CD8
+ inmunidad de células T preexistente, se administró inmunoterapia citoquina preoperatoria en forma de tratamiento IFNa para rescatar la función de células T y mejorar la supervivencia (Fig 5c). Se observó que la mediana de supervivencia de los ratones que AdDCT sometidos a resección y la nefrectomía fue 17 días, mientras que la mediana de supervivencia se extendió a 27 días en ratones tratados con IFNa perioperatorios (Fig 5d) vacunado. A continuación, examinamos si el tratamiento directamente IFNa en el contexto de las funciones de vacunación AdDCT para mejorar las respuestas de células T DCT-específicos. Curiosamente, la terapia con IFN preoperatoria no impactó significativamente la secreción de citoquinas (IFN y TNF) de DCT-específica
+ células T CD8 (Fig S4). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que podemos combinar la inmunoterapia con cirugía mayor para prolongar la supervivencia en el período postoperatorio. Sin embargo, otras células efectoras (tales como células NK) pueden jugar un papel en adición a
células DCT-específicos CD8 + T en la mediación de los efectos beneficiosos de IFNa.
sc (a) Se inyectaron ratones B6 con 1x10
6 células B16F10lacZ. En el día 7, los ratones fueron vacunados con AdDCT. En el día 14, se resecaron los tumores (Res) con un margen de 2 mm +/- estrés quirúrgico (Res + Nx). (B) La supervivencia de ratones portadores de tumores tratados B16F10lacZ se muestran en las curvas de Kaplan-Meier. N = 7-8 /grupo. c) El tratamiento preoperatorio en el día 10 con 1 dosis alta (10.000 UI /ratón) y en los días 11 a 13 con 3 dosis bajas (1000 UI /ratón) de mIFNα recombinante en MRD modelo de vacunación. La supervivencia de ratones portadores de tumores tratados B16F10lacZ se muestran en las curvas de Kaplan-Meier. N = 5-6 /grupo.
expansión inducida por la cirugía de granulocítica MDSC perjudica T de citoquinas de células de secreción
Por último, hemos investigado los mecanismos de supresión de células T en ratones portadores de tumores recibir la vacunación y sometidos a estrés quirúrgico. Mieloides células supresoras derivadas (MDSC) representan una población de células mieloides inmaduras que se expanden de manera espectacular durante la progresión tumoral y alteran la inmunidad adaptativa [25]. En los ratones hay dos poblaciones de MDSC definidas por su relativa expresión de Gr1 y el estado funcional [26, 27]. Específicamente, se observó un aumento significativo en la proporción de bazo granulocítica MDSC (gMDSC) en quirúrgicamente estresado y ratones vacunados (Figura 6A), pero no monocítica MDSC (mMDSC) (6b Fig) en comparación con los controles vacunados sin cirugía. Por el contrario, no se observó ninguna diferencia en las poblaciones de bazo T reguladoras (Treg) después de la vacuna y la cirugía (Figura 6c). Para analizar la capacidad de la cirugía gMDSC derivados para suprimir la función de las células T activadas por la vacuna, esplénica gMDSC fueron aisladas de los ratones control y quirúrgicamente estresado y cocultured con células T de ratones vacunados con Ad-DCT. En presencia de la cirugía derivados gMDSC, la producción de IFN (Fig 6D) y TNF (Fig 6e) por CD8
+ células T DCT-específicos se inhibieron significativamente en respuesta a péptido DCT. Además, se evaluó si el tratamiento preoperatorio IFN puede revertir la acumulación de gMDSCs en el bazo de los ratones después de la vacunación y la cirugía (fig S5). Tras un examen más, encontramos que la terapia de IFN preoperatoria no disminuye la expansión de gMDSC en ratones en comparación con ratones vacunados sometidos a cirugía. Además, muestran que la expresión de la superficie celular de la gMDSC /marcadores de maduración de activación CD80 /CD86 no se alteran después de IFN preoperatoria lo que sugiere que el tratamiento con IFN no afecta directamente a la composición y la función gMDSC en el bazo.
B6 ratones fueron desafiados con B16F10lacZ tumores, recibido vacunación AdDCT (día 7) y después se sometió a una cirugía como se describe anteriormente. En el día 8, los ratones se sacrificaron y se sometieron a esplénica MDSC se aislaron para la enumeración y ensayos funcionales. Porcentaje de (a) granulocítica MDSC, (b) MDSC monocítica y células (c) T reguladoras. Porcentaje de DCT-específica (d) IFN
+ y (e) TNFa
+ CD8
+ células T de control de ratones vacunados o que reaccionan con DCT
180-188 exposición péptido siguientes 4 días de cultivo con el control o quirúrgicamente subrayado MDSC. N = 4-6 /grupo. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001).
Discusión
La resección quirúrgica es la base del tratamiento de los tumores malignos más sólidos, pero a pesar de la resección completa, muchos pacientes albergan MRD y finalmente mueren de una recurrencia [28]. vacunas contra el cáncer son los más adecuados para erradicar MRD [22, 23, 29], proporcionando una sólida justificación para combinar la cirugía y la inmunoterapia en los ensayos clínicos sobre el cáncer. Sin embargo, un ensayo clínico diseñado lógicamente de la vacunación con cáncer debe tener en cuenta el efecto del estrés quirúrgico en las respuestas de células T específicas de TAA y los mecanismos responsables de la misma.
En el presente estudio, hemos demostrado que el transitorio, pero