Extracto
Antecedentes
El cáncer de tiroides es la endocrina más común cáncer relacionado con el aumento de la incidencia durante los últimos cinco años. Los tratamientos actuales para el cáncer de tiroides, como la cirugía o la terapia con yodo radiactivo, a menudo requieren que los pacientes estar en terapia de reemplazo de hormona tiroidea de por vida y dadas las importantes tasas de recurrencia de cáncer de tiroides, se necesitan nuevas modalidades preventivas. El presente estudio investiga la propiedad de un compuesto alimenticio natural que se encuentra en los vegetales crucíferos, 3,3, diindolylmetano (DIM), para dirigir el fenotipo metastásico de células de cáncer de tiroides a través de un receptor de estrógeno funcional.
Metodología /Principales hallazgos
líneas celulares de cáncer de tiroides fueron tratadas con estrógenos y /o DIM y se sometieron a
in vitro
adhesión, migración y la invasión ensayos para investigar los efectos anti-metastásicos y anti-estrogénicos de DIM. Hemos observado que DIM inhibe mediada por aumento de estrógenos en la migración de células de la tiroides, la adherencia y la invasión, que también está apoyado por estudios ER-α downregulation (siRNA). Western blot y análisis previstos zimografía evidencia directa para este DIM mediada por la inhibición de E
2 metástasis asociada eventos mejoradas en virtud de la orientación enzimas proteolíticas esenciales, a saber, MMP-2 y MMP-9.
Conclusión /Importancia
Nuestros informes de datos para la primera vez que el DIM muestra anti-estrogénica como la actividad mediante la inhibición de la proliferación de células de cáncer de tiroides mejorado estradiol y
in vitro
eventos asociados metástasis, es decir, adhesión, migración e invasión. Más significativamente, la MMP-2 y MMP-9, que son conocidos para promover y mejorar la metástasis, se determinó que eran objetivos de DIM. Este anti-estrógeno como la propiedad de la DIM puede conducir al desarrollo de un suplemento dietético preventivo y /o terapéutico para los pacientes con cáncer de tiroides por la orientación progresión de la enfermedad
Visto:. Rajoria S, R Suriano, George A , Shanmugam A, Schantz SP, Geliebter J, et al. (2011) El estrógeno inducida metastásico moduladores de MMP-2 y MMP-9 son blanco de 3,3 'Diindolilmetano en el cáncer de tiroides. PLoS ONE 6 (1): e15879. doi: 10.1371 /journal.pone.0015879
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Octubre 2010; Aceptado: 25 Noviembre 2010; Publicado: 18 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Rajoria et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer y la financiación 1R01CA131946 clínica desde el New York Eye and Ear Infirmary, Nueva York, Nueva York. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las incidencias de enfermedades proliferativas de la tiroides (TPD), incluyendo el cáncer de tiroides y bocio, son cada vez mayores con cáncer de tiroides es la más común entre los cánceres endocrinos [1], [2]. Estadísticas recientes revelan 37.000 nuevos casos fueron diagnosticados en los EE.UU. en 2009 y en todo el mundo casi 27 millones de pacientes se ven afectados [2]. Los cánceres de tiroides papilar y folicular bien diferenciadas variantes representan más del 90% de todos los cánceres de tiroides son invasivos y & amp; metastásico [3]. Los tratamientos actuales para TPD incluyen cirugía implica la eliminación completa o parcial de la glándula tiroides, el yodo radioactivo (I
131), la terapia, la quimioterapia o la combinación de todos [4]. Estos tratamientos requieren con frecuencia los pacientes a tomar hormonas tiroideas de reemplazo de toda la vida [4], [5], con la tasa de recurrencia siendo inaceptablemente alta, alcanzando casi el 20-30% [5], [6]. En los últimos años, la tasa de recurrencia y la falta de respuesta a los tratamientos convencionales de la tiroides ha aumentado lo cual justifica la investigación de nuevas medidas preventivas y terapéuticas que utilizan preferentemente compuestos naturales presentes en la dieta.
Dieta siempre ha sido de gran importancia en su asociación con el desarrollo del cáncer y la prevención [7] - [9]. Con respecto a la prevención del cáncer, varios estudios han encontrado una asociación inversa del riesgo de cáncer con el consumo de productos dietéticos, como el tomate, la soja y verduras crucíferas [7] - [10]. En particular, las verduras crucíferas como el brócoli, la col rizada, coliflor y repollo han sido aceptados por varias organizaciones, entre ellas el Instituto de Cáncer Federal de Drogas y la Administración Nacional, para tener un efecto preventivo contra el desarrollo de tumores, especialmente en los tejidos que responden a los estrógenos [7], [8 ]. Las verduras crucíferas contienen varios fitoquímicos incluyendo el indol-3-carbinol (I3C), que es un agente quimiopreventivo oral eficaz contra los cánceres de mama y de próstata [11] - [13]. I3C convierte espontáneamente a su producto dimérico, 3,3'-diindolylmethane (DIM) a un pH bajo [11] - [14]. DIM es un compuesto estable y una evaluación de seguridad revela que la administración a largo plazo de la DIM (hasta 12 meses) en ratones no dio lugar a ninguna renal manifiesta, cardio o toxicidad gastrointestinal [15]. Esto sugiere que el DIM puede ser un compuesto bioactivo naturalmente disponible prometedor que puede ser utilizado como un agente anticancerígeno, ya que proporciona una respuesta más segura y predecible.
Actualmente, el mecanismo celular y bioquímico preciso por el cual DIM ejerce sus efectos anticancerígenos queda por aclarado completamente, pero sobre la base de la literatura disponible, DIM interfiere con diversas vías de transducción de señales. En los cánceres de mama y próstata, DIM se ha observado para inducir la apoptosis dependiente de la dosis mediante la inhibición de AKT quinasa y la fosforilación de I? B? IKK mediada, lo que conduce a la inactivación de AKT y translocación de NFKB en el núcleo, lo que resulta en una disminución de crecimiento celular y la proliferación [16] , [17]. Además, se ha informado de que el DIM ejerce sus efectos quimiopreventivos en el cáncer dependientes de hormonas como el de mama por la regulación positiva de p21
de WAFI /CIP1 y la activación de la vía de JNK [18]. Interesantemente, un objetivo potencial de la actividad del DIM es metabolismo de los estrógenos. Dalessandri et al. ha demostrado que el DIM aumenta los niveles de 2-hydroxyestrones en mujeres posmenopáusicas con antecedentes de cáncer de mama que resulta en un aumento global de 2-hydroxyestrones a 16a-hydroxyestrone ratio [19] favoreciendo así las condiciones antiproliferativos. Smith et al. han demostrado que DIM, junto con un fitoestrógeno, genisteína puede modular el metabolismo de estrógenos hacia 2-hidroxilación en células de cáncer de próstata sensibles a los estrógenos [20]. Recientemente, también hemos descubierto en nuestro laboratorio que DIM puede modular el metabolismo de los estrógenos en pacientes con TPD resulta en un aumento en la proporción de 2-hydroxyestrones a 16a-hydroxyestrone (datos no publicados) lo que sugiere el uso de compuestos de la dieta, tales como DIM, en prevención de TPD.
en base a toda la información disponible y discutido en la literatura, este estudio fue diseñado para definir el mecanismo (s) responsable de los efectos anticancerígenos del DIM en el cáncer de tiroides. Nos informan de que DIM puede tener efectos terapéuticos, al actuar como un agente quimio-preventivo que posee propiedades anti-estrogénicos en células de la tiroides en virtud de la regulación negativa de estrógeno inducida fenotipos celulares de adhesión, invasión y migración. Nuestros datos indican que el anti-estrógeno como la propiedad de DIM se atribuye a la orientación de la expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMPs), que son proteasas esenciales implicados en la adhesión, invasión y migración de las células cancerosas. Por otra parte, el hecho de que las MMP están bajo la regulación transcripcional del elemento de respuesta a estrógenos (ERE) se presta más credibilidad que el DIM posee propiedades anti-estrogénicos.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
cuatro líneas de células de la tiroides se utilizaron en este estudio, BCPAP (línea celular de cáncer papilar de tiroides humano), 8505C (línea celular de cáncer papilar de tiroides humano), CGTHW-1 (línea celular de cáncer folicular de tiroides humano) y ML-1 (humana cáncer folicular de tiroides). BCPAP, 8505C y CGTHW-1 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Mediatech, Herndon, VA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Atlanta Biológicos, Atlanta, GA), penicilina 10.000 IU /ml, estreptomicina a 10.000 g /ml (Mediatech) y 2 mM L-glutamina (Mediatech) mL-1 se cultivó en DMEM (Mediatech) suplementado con 10% FBS, penicilina 10.000 UI /ml, estreptomicina 10 000 g /L-glutamina ml y 2 mM. BCPAP, 8505C, líneas CGTHW-1 y ML-1 de células se obtuvieron de DSMZ, Braunschweig, Alemania. MCF-7 (línea celular de cáncer de mama humano) se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS, penicilina, estreptomicina, insulina y L-glutamina.
análisis de transferencia de Western
las células se recogieron usando tripsina al 0,25% (Mediatech), se lavó con PBS, y se lisaron (1 × 10
6/100 l de tampón de lisis) usando el ensayo de radioinmunoprecipitación tampón (RIPA) [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio 0,2%, 0,1% SDS, 0,5% NP40, 1 mM Pefabloc] y se incubaron en hielo durante 30 minutos con agitación intermitente. Los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 30 min a 4 ° C y se recogió el sobrenadante. Los lisados celulares (20 mg de proteína) se sometieron a 12% SDS-PAGE en condiciones reductoras (presencia de β-mercaptoetanol) como se describe anteriormente [21], [22]. Brevemente, las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon-P a 220 mA durante 2 h y las membranas se bloquearon con 4% de leche seca en TBST [200 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, y 0,01% de Tween-20 añaden fresco /litro de 1 x TBS (TBST)] durante al menos 2 a 3 h en un agitador a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C, ya sea con ER-α (Abcam, Cambridge, MA), ER-β (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) anticuerpo o actina (Santa Cruz Biotechnology) en TBST. Las membranas se lavaron tres veces con TBST y se incubaron con el respectivo peroxidasa de rábano picante (HRP) anticuerpo secundario conjugado, durante 2 horas a temperatura ambiente en TBST que contiene 2% de leche. Después de cuatro lavados con TBS-T y un lavado con TBS, las membranas fueron desarrolladas por ECL sustrato (Pierce Rockford, IL) y se detectaron en películas de autorradiografía Denville.Ver.
XTT ensayo de proliferación celular
Dos mil células en 200 l de medio se sembraron en cada pocillo de placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche para permitir la adherencia celular. El medio se retiró y 3,3'-diindolylmethane (DIM), proporcionado amablemente por el Dr. Michael Zeligs (BioResponse, Boulder, Colorado) se añadió a concentraciones de o bien 10, 25, 50, 75, 100, o 500 mM en una volumen total de 200 l y se incubaron durante 24 h. Los medios de comunicación se desecharon y se añadió medio de crecimiento fresco sin DIM seguido de la adición de 50 l XTT [1 mg /ml en RPMI libre de suero + metosulfato de fenazina (25 nM)]. Después de 4 horas de incubación, la OD fue tomada en un lector de microplacas a 450 nm y de referencia a 630 nm. Los valores medios de la DO se calcularon para cada dosis en los puntos de tiempo respectivos y el porcentaje de supervivencia en función del tiempo y la dosis se utilizó para comparar los grupos experimentales y de control.
Ensayo clonogénico
Para determinar el efecto del DIM en el, BCPAP, 8505C, células CGTHW-1 y ML-1 clonogenicidad se sembraron en placas de seis pocillos (200 células por pocillo). Las células se dejaron adherir durante la noche después de lo cual los medios de comunicación que contienen frescos ± 10
-8 M E
2 ± 50 se añade o se deja sin tratar M DIM. Después de 21 días en cultivo, las células fueron fijadas y teñidas usando 0,025% Coomassie R250 azul brillante (en 50% de metanol y ácido acético al 10%) para visualizar las colonias de células. Las colonias se contaron, y se determinó el porcentaje de inhibición de clonogenicidad en las células tratadas.
ensayo de migración Transwell
BD Biocoat Control de Inserción (BD Biosciences, Bedford, MA) con una membrana de poros de 8 micras filtros se utilizaron para el ensayo de migración, como se describe anteriormente [21], [23]. Brevemente, se mueren de inanición las células durante 18 horas usando medio de inanición [fenol medio libre de rojo suplementado con 10% de carbón despojado FBS (Sigma Chemical Co.) y penicilina (10.000 IU /ml)]. Las células fueron cosechadas por tripsinización y 2,5 × 10
4 células fueron sembradas en la cámara superior en 500 l de medio que contenía FBS al 1% ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 M DIM. La cámara inferior contenía 750 l de medio suplementado con 5% de FBS. Después de 18 horas de incubación, las células no migran se retiran de la superficie superior de la membrana mediante lavado suavemente con punta de algodón hisopo. Las células en la superficie inferior de la membrana fueron fijadas con metanol y se tiñeron usando 1% de azul de toluidina al 1% mancha bórax seguido de dos lavados con agua destilada. Los insertos se dejaron airdry y se contaron en 10 veces de campo. Los datos se expresan como número de células migradas por 10 veces micrografía de campo para cada pocillo de muestra y se normalizaron a los recuentos de células obtenidas a partir de los controles no tratados.
arañazos Wound Ensayo
capacidad migratoria de BCPAP, 8505C, CGTHW células -1 y ML-1 también se evaluó mediante un ensayo de cero herida. 5 × 10
5 células se sembraron en una placa de seis pocillos y se dejó a adherirse y crecer a 60-70% monocapas de células confluentes. Posteriormente, tres heridas verticales fueron causadas por pocillo usando una punta de pipeta estéril 2,5 l seguido de la eliminación de cualquier residuo celular y células desprendidas. A continuación, la monocapa de células heridos se incubó en medio completo fresco con o sin 25 y 50 mM DIM y estradiol. Una línea horizontal se hizo para permitir la visualización de las células en el mismo punto. Las células se inspeccionaron cada tres horas hasta que las células de rascar para el control estaban completamente migran desde un extremo de la herida a otro, lo que fue de 24 horas para BCPAP, 8505C y CGTHW-1 y 48 horas para ML-1. Fotos fueron tomadas justo por encima y por debajo de la marca horizontal usando un microscopio de luz a 5X.
Adhesión Celular ensayo
Se recogieron las células, 8505C, BCPAP CGTHW-1 y ML-1 como se describe y se sembraron a una densidad de 5 × 10
5 células por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos en medios suplementados con ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 M o DIM se deja sin tratamiento y se dejaron adherir durante 2 horas. Después de los puntos de tiempo indicados, medio con las células no adheridas se desechó y los pocillos se lavaron suavemente dos veces con PBS para eliminar cualquier célula poco adheridas. Las células adherentes se rasparon y se contaron usando 0,4% de solución de azul de tripano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). El número de células adherentes se contaron usando un hemocitómetro y el efecto de DIM sobre la adhesión celular se expresó como porcentaje de disminución en el recuento de células adherentes para las células tratadas con respecto a las células control DIM.
ensayo de invasión
ensayo de invasión se realizó como se describe anteriormente [21] utilizando el factor de crecimiento BD Biocoat reducido cámaras de invasión de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) con filtros de membrana de poro de 8 micras, que se recubrieron con matrigel. El protocolo fue esencialmente el mismo que el ensayo de migración de la excepción de que el factor de crecimiento cámaras de invasión de Matrigel reducido se rehidrataron durante 2 horas utilizando suero libre de medios RPMI a 37 ° C antes de las células de carga en los insertos. Una vez rehidratada, 2,5 × 10
4 células se volvieron a suspender en el RPMI (500 l) que contiene 1% de FBS con ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 M DIM y se transfirieron cuidadosamente sobre la superficie superior de los filtros en la cámara. Las células se dejaron para invadir durante 18 horas después de lo cual las células se tiñeron y se contaron de manera similar como se describe para el ensayo de migración. invasión porcentual se calcula con base en el porcentaje de células que invaden a través del factor de crecimiento reducido cámaras de invasión de Matrigel con relación a las células que migran a través de la membrana de control.
MMP detección
Las células tiroideas se sembraron a una densidad de 5 × 10
5 células por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos y se dejaron adherir durante la noche tras lo cual fueron luego cambiados a medio libre de suero y se incubaron con ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 M DIM o dejadas sin tratamiento durante 24 horas. Se recogió el medio acondicionado, se centrifugó para eliminar los residuos, y las alícuotas se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis por MMP-2 y la secreción de MMP-9 y la actividad como se describió anteriormente [24], [25]. Brevemente, se determinó la concentración de proteína total del medio acondicionado utilizando el colorante de ensayo de proteínas Bio-Rad y las proteínas iguales se utilizaron para cada experimento. Para zimografía de gelatina, geles de SDS-PAGE se copolimerizados con 0,1% de gelatina (Sigma Chemical Co.) y 1 g de proteína se resolvió en condiciones no reductoras. Después de la electroforesis, los geles se lavaron dos veces en tampón de renaturalización (2,5% Triton X-100 en agua destilada) durante 1 h en un agitador orbital. Los zimogramas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de 36 horas a 37 ° C en tampón de zimografía (mM CaCl 5
2, NaN 0,2 mM
3 y 1 mM ZnCl 2 en Tris- mM
50 HCl) con tampón cambia cada 12 horas. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie (tinción de G-250, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se destiñeron con metanol al 10% y ácido acético 7,5%. El análisis de transferencia Western se realizó usando medio condicionado de células de cáncer de tiroides (concentraciones iguales de proteína) como se describe en la sección anterior usando MMP-2 y MMP-9 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA) anticuerpos. Para la inhibición de MMP, se utilizó en general MMP inhibidor de 1,10 fenantrolina (Sigma Chemical Co.). 2,5 × 10
4 células se volvieron a suspender en el RPMI (500 l) que contiene 1% de FBS con ± 10
-8 ME
2 ± 20 M 1,10 fenantrolina ± 25 M DIM y se sembraron en BD Biocoat Las inserciones de control para la migración y matrigel recubiertos insertos para la invasión como se describe en las secciones anteriores.
condiciones de transfección siRNA y
para silenciar los estudios de receptores de estrógeno, ER-α pequeños ARN de interferencia (siRNA) y siRNA transfección reactivo (DharmaFECT1) se obtuvieron de Dharmacon (Dharmacon, Inc., Lafayette, CO). células BCPAP y MCF-7 se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Las células fueron transfectadas durante 48 horas, y se recogieron las células y se sembraron posteriormente trasfected en BD Biocoat Control de Inserción (migración) y los insertos recubiertos con Matrigel (invasión) en medios que contenían 1% de FBS ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 M DIM. las células del cáncer de tiroides-no transfectadas tratadas con ± 10
-8 M E
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 M DIM se utilizaron como controles positivos apropiados. Se llevaron a cabo los estudios de migración y la invasión como se describe en las secciones anteriores.
cálculo estadístico
Los experimentos presentados aquí representan tres repeticiones, con significación estadística determinaron utilizando un emparejado
t de Student
con una probabilidad ( '
p de búsqueda:' valor) ≤0.05 utiliza para rechazar la hipótesis nula.
resultados
las células tiroideas expresan el receptor de estrógeno
la tiroides es no conocida para actuar como un tejido sensible estrógeno tradicional como el de mama. Con el fin de determinar el estado de los receptores de estrógenos en las células de la tiroides, se utilizó cuatro líneas de células de tiroides como nuestros modelos de cultivo celular. BCPAP y 8505C son líneas celulares de cáncer de tiroides papilar humanos, CGTHW-1 y ML-1 son líneas celulares de cáncer de tiroides folicular humanos. Se observó que todas las líneas celulares ensayadas expresaron la tiroides ambas isoformas de receptor de estrógeno (ER), ER-α y ER-β (Fig. 1) a niveles comparables. MCF-7, una línea celular de cáncer de mama ER clásico que expresa, se utilizó como control positivo para la detección de ambas formas polimórficas de RE (ER-α y ER-β).
proteína de la célula entera (20 g) se resolvió por SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia de Western para ER-α (dilución 1:500), ER-β (dilución 1:1000) y actina (dilución 1:5000). Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 y ML-1) expresan tanto ER-α y ER-β a niveles comparables.
DIM tiene propiedades anti-proliferativa efecto sobre células de la tiroides
DIM, se ha observado un compuesto natural de los vegetales crucíferos que tienen propiedades anti-proliferativas contra varios tipos de cáncer de la hormona de respuesta [14], [16] - [18]. Hemos querido evaluar el efecto de la DIM en la actividad proliferativa de cáncer de tiroides y con el fin de hacer 1. Todas las líneas celulares así, un ensayo XTT se realizó y los resultados se muestran en la Tabla (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 y ML -1) utilizado en este estudio fueron tratados con varias concentraciones de DIM durante 24 horas. Se observó una inhibición dependiente de la dosis en la viabilidad celular con un 50% de inhibición a una concentración de aproximadamente 50 mM DIM durante 24 h de tratamiento en las cuatro líneas celulares, BCPAP, 8505C, CGTHW-1 y ML-1. Basándose en estas observaciones (Tabla 1), se utilizó el 25 mM concentración DIM para caracterizar mejor los efectos de la DIM en las células tiroideas, tanto a nivel molecular y fenotípica.
DIM inhibe la capacidad clonogénico de tiroides células
Una de las propiedades característicos de las células cancerosas es la capacidad de dividirse en condiciones aisladas utilizando paracrina mínimo y posiblemente más factores autocrinos [26]. El efecto contra el cáncer de DIM en la capacidad de BCPAP, 8505C, células CGTHW-1 y ML-1 a dividirse indefinidamente se evaluó por un ensayo de supervivencia de células clonogénicas. Dos cientos de células por pocillo en placas de seis pocillos se trataron con 50 mM DIM estradiol ± durante 21 días. Como se muestra en la Tabla 2, las células de la tiroides no tratados tienen la capacidad de formar clones mientras que el tratamiento con estrógenos resultó en aumento de aproximadamente 8 (8505C) -33% (ML-1) en la formación de clon en función de las líneas celulares. DIM formación clon completamente abrogada de todas las líneas celulares con independencia de que fueron tratados con estradiol. Estos experimentos establecen la capacidad de respuesta diferencial de las diferentes células del cáncer de tiroides para el estradiol y la actividad anti-estrogénica de DIM.
DIM reduce la capacidad migratoria de las células tiroideas
Las células tumorales tienen una mejorada capacidad de migrar en el tejido vecino y ciertos agentes tales como estradiol se han observado para ayudar en este proceso de migración. Los agentes terapéuticos que pueden disminuir la capacidad de estas células para migrar puede reducir presumiblemente eficazmente el riesgo de metástasis. Hemos demostrado previamente que las células tiroideas tienen la capacidad de aumentar la migración en respuesta a los estrógenos [21] y para determinar si DIM puede afectar el potencial migratorio de estas células,
in vitro se realizaron ensayos de migración
. células de la tiroides de hambre fueron sembradas en una cámara de migración transwell con estradiol ± fulvestrant o ± 25 M DIM y se dejaron migrar. Hemos observado que las células tiroideas eran capaces de migrar y esta capacidad de migrar se mejoró cuando las células fueron tratadas con E
2 (barras grises) en comparación con las células no tratadas con 30% de aumento en la migración de BCPAP, el 50% de 8505C, 89% para CGTHW-1 y el 63% para ML-1 (Fig. 2A). Este aumento en la migración celular fue abrogada cuando se utilizó fulvestrant junto con estradiol [barras de puntos) lo que sugiere que la capacidad migratoria de estas células de la tiroides está influenciada por el estrógeno y un antagonista de los receptores de estrógenos ha abrogado la migración de estas células. DIM (25 M) disminuyó de manera significativa la migración de células de la tiroides (barras negras). Esta disminución se observó en aproximadamente 37-57% y fue la línea celular dependiente. Por otra parte, la adición de estradiol junto con 25 mM DIM (barras rayadas) no mejoró la capacidad migratoria de las células tiroideas, lo que significa el antiestrógeno como la capacidad de la DIM.
(A) de 2,5 × 10
4 células se resuspendieron en 500 l de RPMI con FBS al 1% ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 M DIM y sembradas en la cámara superior del BD Biocoat control de Inserción (8- micras de poro filtros de membrana). 750 l de RPMI que contiene FBS al 5% se añadió a la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de 18 horas, se fijaron las células que migraron, se tiñeron y se contaron bajo el objetivo de 10X. Los grupos son los siguientes-tratadas (barras blancas), E
2 tratadas (barras grises), E
2 + fulvestrant (barras punteadas), 25 mM DIM (barras negras) y E
2 25 M DIM tratadas (barras rayadas). Los datos se expresan como el número de células contadas (células migradas) para cada muestra y se normalizaron para el número de células obtenida a partir del control no tratado. El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas (
p Hotel & lt; 0,05) entre las muestras indicadas. ensayo de la herida cero para BCPAP (B) y CGTHW-1 (C). 5 × 10
5 células se sembraron y se dejaron crecer a monocapas confluentes semi después de lo cual se creó una "herida vertical" y las células se dejaron migrar en presencia de cualquiera de 25 mM o 50 mM DIM. Las células se visualizaron bajo 5X cada tres horas y documentación fotográfica fue tomada a las 18 horas cuando las células migran completamente desde un extremo de 'cero' al otro extremo en los controles no tratados.
A fin de validar el efecto de DIM de la capacidad migratoria de células de la tiroides, se realizó un ensayo cero herida, que es un
in vivo
representación parcial del fenotipo metastásico [27]. Las células tiroideas (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 y ML-1) fueron cultivadas en una monocapa confluente 60-70%, seguido por la formación de arañazos y la posterior incubación con ± DIM. Se encontró que el DIM causó una disminución en la migración celular en un 50-60% (como se observa visualmente) de una manera dependiente de la dosis en células de la tiroides [BCPAP (Fig. 2B) y CGTHW-1 (Fig. 2C)]. Se observaron resultados similares con 8505C y ML-1 (datos no presentados). También hemos observado anteriormente que el estradiol aumenta la migración y esta migración fue inhibida por el fulvestrant, similar a los resultados del ensayo cero herida obtenidos en este estudio utilizando DIM [21].
DIM disminuye la capacidad de adhesión de las células tiroideas
con el fin de hacer metástasis con éxito, las células tumorales tienen que adherirse a la matriz extracelular (ECM) de órganos secundarios [26], [28]. Se evaluó el efecto de DIM en la adhesión de células de la tiroides mediante la realización de un ensayo de adhesión. Se dejó que las células de la tiroides a adherirse en presencia de 10
-8 ME
± 10
-6 fulvestrant M (un antagonista de receptor de estrógeno clásica) ± 25 M DIM durante 2 horas y% de adhesión se calculó 2 o (Fig. 3). Se observó un aumento en la adhesión cuando las células fueron tratadas con E
2 (barras grises), que se suprime con fulvestrant (barras de puntos) lo que sugiere que la adherencia es un fenotipo activo en células de la tiroides, posiblemente, que requieren la actividad de ER funcional. Curiosamente, se observó una disminución significativa en la adhesión cuando las células se trataron con 25 mM DIM (barras negras), con una disminución de 58% en la adhesión para BCPAP, 42% para 8505C, 70% para CGTHW-1 y 45% para ML-1 . La combinación de estradiol y 25 mM DIM (barras rayadas) no pudo mejorar la adhesión de células de la tiroides, lo que sugiere que el DIM puede evitar la adhesión mejorada de estrógenos y, potencialmente, puede actuar como un anti-estrógeno agente eficaz /metastásica, como la disminución de la adhesión celular por DIM es similar a la disminución de la adhesión observada con el fulvestrant antagonista del receptor de estrógeno.
5 × 10
5 células se suspendieron en medio completo que contenía 10 ±
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 M DIM y se sembraron en placas de cultivo de 6 así. Después de 2 horas se eliminaron las células adheridas viables mediante raspado y se contaron por el azul de tripano. Los grupos son los siguientes-tratadas (barras blancas), E
2 tratadas (barras grises), E
2 + fulvestrant (barras punteadas), 25 mM DIM (barras negras), y E
2 + 25 M DIM tratadas (barras rayadas). Los datos se expresan como% adherido las células en comparación con las células no tratadas que se fijaron a 100% de adhesión. asterisco denota única diferencia estadísticamente significativa (
p Hotel & lt; 0,05). entre las muestras indicadas
DIM inhibe la invasión de las células tiroideas
La formación de focos metastásicos secundaria por las células tumorales requiere la invasión de la ECM de órganos secundarios [26] y la inhibición de esta invasión es una estrategia en la terapia del cáncer que ha sido ampliamente investigada. El efecto de DIM en el potencial invasivo de BCPAP, 8505C, CGTHW-1 y ML-1 se ensayó mediante el uso de una cámara transwell invasión recubierta con una matriz biológica
in vitro
(matrigel). Las células tiroideas se cargaron en una cámara transwell con estradiol ± fulvestrant o ± 25 M DIM y se les permitió invadir a través de la matrigel. Hemos observado que las células tiroideas eran capaces de invadir a través de Matrigel y la invasión por estas células fue mayor cuando las células fueron tratadas con E
2 (barras grises) con un aumento de 40% en la invasión para BCPAP, 36% para 8505C, 30% para CGTHW-1 y el 31% para ML-1 (Fig. 4). Este aumento en la invasión de células fue abrogada cuando se utilizó en combinación con fulvestrant de estradiol (barras de puntos) lo que sugiere que un antagonista de receptor de estrógeno puede bloquear la propensión invasivo de las células de la tiroides. Para evaluar el efecto de la DIM en la invasión de las células tiroideas, todas las líneas de células fueron tratadas con 25 mM DIM (barras negras) y un descenso significativo (
p Hotel & lt; 0,05) en la invasión se observó. Esta disminución de la invasión fue de aproximadamente 52% para BCPAP, 50% para 8505C, 80% para CGTHW-1 y 48% para ML-1 en comparación con las células control (normalizados a 100% y
p
& lt; 0,05 ). Por otra parte, el estradiol pro-proliferativa, en combinación con DIM (barras rayadas), no mejoró la capacidad invasiva de las células tiroideas. Estos datos sugieren que el DIM abroga el estrógeno mejora los procesos celulares de la invasión por tanto, posiblemente a un paso importante en la progresión tumoral y la metástasis.
2.5 × 10
4 células resuspendidas en 500 l de medio que contenía FBS al 1% ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 M DIM se sembraron en la cámara superior del factor de crecimiento reducido matrigel cámaras de invasión. 750 l de medio de crecimiento que contiene 5% de FBS se utilizó como quimioatrayente en la cámara inferior. invasión porcentual se calcula con base en el número de células invasoras través de las cámaras en relación con las células que migran a través de membrana de control después de 18 horas. Los grupos son los siguientes-tratadas (barras blancas), E
2 tratadas (barras grises), E
2 e ICI (barras punteadas), 25 mM DIM (barras negras) y E
2 & amp; 25 M DIM tratadas (barras rayadas). Los datos se representan como% invasión que es el número medio de células invadidas por 10X micrografía de campo para cada pocillo de muestra en relación con la migración a través de la membrana de control y normalizado con el control sin tratar. El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas (
p Hotel & lt; 0,05). Entre las muestras indicadas
DIM suprime la secreción de estrógeno inducida por MMP
Las MMP son fiables los marcadores de tumor la invasión celular y la migración. Por otra parte, se sabe que los tumores malignos que han aumentado las expresiones de MMP en comparación con los tumores benignos, que causa la degradación de la matriz extracelular, lo que resulta en aumento de la invasión y la migración de las células tumorales [29], [30]. Los fitoquímicos tales como la genisteína y la I3C han demostrado que el objetivo de la actividad y la secreción de las MMP en los cánceres estrógeno sensibles [31]. Actina se utilizó como control de carga.