Extracto
Antecedentes
A pesar de la baja incidencia, el cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer y tiene la tasa de mortalidad más alta de todos los tumores malignos ginecológicos en las mujeres estadounidenses. La tasa de mortalidad se reduce con un marcador de detección temprana. La alfa receptor de folato (FRα) es una elección lógica para un biomarcador debido a su sobreexpresión frecuente en el cáncer de ovario y su expresión exclusiva en sólo unos pocos tejidos normales. En un trabajo anterior, se observó que los pacientes con cáncer de ovario presentaban niveles elevados en suero de una proteína que enlaza a un anticuerpo monoclonal relativa FRα específica a individuos sanos. Sin embargo, no se demostró que la proteína detectada fue FRα funcionales intactas. En el estudio actual, el objetivo fue determinar si los pacientes con cáncer de ovario (n = 30) tenían niveles elevados en suero de un completo y funcional FRα intactos en comparación con los controles sanos (n = 30).
Metodología /Principales conclusiones niveles
FRα en suero fueron analizadas por dos métodos, análisis de inmunotransferencia y un ensayo fólico radiomarcado microfiltración a base de ácido vinculante. Usando el inmunoensayo, se observó que los niveles de FRα fueron más altos en el suero de pacientes con cáncer de ovario en comparación con los controles. Resultados similares se observaron también utilizando el ensayo de unión de microfiltración, que mostró que la FRα circulante es funcional. Es importante destacar que también se encontró que los niveles de FRα fueron comparables entre los pacientes tempranas y avanzadas de la etapa.
Conclusiones
Nuestros resultados demuestran que los pacientes con cáncer de ovario tienen niveles elevados de FRα intactas funcionales. Estos resultados apoyan el uso potencial de hacer circular FRα como un biomarcador de cáncer de ovario temprano
Visto:. Basal E, Eghbali-Fatourechi GZ, Kalli KR, Hartmann LC, Goodman KM, Goode EL, et al. (2009) El folato funcional del receptor alfa es elevada en la sangre de cáncer de ovario pacientes. PLoS ONE 4 (7): e6292. doi: 10.1371 /journal.pone.0006292
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 23, 2009; Aceptado: June 11, 2009; Publicado: 20 Julio 2009
Derechos de Autor © 2009 Basal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta subvención fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer, K01-CA100764 y R03-CA121386. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer y tiene la tasa más alta de mortalidad de todos los cánceres ginecológicos en las mujeres estadounidenses con un estimado de 21.650 nuevos casos y un anticipado y gt; 15.500 muertes en 2008 [1]. La mayoría de los pacientes con cáncer de ovario presentan con enfermedad avanzada (estadios III-IV) y tienen una supervivencia a 5 años de típicamente & lt; 30%. El hecho de que la supervivencia de los pacientes con enfermedad etapas I-II va desde 60% -90%, dependiendo del grado del tumor [1], [2] sugiere la posibilidad de una alta tasa de curación con la detección de la enfermedad antes. Dado que los síntomas físicos están ausentes en las primeras etapas de cáncer de ovario, se están realizando esfuerzos para desarrollar ensayos para biomarcadores de sangre o tejido.
A pesar de que el suero CA-125, una glicoproteína de superficie celular de ovario (es decir, una mucina) del desconocido importancia biológica, es elevada en & gt; 80% de los pacientes con cáncer de ovario epitelial avanzado, este marcador tiene un valor predictivo positivo de & lt; 10% en la enfermedad en estadio temprano [3]. Por otra parte, la CA-125 también está asociada con varias condiciones no malignas, como el embarazo, la endometriosis, adenomiosis, fibroides uterinos, enfermedad inflamatoria pélvica, la menstruación, y los quistes ováricos benignos. CA-125 también está asociada con otras enfermedades malignas como el de páncreas, mama, pulmón, gástrico, y cáncer de colon [4]. Aunque la CA-125 es útil en el seguimiento de la quimioterapia del paciente y en la detección de recidiva precoz en pacientes con cáncer de ovario ya conocidos, no es útil para identificar la enfermedad en estadio temprano [5].
El folato α del receptor (FRα), una molécula de 38-40 kDa, es un miembro bien caracterizado de la familia de receptores de folato (FR) con alta afinidad por los folatos. FRα está anclada a membranas celulares a través de un resto de glicosilfosfatidilinositol y transporta los folatos a través de un proceso endocítica [6]. FRα exhibe una distribución limitada del tejido normal, con la expresión mensurable restringido a las superficies apicales de unos pocos epitelios, predominantemente en el pulmón, el riñón, y el plexo coroideo, pero se sobreexpresa en un espectro de tumores sólidos, incluyendo cáncer de ovario, cáncer de pulmón de células no , cáncer de mama, cáncer de riñón y en el osteosarcoma de alto grado [7] - [10]. Esta sobreexpresión de alta afinidad FRα en algunos tipos de cáncer puede haber surgido para satisfacer las necesidades celulares para la síntesis de ADN y el crecimiento [11]
.
Además de su localización en la superficie celular, FRα puede también ser derramada en la sangre. Shedding se identificó inicialmente durante el desarrollo de los ensayos que utilizaron FR libre de células se purificó como una proteína de unión de unión de radioligando de folato. En estos estudios se observó que a menudo había una gran discrepancia en la valoración de folato sérico total cuando se ensaya después de la extracción de calor en comparación con el suero nativa [12]. Cuando cobertizo, FRα se unirá folato circulante, ya que la afinidad está en el intervalo nM. Ahora se entiende bien que derramamiento complica la interpretación de los ensayos de folato sérico y máscaras la presencia de receptor funcional a menos que se emplea un tratamiento con ácido para liberar el folato endógeno y permitir la saturación FRα con el ácido fólico radiomarcado posiblemente. Esta discrepancia en los niveles de ácido fólico entre suero nativa y calor extraído condujo a la identificación de circulación FRα en algunas muestras de sangre del cordón umbilical y en algunos de los suero materno [13]. Es importante destacar que, FRα libera de las células epiteliales normales no debe contribuir a los niveles FRα en el suero, ya que el receptor es invariablemente localiza en la superficie apical de un epitelio polarizado donde su derramamiento entregará el receptor libre en un lumen que drena de forma natural del cuerpo a través su propio orificio.
los estudios recientes sugieren que FRα también puede liberarse en la sangre de los tumores, que ofrece la oportunidad de acceder y medirla como marcador tumoral de cáncer en etapa temprana. La expresión predominante de FRα en cáncer de ovario, entre todas las etapas, ha estimulado el interés en su aplicación como un objetivo terapéutico y de biomarcadores [14]. El objetivo del presente estudio fue determinar si FRα funcional intacta se derramó en la circulación y para evaluar su potencial como biomarcador circulante. Este objetivo es apoyado por el trabajo previo que mostró que los pacientes con cáncer de ovario tienen elevados niveles de una proteína de suero que reaccionan con anticuerpos anti-FRα [15]. Lo que quedaba por responder era si los anticuerpos detectados toda FRα y si la proteína detectada fue un receptor de folato funcional (FR). Por lo tanto, en el presente estudio, los niveles circulantes de FRα en la sangre de pacientes con cáncer de ovario fueron examinados utilizando un ensayo de microfiltración
a base de 3H-FA que se desarrolló para detectar FRα funcional. Además, se empleó un ensayo de inmunotransferencia para confirmar la presencia de la proteína FRα conjunto específico. Como se verá, los pacientes con cáncer de ovario muestran niveles elevados de FRα en la circulación que apoyan su uso potencial como biomarcador de la enfermedad.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
El Mayo clínica IRB aprobó el estudio y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los sujetos.
los sujetos
Cada caso de cáncer de ovario se aparearon a un control femenino de extracción de sangre dentro de los 6 meses (todos los 30 casos emparejado con éxito), y luego la edad dentro de los 5 años. Veintinueve casos fueron emparejados con éxito. El caso fue igualado en 30 de extracción de sangre dentro de los 6 meses y 9 años de edad dentro de un control elegible. casos elegibles fueron pacientes, mayores de 20 años, con diagnóstico histológico de cáncer epitelial de ovario primario. Se recogió una muestra de sangre de 40 ml (pre-operatorio), procesa dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C como suero. La edad media (± SEM) de los emparejados por edad mujeres donantes sanos y pacientes fueron 61 ± 3 y 60,63 ± 3 años, respectivamente. Otras características del paciente y del tumor se presentan en la Tabla 1.
Material y reactivos
El ácido fólico se obtuvo de Alexis Bioquímicos. filtros de centrífuga (10.000 dalton de corte) se adquirieron de Millipore (Burlington, MA). ácido fólico tritiada [3,5,7,9-
3H] sal de sodio, (
3H-FA, 1 mCi /ml) se adquirió de American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, Missouri), y Ready segura cóctel de centelleo líquido era de Beckman Coulter. Los anticuerpos anti-FRα, MOv18 /ZEL y F5753 eran de Alexis Bioquímicos (San Diego, CA) y US Biological (Swampscott, MA), respectivamente.
Preparación de tumor lisados celulares y sobrenadantes de cultivos celulares como fuentes de FRα
células KB son células de carcinoma epidermoides nasofaríngeas humanas que expresan altos niveles de FRα [16] - [18]. células KB se cultivaron en medio que consiste en RPMI libre de folato 1640, suplementado con 55 mM 2-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina, piruvato 1 mM de sodio, tampón HEPES 10 mM, 100 IU /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. Los sobrenadantes se prepararon por centrifugación de medio acondicionado a 4 ° C para eliminar las células no ancladas. Partes alícuotas de sobrenadantes de 4 días se almacenaron a -80 ° C para ser utilizado como una fuente de células no FRα asociado. Los lisados celulares se prepararon a partir confluentes KB monocapas por los ciclos de congelación-descongelación, seguido de centrifugación para eliminar los residuos. Para ambos sobrenadantes y lisados de células, las concentraciones de proteína se determinaron mediante la densidad óptica. Se utilizaron células MCF-7 de cáncer de mama humano como control FRα-negativas y prepararon de forma similar a las células KB. Los lisados (5-10 mg de los lisados) y sobrenadantes (10-20 mu l) se utilizaron para el desarrollo del ensayo y como controles.
3H-fólico aceptor de ácido ensayo
Medición de folato receptores en los casos y los controles fue una variación de un método descrito previamente [19]. Las muestras (10 l) se cargaron en la cámara superior de un par de tubos de filtración y se diluyeron hasta 50 l total, con una solución de solubilización (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 25 mM
n
octilo -β-D-glucopiranósido, EDTA 5 mM, y azida de sodio 0,02%). Los tubos de filtración se centrifugaron y los filtros tratados con 30 mM de solución de acetato (pH 3,0) para eliminar endógeno FA seguido de centrifugación y dos lavados con la solución de solubilización. Luego pares de tubos de filtración se incubaron ya sea con un resfriado FA 1000X en una solución ligante (mM Na 10
2P
4, KH 1,8 mM
2 PO
4, NaCl 500 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4, y 25 mM
n-
octil-β-D-glucopiranósido) o con la solución de unión solamente, y las muestras se incubaron 2 horas a temperatura ambiente y después se centrifugaron. solución que contiene Encuadernación
3H-FA continuación se añadió a todas las muestras seguido de incubación durante la noche a 4 ° C con agitación suave. Los filtros se centrifugaron y se lavaron con PBS que contenía 50 mM
n
octil-β-D-glucopiranósido para eliminar el no unido
3H-FA. Bound
3H-FA retenida en los filtros se eliminó con 100 l de PBS que contiene 4% de Triton X-100 y se transfiere a un vial con cóctel de centelleo líquido, y la actividad se midió en un contador de centelleo Beckman LS6000IC. La unión específica se determina restando la actividad en presencia de un exceso de FA frío de la actividad de la misma muestra sin competencia FA.
inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia de FRα
FRα en el suero fue directamente medido utilizando el análisis de inmunotransferencia de los inmunoprecipitados. Las muestras de suero (100 l), los lisados (25 g KB o MCF-7) o sobrenadantes KB fueron pre-aclarado dos veces con Proteína G Sepharose y 5 g de cada uno de los anticuerpos monoclonales, MOv18 /ZEL y F5753, se añadieron a cada muestra y se incubaron durante 1 hora a 4 ° C. A continuación se añadieron proteína G Sepharose más perlas y la mezcla se dejó girar durante la noche a 4 ° C. Las perlas se recogieron con centrifugación y se lavaron con 600 l de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, Na 1
EGTA 2EDTA, 1 mM, 1% de Triton, y los inhibidores de la proteasa). Las perlas se decantaron y se hirvieron en tampón de Laemmli. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras seguido de transferencia. Las transferencias se sondearon con anticuerpos MOv18 /ZEL (5 g /ml en leche en polvo sin grasa al 2%, 0,1% de Tween 20 en TBS) seguido por secundario anti-ratón IgG peroxidasa de rábano picante (HRP) anticuerpo conjugado (1:5000 en 2% sin grasa de la leche seca en 0,1% de Tween 20), y desarrollado por un aumento de quimioluminiscencia con super señal West Pico Substrato quimioluminiscente durante 5 minutos (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Las transferencias se expusieron a las posiciones de la película y la banda de rayos X y banda densidades se calcularon utilizando un sistema de análisis de imagen por ordenador (sistemas UVP Biochem Imaging, Upland, CA).
Análisis estadístico
La los niveles medios de circulante FRα, detectado ya sea con la unión del ligando de ensayo o análisis de inmunotransferencia, entre los casos y los controles se compararon mediante la prueba de Wilcoxon acompañado pares. En algunos casos se utilizó un análisis de regresión lineal para examinar las correlaciones estadísticamente significativas. Las proporciones fueron probados mediante la prueba exacta de Fisher. En todos los casos, se utilizó una prueba de dos colas y un valor de p menor o igual a 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
Detección de FRα usando ensayos de unión de microfiltración y la inmunotransferencia
En los esfuerzos iniciales para medir los niveles circulantes de FRα por estudios de unión
3H-FA, se realizaron estudios preliminares para determinar los atributos del ensayo de filtración de microcentrífuga. muestras de sobrenadante de células KB se incubaron con cantidades crecientes de
3H-FA en ausencia y en presencia de exceso de FA frío y después se midió la recuperación de cota
3H-FA. Como se muestra en la Figura 1A, entre 10 y 120 nmol /L
3H-FA, la unión total aumentó de forma lineal. Cuando se añadió el exceso de FA frío, la cantidad unida se redujo a niveles de fondo. Las concentraciones FA calcula sobre esta gama de (10 a 120 nmol /L) fueron consistentes y ninguno de los valores fueron significativamente diferentes (no se muestra). Los resultados muestran que el ensayo es capaz de medir FRα en un amplio intervalo de concentraciones de FA
Panel A:. Diez alícuotas de KB sobrenadante del cultivo se diluyeron hasta 50 l con tampón que contenía concentraciones crecientes de unión
3H-FA pulsada, sin (cota total) o con 1000X fría FA. Después de la incubación, no unido FA se eliminó por microfiltración. Se muestran los CPM retenida por el microfiltro. También se muestra de fondo que es vinculante en ausencia de sobrenadantes KB y sin exceso de FA frío. * P & lt; 0,05. Cada punto de datos es la media (± SE) de 3 réplicas. La línea de inserción de puntos es la línea de regresión lineal del total unida presentados con los correspondientes valores de p y r. El panel B muestra que la cantidad de unión específica depende de los niveles de entrada. En este caso el aumento de cantidades de suero que contiene un pico de proteína KB fueron examinados. Este experimento es representativo de 2 experimentos diferentes. El panel C muestra la concentración FA que fue obligado, ya sea en sobrenadantes KB o una muestra de suero representante de un caso y control, comparando el 30 KD y 10 microfiltros de corte. El experimento es representativo de dos experimentos. El panel D muestra un ejemplo representativo de análisis de inmunotransferencia de FRα. Arrow = H
r proteína 38000; KD = kilodalton; IP = inmunoprecipitación. Carril 1, W del IP sin suero; carril 2, IP de KB lisado; carril 3, IP del suero con precleared KB pico lisado; 4. carril IP del suero solo, carril 5, KB lisado sin IP; carril 6, IP de KB lisado sin suero.
Con el fin de determinar la cantidad mínima requerida de suero, una muestra de suero control normal (100 l), se añadieron con lisado de células KB (5 mg) y diferentes volúmenes (0-40 mu L) se ensayaron para la unión
3H-FA. Como se muestra en un ejemplo experimento representativo en la Figura 1B, el ensayo podría detectar microfiltro FA de unión en un volumen tan poco como 10 l. Sin embargo por encima de 20 l de suero, se encontró que los microfiltros no siempre drenan fácilmente. Por lo tanto, se utilizó un volumen estándar de 10-20 l de casos y controles.
Aunque el trabajo previo había usado filtros de corte 30 KD para medir FRα en muestras de tejidos [19], existía la preocupación de que algunos desaparición puede han surgido como consecuencia de una variación en el tamaño de los poros, dando como resultado la presencia de algunos poros del filtro que permitan el paso de la 38 KDa FRα. Por lo tanto, las pruebas se realizaron comparando 30 KD y 10 KD filtros de corte. En general, hubo diferencias menores. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 1C, no había ninguna diferencia notable en el límite FA utilizando lisados de células KB de sobrenadantes KB. Por el contrario, pequeños aumentos se observaron consistentemente en muestras de suero utilizando los 10 filtros de corte KD. Por lo tanto, el punto de corte de 10 KD se utilizó para medir FRα en los sueros de casos y controles.
Con el fin de corroborar los resultados de microfiltración, se estableció un método de inmunoprecipitación e inmunotransferencia. Como se muestra en la Figura 1D, FRα puede ser inmunoprecipitada a partir de sueros (100 l) y a inmunotransferencia que resulta en la detección de la 38 KD FRα. En general, estos resultados muestran que el ensayo de la microfiltración se puede utilizar para detectar FRα en pequeñas muestras de suero. Además, el análisis de inmunotransferencia revela la presencia de FRα intacta de longitud total.
Los pacientes con cáncer de ovario no tratada han elevado los niveles medios de circulante FRα en comparación con los controles emparejados
de pacientes (es decir, los casos) son características detallado en la Tabla 1. los ensayos de unión microfiltro y inmunotransferencia revelaron que los sueros derivados de los casos contenía significativamente más altos niveles medios de FRα respecto a los controles (Figura 2A-C). análisis de regresión lineal de todas las mediciones de ambos casos y controles mostró que había una correlación significativa entre los resultados de los ensayos de microfiltración y de inmunoblot (Figura 2D). Para evaluar qué ensayo puede ser potencialmente más susceptibles al desarrollo como una prueba de biomarcadores, los puntos de corte se establecieron a partir de los valores del grupo de control para ambos ensayos utilizando la media y dos desviaciones estándar. Con esta estrategia, mayor que 95% de los valores de control cayó por debajo del punto de corte. Como se muestra en la Figura 3, el uso de esta estrategia, se consideraron 13% y el 27% de los casos a tener niveles elevados de FRα en los ensayos de microfiltración y de inmunotransferencia, respectivamente. El análisis estadístico usando la prueba exacta de Fisher mostró que la fracción de los casos con niveles elevados de FRα, tal como se detecta con el ensayo de inmunotransferencia, fue significativamente diferente de la fracción de controles considerados positivos. Por el contrario, la fracción de casos detectados con el ensayo de microfiltración no fue significativa, lo que sugiere que el ensayo de inmunotransferencia puede potencialmente tener un mejor valor predictivo positivo.
Panel A muestra el número de circulación de receptor de folato (FR) extrapolarse a partir de el ensayo de microfiltración suponiendo una relación molar 01:01 de FA:FR en los dos casos y controles emparejados el panel B muestra la señal densitométrico obtiene usando inmunotransferencia. Los valores de p en los grupos A y B se calcularon mediante la prueba de pares coincidentes de Wilcoxon y cada barra representa la media ± E.E.M. Panel C: Carril 1, control negativo inmunoprecipitación; carril 2, lisado de control negativo (MCF-7); carril 3, el control positivo (KB) lisado); carril 4, el control muestra de suero; carril 5, corresponde muestra de suero de cáncer de ovario; carril 6, control de muestra de suero; carril 7 corresponde muestra de suero de cáncer de ovario. Arrow = H
r proteína 38000; KD = kilodalton. Panel D muestra el análisis de regresión lineal la correlación de los datos de ensayo de unión de microfiltración y de los datos de inmunotransferencia. Cada punto de datos representa un individuo único. Los símbolos abiertos representan los controles sanos y los puntos negros son los pacientes.
Panel A y B muestran el porcentaje de casos y controles que fueron consideradas positivas por microfiltración o inmunotransferencia de ensayo, respectivamente, con los puntos de corte establecidos como la media más dos desviaciones estándar de los valores de control. El valor de p se calculó utilizando la prueba exacta de Fisher.
Los niveles de FRα circulantes son comparables entre la enfermedad temprana y avanzada
Hemos probado si había alguna correlación entre los niveles circulantes FRα y una variedad de características clínicas, así como la expresión FRα dentro del tumor. Se encontró que los niveles circulantes de FRα (como inmunotransferencia evaluado) fueron comparables entre los primeros (estadios I /II, n = 15, 16 ± 2 au) y estadio avanzado (estadios III /IV, n = 15, 12 ± 2 au, p = 0,24) de los pacientes como se muestra en las figuras 4A. Las diferencias en FRα que circula entre los primeros y los pacientes en etapa avanzada según la evaluación de los ensayos de unión tampoco fue significativa (1,4 ± 0,3 vs. 1,0 ± 0,2 p. & Lt; 0,2, Figura 4B). Es importante destacar que, los niveles de FRα en pacientes en fase inicial fueron significativamente mayores que todos los controles (n = 30, 7 ± 0,9 au, inmunotransferencia, p & lt; 0,0001 y 0,6 ± 0,1 nmoles de unión /l, p = 0,02).
los paneles A y B muestra la comparación entre las señales densitométricos etapa y de ensayo de microfiltración tempranas y tardías, respectivamente. Cada punto de datos representa un individuo único y la línea horizontal representa la media. valores p mostrados han sido calculados utilizando la prueba t de Student.
No se observaron correlaciones significativas entre circula FRα y, o bien la edad, grado, estado de recurrencia o extensión de la reducción de volumen (óptimo vs. subóptima) (p & gt ; 0,05). Los tumores de los 27 de 30 pacientes tenían una expresión de alto FRα, en consonancia con el trabajo previo, y por lo tanto, nuestro tamaño de la muestra no fue lo suficientemente grande como para determinar si el tumor expresión FRα se asoció con niveles de FRα en la sangre. Sin embargo, de los tres tumores (1 borderline seroso y 2 borderline mucinoso) con bajo FRα asociado a un tumor, solamente 1 borderline mucinoso demostró niveles bajos FRα circulantes. Esto sugiere que circula FRα puede no correlacionarse bien con los niveles tumorales. De hecho, en nuestros estudios anteriores, hemos observado algunas discrepancias en FRα tinción diferentes focos tumorales (recurrente y lesiones metastásicas) [14].
Discusión
El cáncer de ovario a menudo elude la detección debido a la falta de Los primeros síntomas definitivos. Por lo tanto, el cáncer de ovario presenta en etapa avanzada en ~ 70% de los pacientes. Los biomarcadores en uso hoy en día no son adecuados para la detección de cáncer en etapa temprana. Por lo tanto, no es sorprendente que el cáncer de ovario es la causa número uno de muerte entre todas las neoplasias ginecológicas en los últimos años. Actualmente marcadores disponibles CA-125 y los perfiles proteómicos carecen de sensibilidad, especificidad y /o reproducibilidad. Existe una clara necesidad de marcadores de diagnóstico para detectar el cáncer de ovario en las primeras etapas. Una molécula expresada casi exclusivamente en tejido patógeno haría un biomarcador ideal y un tal candidato prometedor es receptor de folato (FR-α). FR-α es altamente sobreexpresado en la gran mayoría de los cánceres de ovario, pero exhibe expresión limitada en los tejidos que son responsables de la retención de todo el cuerpo de los folatos (por ejemplo, la placenta, el plexo coroideo y el riñón). En el presente estudio, hemos probado si era factible para detectar circulando FRα en pacientes con cáncer de ovario y si el FRα circulante era de longitud completa y funcional
.
Nuestros datos muestran que los pacientes con cáncer de ovario tienen niveles elevados de FRα en relación con los controles sanos. Estos resultados sugieren que FRα circula potencialmente podría desarrollarse como un biomarcador. El aumento de los niveles de FRα en etapa temprana de la enfermedad indica que la regulación positiva de FRα puede ocurrir temprano en la carcinogénesis de ovario en algunos pacientes. De hecho, Toffoli y sus colegas encontraron que casi el 79% de los pacientes en estadio temprano (I y II), el cáncer de ovario sobreexpresa FRα, que era esencialmente idéntica a la proporción de pacientes en etapa avanzada que tenía la expresión FRα [9]. Hemos observado en nuestros estudios que los niveles circulantes de FRα en pacientes en etapa temprana no era diferente de los pacientes en etapa avanzada. Sin embargo, Toffoli y sus colegas encontraron que, si bien la proporción fue similar, los niveles de FRα en el tumor fueron significativamente mayores en los pacientes en etapa avanzada. La falta de correlación puede indicar que hay otros factores que regulan los niveles séricos. Por ejemplo, Mantovani y colegas encontraron que las muestras de orina humanos normales fueron fuertemente positivas para FRα reactividad inmune, lo que sugiere que existe un mecanismo para su aclaramiento renal rápido [15]. Desde los túbulos proximales del riñón expresan fuertemente la proteína, se podría concluir que el riñón tiene una estrategia bien desarrollada para eliminar FRα para evitar que se acumule en la sangre y la prevención de la absorción de FA en los tejidos [19]. Esto se apoya en estudios de modelos murinos cinéticos que han demostrado que a medida que progresa el tumor, aumento de los niveles urinarios de FRα preceder a los niveles de suero considerablemente [15].
FRα intacta es una proteína de 38 kDa y en nuestro análisis de inmunotransferencia, anticuerpo anti-MOv18 /ZEL detecta una proteína en el mismo peso molecular. Además, se demostró que el ensayo de microfiltración detectó la proteína funcional, que en su conjunto sugiere que FRα derramada por cáncer de ovario está intacto y funcional. La presencia de FRα en la circulación de pacientes tiene importancia terapéutica como una serie de terapias que se han desarrollado FRα superficie de las células diana en pacientes con cáncer [20]. Estas FR circulantes pueden unirse e interferir con la eficacia clínica. Esto podría explicar por altas tasas de fracaso observados en algunos inmunoterapias dirigidas-FRα en pacientes con cáncer de ovario. Por ejemplo, Kershaw y sus colegas desarrollaron un enfoque en el que las células T autólogas de pacientes fueron modificadas con gen con un receptor quimérico que contenía un anticuerpo de cadena única FRα específico acoplado a la cadena gamma del receptor Fc [21]. Mientras que las células secretadas IFN-γ en respuesta a FRα, no pudieron localizarse en el sitio del tumor, un fallo que puede ser explicado mediante la circulación de FRα que satura los receptores quiméricos. Por lo tanto, el análisis de circular FRα en pacientes con cáncer podría ayudar en la determinación de los niveles de anti-FRα dirigidos receptores quiméricos se necesitan para una terapia exitosa. Además, también hemos encontrado que las elevadas circulando FRα era funcional, lo que sugiere la posibilidad de interferencia con un número de terapias de ácido fólico conjugado de droga que se han desarrollado que requieren un sitio funcional de unión [20], una de las dificultades, sin embargo, en la medición de suero niveles de FRα es la falta de un ensayo de calidad. Mientras que nuestros ensayos de unión fueron capaces de detectar una diferencia entre los casos y controles, los resultados obtenidos sugieren que inmunotransferencia ensayo puede ser potencialmente más útiles en la detección de niveles elevados. Sin embargo, como con cualquier ensayo secante, la utilidad está limitada por su complejidad técnica (es decir, seguido de inmunotransferencia inmunoprecipitación) y los resultados con este ensayo sólo son semi-cuantitativa.
En conclusión, nuestros resultados demuestran que el cáncer de ovario pacientes, incluyendo aquellos con enfermedad temprana, tienen niveles elevados de FRα intactas funcionales en comparación con controles sanos. Con un mayor desarrollo, incluyendo las primeras etapas de grandes tamaños de muestra cáncer de ovario y mejora el rendimiento del ensayo, el uso de FRα como un biomarcador para el cáncer de ovario puede ser factible.
Reconocimientos
Los autores quieren agradecer Dr. Linda E. Kelemen por sus valiosas discusiones con el manuscrito.