Extracto
Antecedentes
El objetivo de nuestro trabajo fue identificar los genes específicamente alterado en el adenocarcinoma de páncreas y en especial aquellos que son alterados temprano en el desarrollo del cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
número de copias de genes se evaluó sistemáticamente con un diseño ultra-alta resolución CGH microarrays de oligonucleótidos de ADN a partir de muestras de cáncer de páncreas. Se observaron varias nuevas variaciones asociadas con el cáncer. En este trabajo nos centramos en uno de ellos, que implica la
REG4
gen. copias de genes aumento de número de la
REG4
gen fue confirmada por qPCR en 14 muestras de cáncer. También se encontró con mayor número de copias en la mayoría de muestras PanIN3. La ganancia relación betweena en
REG4
número y el desarrollo del cáncer de copias del gen se investigó en la línea celular de cáncer pancreático humano Mia-PaCa2 xenoinjertado bajo la piel de ratones desnudos. Cuando las células se transfectaron con una expresión REG4 vector que permite, generaron tumores casi dos veces más grande en tamaño. Además, estos tumores eran más resistentes al tratamiento gemcitabina que los tumores de control. Curiosamente, la administración intraperitoneal semanal de un anticuerpo monoclonal para REG4 reduce a la mitad el tamaño de los tumores generados por las células Mia-PaCa2, lo que sugiere que el anticuerpo interfirió con un mecanismo paracrino /autocrino que implica REG4 y estimular la progresión del cáncer. La adición de gemcitabina resultó en una reducción adicional, los tumores convertirse en 5 veces más pequeño que el control. La exposición al anticuerpo REG4 resultó en una disminución significativa en los niveles intratumorales de pAkt, Bcl-xL, Bcl-2, survivina y ciclina D1.
Conclusiones /Importancia
Se concluyó que adyuvante las terapias dirigidas a REG4 podrían mejorar el tratamiento estándar del cáncer de páncreas con gemcitabina
Visto:. Legoffic A, E Calvo, Cano C, E Folch-Puy, Barthet M, Delpero JR, et al. (2009) El
REG4
Gene, amplificado en las etapas tempranas del desarrollo del cáncer de páncreas, es una prometedora diana terapéutica. PLoS ONE 4 (10): e7495. doi: 10.1371 /journal.pone.0007495
Editor: Alegría Sturtevant, Universidad del Estado de Louisiana, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Junio, 2009; Aceptado: September 28, 2009; Publicado: 16 de octubre 2009
Derechos de Autor © 2009 Legoffic et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de INSERM, Liga Contra el cáncer y el INCA a JLI y por el proyecto FIS PI081608, Acción Integrada HF2006-0092 y CIBERehd. CIBERehd está financiado por el Instituto de Salud Carlos III de EF-P y CC. EF-P es el destinatario de un contrato Ramón y Cajal del Ministerio español de Educación y Ciencia y MF-M es el destinatario de un contrato FIS-PI050599 Instituto de Salud Carlos III. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas representa el 2% de todos los nuevos casos de cáncer, pero conduce a un 5% de todas las muertes por cáncer, con una tasa de supervivencia a los cinco años de sólo el 4% [1]. El diagnóstico se retrasa debido a la ausencia de síntomas y la falta de marcadores específicos que permiten la detección en una etapa potencialmente curativo. En la población general el cáncer de páncreas lleva un riesgo de por vida de aproximadamente 0,5 a 1% [2]. La predisposición genética está implicada porque el riesgo de cáncer de páncreas es del 4,7% para los familiares de primer grado de los casos de cáncer de páncreas y el riesgo de cáncer de páncreas aumenta con cada miembro de la familia afectada. Además, puede ser heredada como parte de un síndrome multi-cáncer, pero la gran mayoría de los cánceres de páncreas son esporádicos. Por último, el consumo de tabaco y las enfermedades como la diabetes y especialmente la pancreatitis crónica predisponen al cáncer de páncreas y alrededor del 10% de los pacientes con tumores mucinosos intrapapilar (IPMNs) desarrollará adenocarcinoma de páncreas.
Las alteraciones genómicas que pueden inducir más o de menos expresión de genes, con consecuencias importantes cuando se trata de oncogenes o genes supresores de tumor. Las alteraciones genéticas que se producen en las lesiones precursoras [3], así como durante el inicio y la progresión de cáncer de páncreas se han descrito parcialmente [4] - [7]. De hecho, la hibridación genómica comparada (CGH) análisis identificó frecuentes ganancias en los cromosomas 1q, 3, 5, 7 p, 8q, 11q, 12p, 17q, 19q y 20q, y las pérdidas en los cromosomas 3p, 6, 8p, 9p, 10q, 13q, 15q, 17p y 18q [8] - [13]. El objetivo de nuestro trabajo fue identificar, usando un ultra-alta resolución CGH microarrays de oligonucleótidos, los genes alterados específicamente en células de adenocarcinoma pancreático y especialmente aquellos que están alterados en el desarrollo temprano del cáncer. Varios candidatos fueron identificados con este enfoque, entre los cuales el
REG4
de genes [14] mostró aumento de número de copias de genes en 14/14 muestras analizadas. Esto es para nuestro conocimiento el primer informe de
REG4
aumento de número de copias de genes en el cáncer de páncreas.
En este trabajo se informe de que el
REG4
gen, situado en el cromosoma 1p13 0,1-p12, está presente en mayor número de copias en las células de cáncer de páncreas y en lesiones pancreáticas precancerosas finales. Los estudios sobre una línea celular de cáncer de páncreas xenoinjertado mostraron que la sobre expresión REG4 estimula el crecimiento del tumor y, por el contrario, que el bloqueo de la proteína REG4 que circula con un anticuerpo específico inhibe el crecimiento tumoral.
Resultados
El
REG4
gen está presente en mayor número de copias en las células de cáncer de páncreas y en PanIN 3 lesiones precancerosas
Utilizando un enfoque de exploración basado en ADN microchip Affymetrix, hemos identificado varios genes con un número de copias anormal en el ADN de células del cáncer pancreático. En primer lugar centramos en los genes alterados en las 14 muestras de ADN y descubrieron que
REG4
mostró aumentado sistemáticamente el número de copias. Todos los datos de microarrays reportados en el manuscrito se describe en conformidad con las directrices MIAME. Los datos completos que describen otras anormalidades de ADN serán publicados en otro lugar.
REG4
gen mayor número de copias fue particularmente interesante debido a que su expresión estaba implicado previamente en la agresividad de varios tipos de cáncer [15] - [17], incluyendo páncreas [18]. Figura 1 muestra el locus amplificado, que comprende la
REG4
gen, en el ADN de estos pacientes. Se controlaron además el número de copias de
REG4
en las lesiones precancerosas del páncreas nombrados PanINs. La combinación de un enfoque de captura por láser y un método de PCR cuantitativa, que mide el número de copias REG4 en los tres grados de lesiones PanIN y encontramos un mayor número de copias de
REG4 Hoteles en 0/6, 1/7 y 6/7 de las lesiones PanIN1, PanIN2 y PanIN3, respectivamente (Figura 2). Como control, los números de copiar
de TERT gratis (tert) y
Rpp21 gratis (RNasaP proteína p21) genes fueron evaluados en las mismas muestras de ADN y siempre se encontraron dos ejemplares (datos no mostrados) . En conjunto, estos datos sugieren que la
REG4
número de copias de genes es con frecuencia un aumento en el cáncer de páncreas y en la última etapa de las lesiones precancerosas (PanIN3), pero rara vez en etapas anteriores (PanIN1 y PanIN2).
relaciones alélicas se calcularon con el Partek Genómica suite, versión 6.4. se utilizó HapMap (270 muestras) para crear el número de copias de línea de base. segmentación genómico se utilizó para detectar el aumento de número de copias o pérdida. Regiones fueron detectados utilizando los siguientes parámetros de segmentación: mínimo de 10 marcadores genéticos; umbral de segmentación p-valor inferior a 0.001; una señal a ruido igual a 0,3. A. Representación esquemática de la
REG4
locus. Las posiciones de los 7 genes presentes en este locus se indican: de izquierda a Righ:
ZNF697
,
PHGDH
,
HMGCS2
,
REG4
,
NBPF7
,
ADAM30
y
NOTCH2
. B. Posición del segmento aumento de número de copias que se encuentra en todas las 14 muestras de ADN de cáncer de páncreas, que incluye el
REG4
gen. C. Genómica cambia en el segmento amplificado de la
REG4
locus, determinado por el Affymetrix SNP de genoma completo humano gama análisis 6.0 en las 14 muestras de cáncer de páncreas. ganancias genéticas se muestran como barras y las pérdidas como barras azules rojos, barras grises que corresponden a 2 copias como se indica en la escala que se muestra debajo. Tenga en cuenta el predominio de las ganancias (rojo) en el
REG4
región. D. Detalle de ganancias /pérdidas en el
REG4
genes y sus regiones flanqueantes de los 14 analizaron muestras.
poblaciones homogéneas de células fueron microdissected cuidadosamente usando un sistema láser de microdisección de captura. PanINs se calificaron 1 a 3 como una función de la importancia de las alteraciones arquitecturales y citológicos. ADN de las muestras de cáncer de páncreas obtenidos por ecografía endoscópica (EUS) se utilizó guiada por aspiración con aguja fina. Se utilizó ADN de leucocitos de sangre como control.
número de copias del gen REG4
se determinó mediante qPCR realizaron por triplicado y los resultados fueron analizados utilizando el software RealQuant.
sobreexpresión REG4 estimula el crecimiento celular y aumenta la resistencia al tratamiento con gemcitabina en células MiaPaca2
in vitro
se ha demostrado previamente que la sobreexpresión forzada REG4
in vitro
aumenta la tasa de crecimiento celular y la resistencia a la muerte celular programada en las células cancerosas derivadas de no pancreáticas. Se obtuvieron células Mia-PaCa2 que sobreexpresan la proteína REG4 (Mia-PaCa2 /REG4) mediante transducción de un retrovirus recombinante (Figura 3) y analizamos su capacidad para crecer y para resistir a la droga antitumoral de gemcitabina
in vitro
. Hemos observado que las células que expresan REG4 crecieron un 50% más rápidamente que las células vacías Mia-PaCa2 /. Se confirmó que el aumento de crecimiento celular se debe a la sobreexpresión REG4 por knockingdown REG4 con una transfección siRNA específico y encontramos una pérdida de esta capacidad, como se muestra en la figura 4. De manera similar, cuando las células Mia-PaCa2 se trataron con 50 mM de gemcitabina durante 48 horas, la resistencia a la droga se incrementó en las células que sobreexpresan REG4, en comparación con el control, pero perdió en las células transfectadas con el tiempo un siRNA contra REG4 (Figura 4). Estos resultados indican que REG4 está implicada en el crecimiento celular y la resistencia a medicamentos contra el cáncer en células de cáncer derivadas de páncreas como previamente sugeridas en las células no pancreáticas.
Toda la secuencia de codificación del ADNc REG4 se subclonó en el retroviral pLPCX vector. células de empaquetamiento Phoenix anfotrópico se transfectaron con el plásmido retroviral para obtener el sobrenadante que contenía partículas retrovirales. Las células diana Mia-PaCa2 se sembraron en presencia del sobrenadante que contenía partículas retrovirales como se describe en la sección Materiales y Métodos. Las poblaciones de REG4-expresión de Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /REG4) y células de control (Mia-PaCa2 /vacío), infectadas con el vector vacío, se aislaron por selección puromicina. Expresión de REG4 se midió por inmunotransferencia de tipo Western de extractos de células, utilizando el anticuerpo monoclonal anti-REG4. Después del desarrollo, la membrana fue despojado y re-probaron para la β-actina.
Mia-PaCa2 /REG4 y Mia-PaCa2 /celdas vacías fueron transfectadas con un siRNA contra REG4 (A) o incubó en presencia de un anticuerpo anti-REG4 monoclonal (B) y su crecimiento y su resistencia al tratamiento gemcitabina se midió por el ensayo de MTS. Los resultados se expresaron como porcentaje de células no tratadas Mia-PaCa2 /vacíos.
REG4 es una proteína secretora de 16 kDa. Para probar si los efectos de REG4 sobre el crecimiento celular y la resistencia al tratamiento gemcitabina eran debido a su función endocrina /paracrina en células pancreáticas, hemos añadido un anticuerpo monoclonal específico contra la proteína REG4 al medio de cultivo, para bloquear su actividad. En estas condiciones, los efectos de la sobreexpresión REG4 desaparecieron casi por completo, como se muestra en la Figura 4. Estos resultados indican que REG4 ejerce sus efectos sobre el crecimiento celular y la resistencia a la gemcitabina a través de una manera endocrina /paracrina.
aumenta REG4 sobreexpresión tumorigenicidad y la resistencia al tratamiento con gemcitabina
Se compararon las capacidades de las células Mia-PaCa2 /vacío y Mia-PaCa2 /REG4 para formar tumores después de la inyección subcutánea en ratones desnudos. Como se muestra en la Figura 5, los tumores que se formaron a partir de células que sobre-expresan la proteína REG4 crecieron más rápidamente que las células que no expresan el gen. El volumen del tumor fue de un 70% superior al utilizar células Mia-PaCa2 /REG4 que con las células Mia-PaCa2 de control. Curiosamente, cuando los ratones fueron tratados con gemcitabina, los tumores muestran una mayor sobre-expresión de la proteína REG4 resistencia al tratamiento, en comparación con los tumores formados con celdas vacías Mia-PaCa2 /. Mientras que el volumen de los tumores generados con células Mia-PaCa2 disminuye en un 60% después del tratamiento con gemcitabina, el volumen de las células que expresan REG4 disminuyó en sólo el 20%.
Aproximadamente 2 × 10
6 Mia-PaCa- 2 células se inocularon por vía subcutánea con 0,1 ml de Matrigel a ratones desnudos. Gemcitabina (100 mg /kg) se inyectó por vía intraperitoneal dos veces a la semana. dimensiones del tumor se midieron una vez que los volúmenes tumorales semanales y calculados con la fórmula de longitud x anchura x profundidad x 0,5236. Los valores se expresan como la media +/- SE de seis mediciones.
El tratamiento sistémico con un anticuerpo contra REG4 disminuye tumorigenicidad
El siguiente paso fue analizar el efecto de bloquear con REG4 un anticuerpo monoclonal específico sobre el crecimiento de los tumores inducidos por inyección subcutánea de células Mia-PaCa2. Como se muestra en la Figura 6, el tratamiento con el anticuerpo REG4 disminución en el desarrollo del tumor en aproximadamente un 50%. Además, la combinación de tratamiento con anticuerpos REG4 con gemcitabina se tradujo en una mayor reducción del volumen tumoral. En conjunto, estos resultados indican que la proteína de direccionamiento REG4 podría ser utilizado en cooperación con gemcitabina para el tratamiento de cáncer de páncreas.
Aproximadamente 2 × 10
6 Mia-PaCa-2 células se inocularon por vía subcutánea con 0,1 ml de Matrigel a ratones desnudos. Un día antes de la inoculación de células tumorales, el grupo de control recibió una inyección intraperitoneal de 150 l de PBS, mientras que el grupo de ensayo recibió 0,25 mg de anticuerpo monoclonal REG4 en 150 l de PBS. tampón vehículo o anticuerpo anti-REG4 se inyectó semanalmente en los animales. dimensiones del tumor se midieron una vez que los volúmenes tumorales semanales y calculados con la fórmula de longitud x anchura x profundidad x 0,5236. Gemcitabina (100 mg /kg) se inyectó por vía intraperitoneal dos veces a la semana. Los valores se expresan como media +/- SE (n = 6).
La inyección intraperitoneal de un anticuerpo REG4 reduce los niveles de proteínas y las proteínas del ciclo antiapototic asociada a células en los tumores inducidos por Mia-PaCa2
Dado que el tratamiento sistémico con el anticuerpo reduce el crecimiento del tumor y aumenta la sensibilidad al tratamiento con gemcitabina, se utilizó el análisis de Western blot para supervisar en los tumores de la influencia del tratamiento con anticuerpos REG4 en los niveles intracelulares de proteínas asociadas con la apoptosis (AKT fosforilada, Bcl- 2, Bcl-xL y survivina) y el ciclo celular (ciclina D1). Como los niveles esperados de AKT fosforilada, Bcl-2, Bcl-xL y survivin se redujeron significativamente en los tumores de ratones tratados con el anticuerpo REG4 comparación con el control. También se encontró Nivel de ciclina D1 reducida en los ratones tratados con anticuerpo REG4 (Figura 7). Estos hallazgos representan probablemente la tasa de crecimiento observada reducida.
muestras de tejido tumoral se lisaron en un tampón de homogeneización que contiene un cóctel de antiproteasas. Los restos celulares y los materiales insolubles se eliminaron por centrifugación y las fracciones solubles se cargaron en tampón de Laemmli en un gel de SDS-poliacrilamida al 12,5%. Las proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y la membrana se incubó con la AKT fosforilada contra (fosfo-Ser473), AKT anti-pan, anti-Bcl-2, anti-Bcl-xL, anti-survivin o anticuerpos anti-ciclina D1. Después del desarrollo, la membrana se desnudó y se volvió a sondear para β-actina.
Discusión
En este estudio, nuestra hipótesis era que las primeras alteraciones genómicas que ocurren en las células de cáncer de páncreas son responsables de la mal pronóstico de los pacientes y de la falta de respuesta adecuada a fármacos contra el cáncer, incluyendo gemcitabina. Varias regiones de ADN con el número de copias de genes alterados se observaron en efecto en los tumores de pacientes sin metástasis detectables en el momento del estudio. En el presente trabajo, nos centramos nuestra atención en la región del cromosoma que contiene el
REG4
gen, ya que mostró un incremento en el número de copias en los 14 pacientes analizados. Además, también se encontró un aumento del número de copias de esta región en casi todos PanIN3, la última etapa de lesiones pancreáticas precancerosas, lo que sugiere que
REG4
amplificación de genes es un evento temprano en el desarrollo del cáncer de páncreas. REG4 es una pequeña proteína secretada que contiene un único dominio bien conservado de hidratos de carbono de reconocimiento de [14], [15]. REG4 es un miembro de una familia multigénica llamado
reg
(revisado en 19). En los seres humanos, cinco miembros estructuralmente relacionados se han identificado hasta la fecha y se agrupan en tres subclases basadas en las estructuras primarias de las proteínas codificadas a saber REG1A y REG1B (Tipo 1), REG3A y REG3G (Tipo 3) y REG4 (tipo 4). Contrariamente a
REG1A
,
reg1B
,
reg3A Opiniones y
reg3G
genes, todos ellos situados en el cromosoma 2p12,
REG4
está en el cromosoma 1p13.1-p12. Varios informes en la literatura sugieren un papel importante para REG4 en el cáncer. Por ejemplo, la expresión REG4 parece ser responsable de la resistencia de las células a fármacos contra el cáncer, tales como 5-fluoracilo y metotrexato [15], [20], que promueve la fosforilación de AKT y la sobre expresión de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-XL y survivina [21], [22], se activa el receptor de EGF /Akt /AP1 vía de señalización [21] y su expresión se correlaciona con metástasis peritoneal mejorada en los carcinomas gástricos [22], [23]. Se sobreexpresa sistemáticamente en los tejidos cancerosos derivados de de colon [15], [24], el estómago [16], de próstata [25] y el páncreas [18] y en enfermedades que predisponen al cáncer de colon, como colitis ulcerosa [14], [26] , la enfermedad de Crohn [14] y adenoma de colon [24]. La amplificación inicial de su gen en el cáncer de páncreas se describe en este estudio (Figuras 1 y 2) y su actividad oncogénica reportado en la literatura nos llevó a estudiar más a fondo el papel de REG4 en la tumorigenicidad de páncreas y en la resistencia del cáncer de páncreas al tratamiento gemcitabina. La primera observación fue que las células de cáncer de páncreas derivados que sobreexpresan la proteína REG4 crecieron más rápidamente y son más resistentes al tratamiento con gemcitabina (Figura 4). La segunda, la observación más importante fue que, en un modelo de xenoinjerto, tumores inducidos con células que expresan Mia-PaCa2 REG4 crecieron más rápidamente que los tumores de control, obtenidos con células Mia-PaCa2 nativas (Figura 5). Además, se encontró que los tumores inducidos por células que expresan Mia-PaCa2 REG4 eran más resistentes al tratamiento con gemcitabina que los tumores de control, de acuerdo con
Los datos in vitro
e informes previos que sugieren la implicación de REG4 en la resistencia celular a medicamentos contra el cáncer [15], [20] y respuesta a la quimioterapia [27]. Se obtuvo el tercer resultado, muy emocionante cuando los ratones con tumores inducidos por Mia-PaCa2 fueron tratados con la administración sistémica de un anticuerpo anti-REG4 específico (Figura 6). Se observó una importante reducción en el tamaño del tumor y un aumento de la sensibilidad al tratamiento con gemcitabina en ratones que recibieron una vez al anticuerpo anti-semana REG4. Debido a que la eficacia limitada del tratamiento del cáncer de páncreas con gemcitabina podría ser debido a la presencia de estroma en los tumores [28], analizamos si la sobreexpresión REG4 influyó en el grado de formación de estroma en células Mia-PaCa2 xenoinjertados por vía subcutánea. análisis semicuantitativo no reveló diferencias significativas entre los tumores que sobreexpresan o no REG4, o tratados con anticuerpo REG4, todos ellos mostrando estroma muy limitada (datos no mostrados). Sin embargo, nuestros resultados se podrían explicar, al menos en parte, por el hecho de que los niveles de las proteínas antiapoptóticas asociadas tales como AKT activado, Bcl-2, Bcl-xL y sobrevivir, así como la ciclina asociada a la proteína del ciclo celular D1 , se redujeron fuertemente (Figura 7) que indica que la apoptosis y el ciclo celular están reguladas por REG4. Debido a que no se supone que los anticuerpos para penetrar en las células tumorales en grandes cantidades, un efecto autocrina o paracrina debe ser considerado. Tras la secreción por las células tumorales, REG4 activaría, probablemente a través de receptores específicos, las vías intracelulares que favorecen la progresión del cáncer. Estos datos están de acuerdo con los resultados encontrados en las células del colon y el cáncer gástrico
in vitro
[21], [22]. En conjunto, estos resultados sugieren que la sobreexpresión de la proteína REG4, inducida por su ganancia temprano en número de copias del gen, juega un papel importante en el desarrollo de tumores de páncreas y de resistencia a los fármacos contra el cáncer. Orientación de la proteína que circula REG4 aparece como un complemento prometedor a las terapias actuales de adenocarcinoma pancreático, basados en la administración de gemcitabina.
Materiales y Métodos
Estudio de la
REG4
número de copias de genes en cáncer de páncreas
Catorce muestras de cáncer de páncreas consecutivos se obtuvieron mediante ecografía endoscópica (EUS) guiada por la citología por aspiración con aguja entre junio de 2007 y septiembre de 2007 en el hospital Nord, de Marsella. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. Seis muestras fueron obtenidas de pacientes sin metástasis detectables mientras que 8 presentan con metástasis en el momento de la punción. Se extrajo el ADN, se amplifica y se hibridó en Affymetrix Genome-Wide matriz SNP humano 6.0 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Affymetrix Inc.). El Affymetrix genoma completo SNP serie de características Humano 6,0 a más de 1,8 millones de marcadores de variación genética, incluyendo más de 906,600 polimorfismos de nucleótido único (SNPs) y más de 946.000 sondas para la detección de la variación del número de copias. La distancia entre los marcadores de mediana asumido todos los 1,8 millones de SNP y copiar marcadores número combinado es 696 bases. La matriz también contiene 202.000 sondas dirigidas a 5.677 regiones conocidas de la variación del número de copias, se resuelven en 3.182 segmentos distintos, que no se superponen, de la base de datos de Toronto de Genómica variantes. La hibridación, el lavado, la tinción, y el chip de exploración se lleva a cabo por el Fondo de centrales de microarrays CRCHUL utilizando materiales y métodos proporcionados por el fabricante (Affymetrix Inc).
En general la calidad de la hibridación fue estimada por el índice de tipo de llamadas suministrada por GeneChip Software de análisis de genotipificación (GType, alpiste algoritmo usando los ajustes de parámetros por defecto). relaciones alélicas se calcularon con el Partek Genómica Suite, versión 6.4 (Partek Inc., St. Louis, MO) utilizando los parámetros por defecto de propiedad. A 270 muestras HapMap se utilizó para crear el número de copias de la línea de base. segmentación genómico se utiliza como un método para detectar alteraciones en el número de copia. Regiones fueron detectados utilizando los siguientes parámetros de segmentación: mínimo de 10 marcadores genéticos; umbral de segmentación p-valor inferior a 0.001; y una señal a ruido igual a 0,3. Usando estos parámetros, se detectaron 10263 segmentos. segmentos seleccionados se visualizaron en un contexto genómico con el Partek® Genómica Suite.
ADN de lesiones PanIN
Siete secciones de micras, bloques de parafina de tejido fijados con formol se tiñeron con hematoxilina y eosina. poblaciones homogéneas de células fueron microdissected cuidadosamente usando un sistema de captura de microdisección PixCell II láser (Arcturus, Mountain View, CA) según las instrucciones del fabricante. PanINs se calificaron 1-3 de acuerdo con las recomendaciones actuales (http://pathology.jhu.edu/pancreas_panin/y [29]) en función de la importancia de las alteraciones arquitecturales y citológicos. Se analizaron siete muestras pancreáticas humanas en las que nos encontramos sistemáticamente lesiones PanIN2 y PanIN3 pero las lesiones PanIN1 se encontraron en sólo 6 de ellos. Un total de & gt; se recogieron 300 células para cada categoría de secciones de tejido de serie. células recogidas se transfirieron a un tubo Eppendorf y se resuspendieron en 20 a 50 l de tampón de lisis que contenía Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,5% de Tween 20 (pH 8,3), y 5 l de proteinasa K (20 mg /ml). Las muestras se incubaron 24 horas a 55 ° C, seguido de ebullición durante 10 min para inactivar la proteinasa K. DNeasy Tissue Kit (Qiagen) se utilizó para extraer ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN extraído se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Nano-gota Technologies, Wilmington, DE).
REG4
número de copias del gen de estimación por PCR en tiempo real
REG4
número de copias del gen se determinó utilizando el hreg4-F: 5'-TTTACTCCCTGTGGTCTGGG-3 'y hreg4-R: 5'-CTCTTTTCTCCAGCAAGGCA-3' primers. La amplificación se realizó en un LigthCycler 480 (Roche Diagnostic) con el siguiente programa: 10 s de desnaturalización a 95 ° C, 45 ciclos de 8 s desnaturalización a 95 ° C, 7 s recocido a 60,5 ° C y 14 s de extensión a 72 ° DO. la curva de fusión se obtuvo por calentamiento a 20 ° C /s a 95 ° C, enfriamiento a 20 ° C /s a 65 ° C y calentando a 0,1 ° C /s a 95 ° C con la recogida de datos de fluorescencia a 0.1 ° intervalos C. Las curvas de calibración se generaron utilizando una serie de diluciones de 10 veces que van desde 0,1 ng a 100 ng. Se realizó qPCR para cada individuo por triplicado y se determinó el número de copias en relación normalizada mediante la generación de una curva estándar y la normalización a través de muestras. resultados de la PCR fueron analizados utilizando el software RealQuant (Roche Diagnostic). Las mismas 14 muestras de ADN de cáncer de páncreas se utiliza para la hibridación en el Affymetrix genoma completo SNP gama humana 6,0 se utilizaron para qPCR. Se utilizó ADN de leucocitos de sangre obtenidas a partir de individuos aparentemente sanos como control.
vector retroviral y mediada por retrovirus gen transferencia
La secuencia codificante completa de cDNA REG4 se amplificó por PCR usando el par de cebadores 5 '-GGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGCGG-3' (hacia delante) y 5'-GGCTCGAGCTATGGTCGGTACTTGCACAGG-3 '(hacia atrás), que contenía los sitios de restricción EcoRI y XhoI (subrayados). El producto se subclonó en los sitios de restricción EcoRI-XhoI del vector retroviral pLPCX obtenido de S. Lowe (Cold Spring Harbor Laboratory, NY). células de empaquetamiento Phoenix anfotrópico (10
6) se sembraron en una placa de seis pocillos, se incubaron durante 24 h y se transfectaron con polietilenimina con 5 g de plásmido retroviral. Cuarenta y ocho horas más tarde, el medio que contiene el virus se filtró (0,45 micras filtro, Millipore) para obtener la primera sobrenadante. Objetivo Mia-PaCa2 se sembraron a 2 x 10
5 células por placa de 35 mm y se incubó durante la noche. Para la infección, el medio de cultivo fue reemplazado por una combinación adecuada de la primera sobrenadante y medio de cultivo (v /v), suplementado con 4 g /ml de polibreno (Sigma), y las células se incubaron a 37 ° C. La población de REG4-expresión de Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /REG4) se aisló por selección en presencia de puromicina (1 mg /ml). Mia-PaCa2 infectadas con el vector vacío (Mia-PaCa2 /vacío) se utilizó como control.
in vitro
estudios
condiciones de cultivo de células y transfección de siRNA.
Las líneas celulares de cáncer pancreático Mia-PaCa2 /REG4 y Mia-PaCa2 /vacío se hicieron crecer en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 2 mM L-glutamina en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera. El día antes de siRNA transfección, las células se sembraron en placas de 6 pocillos para dar finalmente el 30-50% de confluencia. Después de eliminar el medio, las células se lavaron una vez con medio de transfección y libre de suero se hizo en medio libre de suero por adición de una mezcla compuesta de 10 l Oligofectamine reactivo (Invitrogen) y 200 pmoles de siRNA (siRNA REG4 [5'CTTCAGGAAGCTGAGGAAC3 ' ] o el control de siRNA [5'AATTCTCCGAACGTGTCACGT3 '] secuencias específicas) diluido en 240 l de medio libre de suero. Después de un periodo de incubación de 4 horas a 37 ° C, el medio de transfección que contiene siRNAs fue sustituido por medio fresco.
El crecimiento celular y gemcitabina tratamiento.
10
4 células /así se sembradas en placas de 96 pocillos en 100 l de medio de cultivo. El día siguiente, gemcitabina (adquirido de Eli Lilly) se añadió en 100 l de medio a una concentración final de 50 mM en presencia o no de 1 g de anticuerpo monoclonal REG4. Después de 48 horas, 20 l MTS ([(2-il-4,5-dimetiltiazol) -5- 3- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio] reactivo obtenido de Promega) se añadió , las placas se incubaron a 37 ° C durante 30 minutos, y se leyó la absorbancia a 490 nm.
in vivo
estudios
Evaluación de
in vivo
el crecimiento del tumor.
directrices institucionales para el uso apropiado y humano de la investigación fueron seguidos. Aproximadamente el 2 × 10
6 Mia-PaCa-2 células se inocularon por vía subcutánea con 0,1 ml de Matrigel (BD Biosciences Descubrimiento Los aparatos de laboratorio) a 6 semanas de edad ratones desnudos macho. Un día antes de la inoculación de células tumorales, el grupo de control recibió una inyección intraperitoneal de 150 l de PBS (vehículo), mientras que el grupo de ensayo recibió 0,25 mg de anticuerpo monoclonal REG4 en 150 l de PBS. tampón vehículo o anticuerpo anti-REG4 se inyectó semanalmente en los animales. dimensiones del tumor se midieron una vez que los volúmenes tumorales semanales y calculados con la fórmula de longitud x anchura x profundidad x 0,5236 como se informó anteriormente [30]. Gemcitabina (100 mg /kg) se inyectó por vía intraperitoneal dos veces a la semana. Los estudios se realizaron de acuerdo con las regulaciones de la Unión Europea para los experimentos con animales. Los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Marsella.
Western blot.
células Mia-PaCa2 y muestras de tejidos tumorales se lisaron en un tampón de homogeneización que contiene pepstatina (1,45 mM), leupeptina (2,1 mM), DTT, trietanolamina (50 mM) y EDTA /EGTA (0,1 mM). Los restos celulares y los materiales insolubles se eliminaron por centrifugación (14.000 g, 30 minutos a 4 ° C) y las fracciones solubles se sometieron a ensayo, ya sea inmediatamente o se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. La proteína total (50 g) se cargó en un tampón de Laemmli en un gel de SDS-poliacrilamida al 12,5% en un Mini Cell (Bio-Rad). Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa durante 1 hora utilizando una célula de transferencia Mini Trans-Blot electroforética (Bio-Rad). La membrana se bloqueó en 1 x PBS /0,05% de Tween 20/5% de leche descremada en polvo durante la noche a 4 ° C. Después de dos lavados en 1X PBS /Tween 20 0,005%, se añadieron anticuerpos primarios durante 1-2 horas. Después de tres lavados más, se añadió el anticuerpo secundario durante 1,5 horas. La membrana se desarrolló utilizando el kit de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham Life Science) en la película de Kodak en el cuarto oscuro. La membrana se desnudó y se volvió a sondear para la β-actina utilizando el protocolo descrito en el kit ECL
anticuerpos
Anti-humano anticuerpo REG4 monoclonal (clon 200214) fue adquirido de R & amp..; D Systems; Bcl-2 (C21), Bcl-xL (H-62), survivina (FL-142), ciclina D1 (C20) y β-actina (N-21) anticuerpos policlonales de conejo eran de Santa Cruz Biotechnology; AKT fosforilada (fosfo-Ser473) anticuerpo policlonal fue de Upstate Biotechnology Inc;