Extracto
Antecedentes
Int-6 gratis (sitio de integración 6) se identificó como una oncogén en una pantalla de virus de tumor mamario de ratón (MMTV tumorigénico inserciones).
INT6
expresión se altera en los cánceres humanos, pero el papel preciso de perturbado
INT6
en la tumorigénesis sigue siendo poco clara, y un modelo animal para estudiar
Int-6
función fisiológica tiene faltado.
Principales conclusiones
a continuación, creamos un
in vivo
modelo de la función INT6 en el pez cebra, y por medio de enfoques genéticos y químicos genética implican INT6 como un tejido modulador específico de la señalización de MEK-ERK. Encontramos que INT6 se requiere para la expresión normal de proteína MEK1 en las células humanas, y para Erk señalización en embriones de pez cebra. La pérdida de cualquiera INT6 o la señalización Mek causa defectos en el desarrollo craneofacial, y INT6 y Erk señalización tienen un solapamiento de ámbitos expresión tisular.
Importancia
Nuestros resultados proporcionan una nueva visión sobre el papel fisiológico de los vertebrados INT6, y tiene implicaciones para el tratamiento de tumores humanos Viendo alterado
INT6
expresión
Visto:. Grzmil M, D Whiting, Maule J, Anastasaki C, Amatruda JF, Kelsh RN, et al . (2007) El
INT6
cáncer de genes y vías de señalización MEK Converge durante el desarrollo de pez cebra. PLoS ONE 2 (9): E959. doi: 10.1371 /journal.pone.0000959
Editor Académico: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Agosto 2007; Aceptado: 2 Septiembre 2007; Publicado: 26 Septiembre 2007
Derechos de Autor © 2007 Grzmil et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiada por una beca MRC de EEP, y por subvenciones de CRUK y el AICR a CJN. Los donantes no tuvo ningún papel en el diseño o la realización del estudio, en la recopilación, análisis o interpretación de los datos, o en la preparación, revisión o aprobación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
el desarrollo embrionario y el desarrollo de tumores a menudo comparten mecanismos moleculares subyacentes-un concepto ilustrado por la identificación de genes perturbado por el virus del tumor mamario de ratón (MMTV) en cánceres de mama [1]. Un ejemplo importante, el
Int-1 | gen que es un sitio común de integración de MMTV en los tumores mamarios, codifica el homólogo de la
Drosophila alas
gen [2], [3] y fue posteriormente llamado
Wnt1 gratis (sin alas /Int) en reconocimiento de esta función conservada. la señalización de Wnt se sabe ahora que ser interrumpido en muchos tipos de tumores humanos, especialmente cáncer de colon [4]. Otros
Int
genes, como
Int-2
y
4 gratis (Fgf3, 4), y
Int-3 gratis (Notch4), codificar mitógenos y reguladores del desarrollo que también son misactivated en muchos tipos de cáncer [1], [5].
en la mayoría de los casos, MMTV activa
Int
la expresión génica como resultado de la integración proviral aguas arriba de la región promotora. Sorprendentemente, los tres inserciones MMTV encuentran en
Int-6
, que codifica un componente de la eucariótica factor de iniciación de traducción 3 (eIF3), se encontró que estar dentro de intrones, y en la orientación transcripcional opuesta a la
Int-6
gen, la creación de un truncado
Int-6
ARNm [1], [6]. La expresión ectópica de forma equivalente truncada
Int-6
pueden transformar cultivos celulares [7], [8], y promueven la persistencia de la hiperplasia alveolar mamaria y la tumorigénesis en ratones transgénicos [9].
A pesar de la evidencia importante a favor de un papel para INT6 en la génesis tumoral humano [10] - [12], la base molecular de INT6 en el desarrollo del cáncer sigue sin resolverse. Altamente conservados en eucariotas, INT6 contiene un dominio de PCI, que se encuentra en las proteínas de la tapa 19S regulador del proteasoma, la signalosome COP9 (CSN), y el complejo de iniciación de la traducción eIF3; los tres complejos comparten similitud estructural global, y INT6 se ha encontrado asociada con cada uno [13]. Cuando se sobreexpresa en la levadura, INT6 induce resistencia a múltiples fármacos mediante la activación de un AP-1 factor de transcripción [14], [15], y en las células humanas, el rango de la función INT6 incluye progresión ordenada a través de la mitosis [16], la regulación del proteasoma la estabilidad dependiente del MCM7 [17] y HIF2α [18], y sin sentido mediada por mRNA decadencia [19].
Con ningún modelo animal para INT6 pérdida de función disponibles, que razonó que la comprensión de
INT6
durante el desarrollo podría proporcionar nuevos penetración en función INT6 en células de vertebrados normales, proporcionando con ello una nueva perspectiva sobre la función INT6 en la formación del cáncer. En este caso, el uso de células de pez cebra y mamíferos, describimos el primer fenotipo INT6 pérdida de función en un animal, y enlace INT6 con una vía de señalización, que al igual que los producidos por otros
Int
genes, es fundamental para ambos el desarrollo y el cáncer.
Resultados
INT6 es esencial para la embriogénesis pez cebra
Hemos elegido para estudiar el papel fisiológico del pez cebra INT6 durante el desarrollo, utilizando oligonucleótidos de morfolino (MOS) para reducir INT6 proteínas, así como un
INT6
hi2470
inserción línea mutante (proporcionado amablemente por N. Hopkins, A. y S. Ámsterdam Farrington. MIT). El pez cebra INT6 es más del 90% idéntica en su secuencia de aminoácidos a INT6 humana (
Ensembl
ENSDARG00000002549) y el uso de un anticuerpo generado contra el INT6 N-terminal de la INT6 humano [20] hemos detectado que el
INT6
MO resultado la pérdida de INT6 (Figura 1A). Como INT6 se ha implicado en el control del ciclo celular /M-fase G2, primero se realizó inmunohistoquímica todo el montaje con el fallecido G2 /marcador de la fase M, fosfo-histona H3, y encontramos los números sólo redujo ligeramente de las células a finales de la fase G2 /M en el
INT6
morphant en comparación con el control (Figura S1). Es importante el descubrimiento de que los embriones inyectados con
INT6
MO tenía defectos de desarrollo específicos (Figura 1B-N), redujo más notablemente melanización 2 días después de la fertilización (dpf:
int-6
MO n = 51/53; con n = MO 0/35;
int-6 5MM
n = 3/31); células de pigmento fuera de lugar en la cola 3 dpf (
int-6
MO n = 46/49; n con MO = 3/30); y la morfogénesis anormal de la mandíbula, con elementos de cartílago reducidas o malformadas a las 4 y 5 dpf (
int-6
MO n = 81/85 4 dpf, n = 76/83 5 dpf; Côn MO 1/67 4 dpf , n = 1/61 5 dpf). Los defectos craneofaciales y de células de pigmento observados en el
int-6
morphant y
hi2470
mutante sugieren que
int-6
podría contribuir al desarrollo de las células de la cresta neural (CCN derivados). Utilizamos múltiples marcadores de los NCC y sus derivados para evaluar cuando surgen estos fenotipos, y encontramos INT6 no parece ser necesario para la especificación u organización de premigratorio y migratorias precursores del cartílago (Figura S2). Por el contrario, la tinción con azul Alcian cartílago reveló una pérdida específica de los cinco elementos de cartílago ceratobranquiales en el
INT6
morphants, mientras que, palatoquadrate, y el cartílago de Meckel hioides estuvieron presentes, aunque deforme (5,5 dpf
INT6
MO n = 45/53; estafar MO n = 1/34; Figura 1I-L, Figura S3). La expresión de
INT6
ARNm restaurado elementos craneofaciales normales a la
INT6
morphant (
los datos no presentados
); y el
INT6
hi2470
mutantes tenían un fenotipo craneofacial casi idénticos (Figura 1 M, N) que indica un requisito genuino por INT6 en el desarrollo craneofacial.
(A) Western blot de INT6 (*) en embriones de pez cebra inyectados con un MO (con) el control o
INT6
MO. (B)
INT6
morphant melanocitos son menos pigmentación oscura. (C-F) INT6 se requiere para la colocación de células de pigmento en la cola, como
INT6
morphants y
INT6
hi2470
mutantes han perdido células de pigmento en la aleta caudal (D, flecha ). La luz ambiental ilumina 'estrellas, la luz' patrón de los iridophore visto en el
INT6
hi2470
embriones (F, flecha). (G-H) Por 5 dpf, los embriones inyectados con una estafa MO tienen arcos certobranical claramente visibles, mientras que
INT6
morphants hacer no tiene arcos certobranical visibles, además de otras anomalías, incluyendo sin consumir saco vitelino, el corazón y el desarrollo del ojo. (EN). Tinción con azul Alcian de 5 embriones dpf muestra la pérdida de arcos ceratobrancial 1 a 5. M, divertículo de Meckel; PQ, palatoquadrate; CH, ceratohial; CB, ceratobrancial.
Pérdida de INT6 altera la proteína MEK y ERK señalización
Las pruebas bioquímicas en la levadura de fisión sugiere que INT6 es parte de un complejo de iniciación de la traducción especializada eIF3 que pueden dirigirse los ARNm específicos para la traducción [21]. Dada la implicación de INT6 en la proliferación celular [16], transferencias de Western utilizando un panel de anticuerpos contra las proteínas implicadas en el ciclo celular y las vías de señalización asociados se realizaron usando lisados de control y INT6 siRNA transfectaron células MDA-MB-231. De 16 proteínas investigados en este modo, sólo los niveles de MEK1 fueron alterados por INT6 siRNA transfección (Figura 2). Como se informó anteriormente [20], encontramos
INT6
-siRNA lisados celulares se habían reducido los niveles de proteína en comparación con el INT6 no transfectadas y revertir
INT6
-siRNA secuencia. También se encontró una reducción drástica de los niveles de proteína MEK1 que se correlacionaron con la pérdida de INT6, mientras que BAX, los niveles de tubulina y proteínas actina apareció afectado en el
INT6
-siRNA células transfectadas (Figura 2A). La pérdida de MEK1 era específicamente a nivel de proteínas, como semi-cuantitativa-PCR mostró niveles normales de
MEK1
mRNA en
INT6
-siRNA células tratadas, así como los reducidos niveles esperados de el mensaje INT6 en los
INT6
-siRNA células transfectadas (Figura 2B). La posibilidad de que
INT6
pueden afectar a la señalización MAPK a través del control de los niveles de proteína MEK nos llevó a examinar el estado de fosforilación de ERK1 /2, abajo objetivos de las quinasas MEK, en
INT6
morphant embriones de pez cebra . En comparación con los embriones de control MO,
INT6
morphant lisados de embriones habían reducido los niveles de fosfo-ERK (Figura 2C). Estos datos sugieren una nueva función para INT6 en el control de señalización MAPK en el embrión en desarrollo, posiblemente por control directo de los niveles de proteína MEK1.
A. células U2-OS de osteosarcoma no transfectadas (T) o transfectadas con siRNA dirigidos contra el
INT6
ARNm (si) o la secuencia de marcha atrás (R), muestran niveles reducidos de la proteína INT6 y MEK1 específicamente después de la transfección con
INT6-
siRNA, pero no una reducción en los niveles de BAX, tubulina o proteína actina. (B) muestra semi-cuantitativa-PCR
MEK1
ARNm no se ve afectada de forma inversa y
INT6
-siRNA células tratadas, junto con los niveles reducidos previstos de la
INT6
mensaje en los
INT6
-siRNA células transfectadas. c, control PCR sin ADN. niveles (C) fosfato ERK se reducen en
INT6
morphants, mientras que la mancha Ponceau detecta carga igual de proteínas en el gel.
INT6 y Mek vías convergen durante el desarrollo
Si INT6 controla la actividad Mek en el embrión en desarrollo, que la teoría de que los tejidos en desarrollo específicos podrían haber superposición de los dominios de expresión de la proteína y la actividad INT6 fosfo-Erk. De hecho, la inmunohistoquímica con anticuerpos dirigidos contra INT6 y fosfo-Erk reveló dominios superpuestos de expresión en la región craneofacial en desarrollo en 3 y 4 dpf embriones (Figura 3A-F). INT6 fuerte expresión específica de tejido también se detectó en el intestino y el desarrollo de la lente, regiones que tenían poca o ninguna expresión de fosfo-ERK (figura S4). Dada la expresión de fosfo-Erk y INT6 observado en la región craneofacial, la hipótesis de que algunos de los fenotipos INT6, tales como el defecto formación mandíbula, podría ser phenocopied por la represión de la señalización de Erk. Como interpretación de los fenotipos MO recientemente se ha complicado por la identificación de defectos craneofaciales dependientes de p53 inducida por MO [22], se utilizó un enfoque alternativo - el altamente selectivo, clínicamente activo inhibidor de MEK CI-1040 [23] - para reducir la señalización de Mek en el pez cebra. Añadimos el fármaco a 4 HPF a una concentración de 0,25, 0,5, y 1,0 M, y se confirmó la pérdida de expresión de fosfo-ERK por Western blot (
no se muestran datos
). En particular, la adición de CI-1040 provocó una pérdida dependiente de la dosis de las estructuras posteriores del embrión, de manera que 1,0 M CI-1040 provocó una severa anterior-posterior (AP) defecto eje (Figura 4A-C), consistente con una papel para la señalización de FGF en el desarrollo del eje AP [24]. CI-1040 también causó la pérdida de elementos de cartílago ceratobranquiales, mientras que los elementos anteriores - divertículo de Meckel, palatoquadrate y cartílagos hioides - estaban presentes, pero deforme (Figura 3G-J), similar a los efectos observados en
INT6
morphants y mutantes .
(A-F). Inmunohistoquímica de INT6 y fosfo-ERK en los tejidos craneofaciales en desarrollo, el contador se tiñeron con hematoxilina y fosfato histonas H3 para mostrar ciclo de las células. (G, H) toda ventral montaje vistas de azul cartílagos faríngeos manchadas Alcian muestran pérdida de arcos ceratobrancial 1-5 y una reducción de la de Meckel (M), palatoquadrate (PQ) y ceratohial (CH) cartílagos en 4 dpf embriones tratados con 0,5 uM CI-1040. (I, J) Secciones de 4 dpf hematoxilina y eosina manchadas embriones después del tratamiento 0,5 uM CI-1040 revela pérdida de arcos CB 1-5 (brackets). E, placa etmoidal; PC, Parachordal cartílago.
Para aclarar aún más la importancia biológica de la señalización INT6 y Mek, nos aprovechamos de la facilidad con que las vías de señalización pueden ser alterados farmacológicamente en contextos genéticos específicos en el sistema de pez cebra. Pensamos que si INT6 contribuye a la activación de la señalización de Mek, a continuación, los embriones con reducida INT6 debe ser hipersensible a dosis bajas del inhibidor de MEK CI-1040. En los embriones de control tratados con 0,25 M CI-1040, no se detectaron cambios en los eje anterior-posterior (Figura 4B). Además,
INT6
morphants generada por dosis bajas de MO (0,25 ng) no tenía una alterados eje AP (Figura 4D). Por el contrario, en combinación con dosis bajas de CI-1040, la dosis baja
INT6
morphant mostró un fenotipo mejorado severamente eje AP (Figura 4E). Tomados en conjunto, estos datos proporcionan evidencia adicional de que
INT6
pueden desempeñar un papel en la modulación de la señalización MEK
in vivo
.
(A-C). Sólo los embriones tratados con el 1,0 M CI-1040, y no 0,25 M, muestran una pérdida de estructuras posteriores, a diferencia de (D)
INT6
morphants (
INT6
MO 0,25 ng). (E, F) En combinación con 0,25 M de CI-1040, 0,25 g de
INT6
MO provoca una alteración dramática del eje antero-posterior.
Discusión
Activado en la mayoría de tipos de cáncer, la vía de señalización MAPK es uno de los objetivos más atractivos para nuevas terapias contra el cáncer [23]. Al igual que las vías de señalización MAPK, la mayor parte de la
Int
vías - Wnt, FGF, y Notch - se conservan los reguladores del desarrollo que se activan con frecuencia para promover la oncogénesis. Ofrecemos pruebas de que, al igual que otros
Int
productos génicos,
se requiere INT6 Opiniones de desarrollo de los vertebrados (Figura 1), en parte, proporcionando un nuevo capa de la regulación de transducción de señales MAPK (Figura 2) . Con la amplia gama de actividades celulares atribuidas a INT6, el detalle mecanicista de este control se mantiene de entenderse; nuestras primeras investigaciones indican la reducción de MEK1 en
INT6
-siRNA tratados células de mamífero no es dependiente del proteasoma (MG & amp; CJN,
sin publicar datos
), por lo que la regulación directa por MEK1 INT6 dependiente traducción una posibilidad.
Recientemente, la importancia de la RAS, RAF y MEK en la enfermedad humana se ha extendido más allá del cáncer mediante el descubrimiento de que las mutaciones de la línea germinal humana en estos genes causan la familia LEOPARD-Noonan de síndromes [25] . detallados estudios inmunohistoquímicos en ratones han identificado altamente regulados, dominios específicos de la fosforilación de ERK discreta y dinámica a lo largo del desarrollo, incluyendo los arcos faríngeos y esbozos de los miembros [26]. En los primeros INT6 estudios de expresión de proteínas en todo el desarrollo de un animal, se muestra que INT6 ha superposición regional dominios de expresión de la proteína con fosfo-Erk, principalmente en la región craneofacial (Figura 3, figura S4). Prestando importancia biológica de estas observaciones, se muestra que las características fenotípicas son compartidos entre la pérdida de INT6 y la inhibición de la actividad Mek (Figura 3). Además, la pérdida parcial de INT6 causa embriones para ser altamente sensibles a una dosis ligeramente comprometida de la inhibición Mek, revelando un
vivo
interacción entre la expresión de proteínas de señalización INT6 y Mek-Erk desarrollo (Figura 4). Ya en la sobre-expresión de la señalización de Ras-Raf-MEK provoca defectos morfológicos, estamos generando actualmente líneas transgénicas que permiten el control temporal de la señalización de MEK, que será una herramienta valiosa para profundizar la disección genética de la relación INT6-Mek-Erk
in vivo
. Será fundamental en futuros estudios para establecer si INT6 es capaz de controlar tanto Mek1 y Mek2; nuestros estudios iniciales MO indicar que MEK2 puede tener un papel específico en la migración de los melanocitos (CA & amp; EEP,
datos no publicados), aumentando la posibilidad de que los defectos de la migración de células de pigmento observados en el
INT6
morphants también reflejan alteraciones en la señalización de MEK.
FGF señalización es crucial para el desarrollo del esqueleto, ejemplificada por las mutaciones que alteran la señalización FGF en síndromes genéticos anormalidad óseos humanos [27]. En el embrión de ratón en desarrollo, la mayoría de los dominios de fosfo-ERK se superponen con la señalización de FGF dominios [26]. moléculas de señalización de FGF son candidatos para la activación aguas arriba de la señalización de MEK-ERK moderado-INT6 que conforma el esqueleto craneofacial en los vertebrados [28], [29], y candidatos abajo objetivos de la señalización INT6-Mek-Erk incluyen la diferenciación de los condrocitos factor de transcripción Sox9 , que requiere la actividad Mek para la actividad transcripcional [30]. Observamos también que
ERK2
, pero no
ERK1
, se expresa específicamente en los arcos faríngeos en dos días de embriones de pez cebra [31], posiblemente, lo que sugiere que la modulación INT6-Mek en el desarrollo región craneofacial puede señalar específicamente a través de los objetivos de ERK2.
Relacionar la modulación INT6 de MEK-ERK señalización al desarrollo del cáncer es un nuevo ángulo para la investigación futura. Una posibilidad es que en MMTV inducida por tumores mamarios, la proteína truncada Int-6 puede actuar como un oncogén mediante la alteración de la señalización de MEK-ERK. Proponemos que las diversas localizaciones celulares de INT6, combinados con la expresión temporal y localización de Mek1 /2 y ERK1 /2, pueden dar lugar a puesta a punto de las vías de señalización MEK-ERK en tejidos específicos durante el desarrollo, y pueden tener implicaciones importantes para el papel de INT6 en la tumorigénesis.
Métodos
zootécnicas y de pez cebra morpholino estudios
Zerbafish (
Danio rerio)
líneas AB, AB *, y AB * -TPL, se levantaron y puesta en escena como se describe [32], [33]. OM (Tabla 1) fueron diseñados por y comprado de Gene Herramientas, LLC (EE.UU.), y 1 ng inyecta en embriones en estadio de una sola célula.
Análisis de Fenotipo
Análisis de Fenotipo eran realizado como se describe: estudios del ciclo celular [34]; tinción con azul Alcian [35]; síntesis de la sonda y todo el montaje hibridaciones in situ [36]. sondas de ADNc para los marcadores de la cresta neural fueron el tipo de regalo David Raible (Universidad de Washington, EE.UU.). Poliadenilado
INT6
ARNm se ha generado utilizando Ambion mMessage mMachine (# 1340).
Cultivo de células y análisis de RT-PCR
MDA-MB-231 células fueron cultivadas y transfectadas como se describe [19] utilizando Lipofectamine (Invitrogen) con Si-oligonucleótidos (Tabla 1; Eurogentec) a una concentración final de 100 nM en Optimem (Gibco). se aisló Cuarenta y ocho horas después de la transfección RNA total (RNeasy Mini Kit; Qiagen). y de un solo paso RT-PCR reacciones (Qiagen) a cabo utilizando cebadores específicos (Tabla 1)
Immunoblotting
lisados de células enteras y extractos de pez cebra se generaron [31], [19] e inmunohistoquímica se realizó tal como se describe [36]. Los anticuerpos utilizados como en la Tabla 2.
Apoyo a la Información
Figura S1. Análisis del ciclo celular Red de morphants INT6. inmunohistoquímica con los números finales de G2 /M fase marcador, fosfo-histona H3 muestra sólo ligeramente reducida de las células de todo el montaje a finales de la fase G2 /M en el morphant INT6 comparación con el control. Del mismo modo, el contenido de ADN medido por citometría de flujo revela sólo una ligera reducción de las células en fase G2 /M en el morphant INT6. Por lo tanto, se encuentra que la pérdida de INT6 en células de vertebrados normales (así como en líneas celulares de cáncer humano adicionales, MG & amp; CJN datos no publicados) no aparece resultado en una acumulación de células en G2 progresión /M
doi.: 10.1371 /journal.pone.0000959.s001 gratis (4.75 MB TIF)
figura S2.
Lateral puntos de vista de la hibridación in situ de los marcadores de la cresta neural en morphants control y INT6, revelando ningún cambio en el número de células o la migración como se indica por la expresión aparentemente normal de DLX2 (etapas 6-36 hpf, examinados a intervalos de dos horas), ni de los marcadores tempranos de NCC y los melanocitos, como SOX10, Crestin, caracol y mitfa (24 HPF) en morphants INT6. Estas observaciones se extendieron por el examen de una línea SOX10-GFP transgénicos (1) revela inalterada expresión de GFP-NC-células en morphants INT6 dentro del primer 48 HPF, pero una pérdida de la expresión de GFP arcos faríngeos diferenciadas por 3-7 3 dpf ( datos no mostrados)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s002 gratis (40.41 MB TIF)
Figura S3.
Desarrollo de los arcos faríngeos en el control en desarrollo (A-C) y (D-F) INT6 animales morphant. Tenga en cuenta la pérdida de arcos faríngeos (A, soporte) en la morphants INT6 (soporte). Las secciones fueron teñidas con azul de metileno. Por delante de la izquierda
doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s003 gratis (14.09 MB TIF)
figura S4.
inmunohistoquímica de INT6 y fosfo-ERK en la tinción de embriones 4 dpf. (A, B) Mientras INT6 y fosfo-Erk señalización superposición en la región craneofacial, también tienen patrones distintos, por ejemplo en el ojo y (C, D) intestino. Observamos que mientras INT6 y fosfo-ERK tienen dominios superpuestos de expresión en la región craneofacial, INT6 tinción en la región craneofacial fue más fuerte que fosfo-Erk, y la tinción de fosfo-ERK se limita a tejidos específicos dentro de la región craneofacial. M, divertículo de Meckel; E: placa etmoidal; CH, ceratohial; CB, ceratobrancial. Corte sagital, por delante de la izquierda
doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s004 gratis (17.60 MB TIF) guía
Reconocimientos
Agradecemos a N. Hopkins , A. y S. Ámsterdam Farrington para el
INT6
línea de hi2470
; R. Marais y C. Marshall para CI-1040; D. Raible construcciones de ADN; K. gaviota de anticuerpos anti-tubulina; E. Prichard para las observaciones adicionales CI-1040; D. Faratian para ayudar con inmunohistoquímica; B. Morgan para obtener ayuda con la preparación de manuscritos; L. Poulton para la lectura crítica del manuscrito; y N. Hastie y D. Harrison útil para los debates.