Extracto
Antecedentes
Uno de los principales mecanismos que pueden producir resistencia a los fármacos antineoplásicos en las células cancerosas es el cassette (ABC) los transportistas de unión de ATP. Los transportadores ABC puede reducir significativamente la concentración intracelular de fármacos antineoplásicos mediante el aumento de su flujo de salida, lo que reduce la actividad citotóxica de los fármacos antineoplásicos. Uno de estos transportadores, el múltiplo resistente proteína 7 (MRP7, ABCC10), recientemente se ha demostrado que produce resistencia a los fármacos antineoplásicos mediante el aumento del flujo de salida de paclitaxel. En este estudio, hemos examinado los efectos de BCR-Abl inhibidores de tirosina quinasa imatinib, nilotinib y dasatinib sobre la actividad y la expresión de MRP7 en células HEK293 transfectadas con MRP7, designados HEK-MRP7-2.
Metodología y /o Principales conclusiones
Se presenta por primera vez que el imatinib y nilotinib invierten la resistencia a múltiples MRP7 mediada. Nuestros resultados del ensayo MTT indicaron que la expresión MRP7 en las células HEK-MRP7-2 no se alteró significativamente por incubación con 5 M de imatinib o nilotinib para un máximo de 72 horas. Además, imatinib y nilotinib (1-5 M) produjo una reversión significativa dependiente de la concentración de resistencia a múltiples fármacos MRP7 mediada por el aumento de la sensibilidad de las células HEK-MRP7-2 a paclitaxel y vincristina. Imatinib y nilotinib, a las 5 M, se incrementaron significativamente la acumulación de [
3H] -paclitaxel en células HEK-MRP7-2. La incubación de las células HEK-MRP7-2 con imatinib o nilotinib (5 M) también inhibió de manera significativa el flujo de salida de paclitaxel.
Conclusiones
Imatinib y nilotinib revertir la resistencia a paclitaxel MRP7 mediada, la mayoría probablemente debido a su inhibición de la flujo de salida de paclitaxel a través de MRP7. Estos hallazgos sugieren que el imatinib o nilotinib, en combinación con otros fármacos antineoplásicos, pueden ser útiles en el tratamiento de ciertos cánceres resistentes
Visto:. Shen T, Kuang YH, Ashby CR Jr, Lei Y, Chen A, Zhou Y, et al. (2009) El imatinib y nilotinib inversa resistencia a múltiples fármacos en las células cancerosas mediante la inhibición de la actividad de eflujo de la MRP7 (ABCC10). PLoS ONE 4 (10): E7520. doi: 10.1371 /journal.pone.0007520
Editor: Debbie Fox, del Instituto de Investigación de la Infancia del Hospital de Niños de Nueva Orleans, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Junio, 2009; Aceptado: 2 Septiembre 2009; Publicado: 20 Octubre 2009
Derechos de Autor © 2009 Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos de Semilla de San Juan de Investigación de la Universidad subvención Nº 579-1110-7002 (Z.-S. Chen) y la atención primaria Medicine Associates, PC (Flushing, NY) subvención Nº 582-2082-7601 (Z. -S. Chen). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Aunque el uso clínico de la cirugía, la radiación y la quimioterapia han disminuido las tasas de recurrencia de cáncer, la resistencia celular a los fármacos quimioterapéuticos es un obstáculo importante en el tratamiento del cáncer [1], [2]. La eficacia de la quimioterapia puede ser limitada debido a la resistencia adquirida de tratamiento previo. En consecuencia, las estrategias de investigación para eludir tal resistencia en las células cancerosas se han convertido en un foco actual para el desarrollo de nuevas estrategias quimioterapéuticos combinacionales. Tanto la resistencia intrínseca y adquirida droga puede producir múltiples cambios en diversas rutas celulares, lo que lleva a una disminución de la citotoxicidad, y por lo tanto la eficacia, de los medicamentos antineoplásicos [3]. Por lo tanto, los pacientes con cáncer que reciben tratamientos múltiples pueden llegar a ser cada vez más insensibles a los agentes quimioterapéuticos.
Uno de los mecanismos celulares primarios que pueden producir resistencia a la terapia antineoplásica implica el flujo de salida de medicamentos a partir de las células cancerosas por los transportistas o bombas transmembrana específicos [4]. Estas proteínas transportadoras se originan de la superfamilia de casete de unión a ATP-(ABC) transportadores que comparten propiedades estructurales y funcionales comunes [5]. Un número de estudios han demostrado que la mayoría de los miembros de la familia C de transportadores ABC son proteínas de resistencia a múltiples fármacos (PLM), que se caracterizan por una resistencia cruzada a muchos fármacos no relacionados estructuralmente [2], [4].
Una serie de estudios sugieren que las células cancerosas que expresan el transportador de la familia ABC MRP7 C /ABCC10 pueden desarrollar resistencia a varios fármacos quimioterapéuticos. Por ejemplo, las células de adenocarcinoma de la glándula salival humana (SGA) que sobreexpresan MRP7 mRNA y la pantalla proteína MRP7 resistencia significativa a la vincristina [6]. expresión MRP7 también ha sido identificado por inmunohistoquímica en ratones portadores de tumores xenoinjertados con SGA humano después del tratamiento con vincristina [6]. Además, E
217βG, un inhibidor competitivo de transporte MRP7, disminuyó significativamente la acumulación de docetaxel en las células de SGA humanos [6]. En general, los compuestos que son inhibidores de la actividad de transporte MRP7 atenúan o resistencia en las células cancerosas que expresan la proteína MRP7 inversa.
Las células MRP7 sobreexpresan confieren resistencia a varios fármacos anticancerosos, incluido el paclitaxel, la vincristina y la vinblastina [7]. trabajos recientes también informaron que las células MRP7-overexpresssing confieren resistencia a los análogos de nucleósidos y epithilone [8] B. Anteriormente, en nuestro laboratorio, hemos demostrado que cefarantina, un alcaloide derivado de biscoclaurine, invertido resistencia paclitaxel MRP7 mediada por [9].
inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs) puede revertir la resistencia de las células cancerosas a los fármacos antineoplásicos a través de múltiples mecanismos. Por ejemplo, en células de SGA humanos, MRP7, P-gp, y MRP1 fueron detectados después de la exposición prolongada a vincristina [6]. Recientemente, nosotros y otros han informado de que algunos de los inhibidores de TK son potentes moduladores de transportadores ABC, incluyendo P-gp y BCRP /ABCG2 [10], [11]. Los resultados recientes de nuestro laboratorio sugieren que el nilotinib invierte significativamente P-GP-BCRP y mediada por MDR [12].
En este estudio, uno de los principales objetivos era identificar compuestos TKI que invertirían drogas MRP7 mediada resistencia. En consecuencia, es posible que TKIs, en combinación con otros fármacos antineoplásicos, puede ser útil en el tratamiento de cánceres que expresan proteínas MDR, incluyendo los transportadores ABC. Un descubrimiento importante sobre TKIs fue que algunos de los denominados medicamentos de "moléculas pequeñas" podrían inhibir la actividad de TK por competición con ATP por la unión al dominio catalítico intracelular de TK receptor, que produjo la inhibición de varias cascadas de señalización corriente abajo por la autofosforilación [13]. Curiosamente, imatinib, nilotinib y dasatinib son inhibidores de la agrupación conocimientos tradicionales punto de interrupción de región Abelson (BCR-Abl) y KIT, un receptor de los conocimientos tradicionales clase III [14] - [18]. El gen BCR-Abl se asocia con una desregulación de la función de los conocimientos tradicionales y, posteriormente, conduce a la transformación maligna en la leucemia mielógena crónica (CML) [19], [20]. El reconocimiento de gen BCR-Abl y su correspondiente proteína ha llevado al desarrollo de fármacos de molécula pequeña diseñados para bloquear la activación de BCR-ABL TKIs a través de la unión competitiva en el sitio de unión a ATP [19]. En general, el objetivo principal de este estudio fue determinar si el BCR-Abl ITC podría revertir la MDR mediada MRP7.
Materiales y Métodos
2.1. Las líneas celulares
células
HEK293 y el cDNA MRP7 fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Gary Kruh (Universidad de Illinois en Chicago, Chicago, IL). Las células HEK-MRP7-2 transfectadas y las células HEK293-pcDNA3.1 transfectadas vector vacío se establecieron a partir de células HEK293 mediante electroporación [9]. La línea humana de células de carcinoma epidermoide sensible a los fármacos padres KB-3-1 y su correspondiente línea celular P-gp con sobreexpresión KB-C2 fueron amablemente proporcionados por los Dres. Gottesman (NCI, Bethesda, MD) y Akiyama (Universidad de Kagoshima, Japón), respectivamente. Se establecieron las células KB-C2 a partir de células KB-3-1 mediante la exposición a concentraciones crecientes de la colchicina de una manera gradual por etapas (hasta 2 mg /ml) y recoger las células que eran resistentes [20]. Todas estas líneas celulares se cultivaron como monocapas adherentes en frascos con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino al 10%, glutamina 2 mM, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina en condiciones de cultivo celular estándar en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C.
2.2. Materiales
DMEM, suero bovino y penicilina /estreptomicina se adquirieron de Hyclone (Logan, UT). Nilotinib (Tasigna) (fig. 1B) se obtuvo como un regalo de productos farmacéuticos Novartis (Basilea, Suiza). Imatinib (Fig. 1A) y dasatinib (Fig. 1C) se adquirieron de ChemieTeck Inc. (Indianapolis, IN). Paclitaxel, vincristina, doxorrubicina, colchicina, fluoruro de p-aminophenylmethylsulfonyl, albúmina de suero bovino, sulfóxido de dimetilo (DMSO) y (4,5-dimetiltiazol-2-il) -3,5-diphenylformazan (MTT), el anticuerpo de cabra policlonal 1- contra MRP7 (C-19), el anticuerpo monoclonal de ratón contra la P-gp (P7965), el rábano picante secundario marcado con peroxidasa anti-cabra o anti-IgG de ratón se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO) . Un anticuerpo policlonal contra MRP1 /ABCC1 humana fue proporcionado amablemente por el Dr. Akiyama (Universidad de Kagoshima, Japón) [21]. Un anticuerpo monoclonal BXP-34 contra BCRP fue adquirido de Signet Laboratories Inc. (Dedham, MA). [
3H] -paclitaxel (45 Ci /mmol) se adquirió de Moravek Bioquímicos (Brea, CA).
2.3. Preparación de lisados de células
células monocapa confluente en matraz T-25 se cosecharon y se lavaron dos veces con PBS frío. Los extractos celulares se prepararon utilizando el tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación [1 × PBS, 1% Nonidet P-40, desoxicolato 0,5% de sodio, 0,1% de SDS, 100 mM de p-APMSF, leupeptina 10 mM y 10 mM de aprotinina] durante 30 min en hielo con ocasional balanceo seguido de centrifugación a 12.000 rpm a 4 ° C durante 15 min. Las concentraciones de proteína de los lisados de células se determinaron por el ensayo de proteínas de Bradford [22]. El sobrenadante que contiene lisados celulares totales fueron recogidos y almacenados a -80 ° C hasta su uso.
2.4. Immunoblotting
la misma cantidad de lisados de células totales (40 g) se resolvieron por electroforesis en 4-12% de sodio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa [23]. Los lisados de células se desnaturalizaron en un vaso de precipitados de agua C 100 ° durante 5 minutos antes de cargar sobre el 4-12% SDS-PAGE. El gel se llevó a cabo en el tampón de electroforesis SDS (base Tris 25 mM, glicina 0,192 M, 1% SDS) a 170 V durante 2 h. La transferencia se realizó en un tampón de transferencia (base Tris 25 mM, 0,192 M de glicina, pH 8,3) a 30 V durante 2 h. La membrana de nitrocelulosa se sumergió en la leche descremada 5% para bloquear la unión no específica durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se immunoblotted durante la noche con anticuerpos primarios (MRP7 monoclonal o policlonal P-gp y BCRP anticuerpos en 1:500 y MRP1 policlonal en 1:3,000) a 4 ° C. El día siguiente, la membrana se lavó tres veces con tampón de TBST (0,3% Tris, 0,8% NaCl, 0,02% de KCl, 0,05% de Tween 20), seguido de una incubación de tres horas con anticuerpos secundarios de policlonal anti-MRP7 o anticuerpo monoclonal P-gp a 1:1000. El complejo de proteína-anticuerpo se midió usando un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (Amersham, NJ). A continuación, la membrana se expuso a la película para el desarrollo. La actina control de carga usado convencionalmente se utilizó para detectar la igualdad de carga en cada carril en las muestras preparadas a partir de lisados celulares.
2.5. El análisis de sensibilidad a los fármacos
sensibilidad a los fármacos se analizó utilizando un MTT modificado ligeramente ensayo colorimétrico [23]. vector vacío transfectaron células HEK293-pcDNA3.1 y las células HEK293-MRP7-2 MRP7 transfectadas se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado a 5.000 células /pocillo. Después de la incubación en DMEM suplementado con suero bovino al 10% a 37 ° C durante 24 h, los fármacos antineoplásicos se diluyeron a varias concentraciones y se incubaron con las células de forma continua durante 72 h. Los inhibidores potenciales se añadieron 1 h antes de la adición de los fármacos contra el cáncer.
Después de la incubación de fármaco de 72 h, se añadieron 20 l de MTT (4 mg /ml) a cada pocillo y la placa se incubó adicionalmente durante 4 h, permitiendo que las células viables para el desarrollo de la MTT de color amarillo en forma de cristales de formazano azul oscuro. Posteriormente, el medio se retiró suavemente sin la agitación de la monocapa de adhesivo de las células, y se añadieron 100 l de DMSO en cada pocillo para disolver los cristales de formazán. Las placas se agitan bien durante 5 min, y un lector de microplacas OPSYS leer la absorbancia a 570 nm de Dynex Technologies Inc. (Chantilly, VA). El grado de resistencia se calculó dividiendo el IC
50 para las células MDR por la de las células parentales, mientras que el grado de MDR inversión se calculó dividiendo el IC
50 de las células con el fármaco contra el cáncer en el ausencia de inhibidor por la obtenida en presencia del inhibidor. Las concentraciones necesarias para inhibir el crecimiento en un 50% de las células de control se calcularon a partir de curvas de supervivencia utilizando el método de Bliss [23].
Los fármacos antineoplásicos utilizados incluyen paclitaxel, vincristina y doxorubicina a concentraciones variables hasta una concentración final de 10, 1, y 1 mM, respectivamente. El BCR-Abl ITC, tales como el nilotinib e imatinib, se utilizaron posteriormente en concentraciones no tóxicas de 1, 2,5 y 5 M a la pantalla contra la vincristina y doxorrubicina. En este estudio, primero seleccionamos una dosis no tóxica sola (5 M) para examinar los efectos de la ITC sobre la resistencia mediada por MRP7 al paclitaxel. Una vez determinado el ITC tuvo el efecto más significativo de inversión, como el imatinib y nilotinib, se seleccionaron posteriormente tres concentraciones (1, 2,5 ó 5 micras) para cada TKI para determinar si sus efectos de reversión eran dependiente de la concentración de paclitaxel, vincristina y doxorrubicina .
2.6. la acumulación del fármaco y de flujo de salida
las células parentales HEK293-pcDNA3.1 y HEK-MRP7-2 células transfectadas se sembraron en dos matraces T75 y se incubaron con DMEM suplementado con suero bovino al 10% a 37 ° C. Después de que las células eran 60 a 95% de confluencia, se añadió cada inhibidor a matraces separados y se incubaron las células durante 1 h. Después las células se trataron con tripsina y dos partes alícuotas (48 × 10
6 células) de cada línea celular se suspendieron en el medio. Posteriormente, las células se suspendieron en el medio que contiene [
3H] -paclitaxel a una concentración de 0,1 mM con o sin el nilotinib TKIs y imatinib (5 M) durante 1 hora a 37 ° C. Una hora más tarde, el medio de incubación se reemplazó por el medio que contiene el TKIs sin paclitaxel. Alícuotas (1 × 10
6 células) fueron recogidos en varios puntos de tiempo (0, 20, 60 y 120 min). Después, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y cada muestra se colocó en fluido de centelleo para medir la radioactividad en un contador de centelleo líquido Packard TRI-CARB 1900CA de Packard Instrument Inc. (Downers Grove, IL).
2.7. El análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces y las diferencias se determinaron mediante la prueba t-Student de dos colas. El a priori, la significación estadística se fijó en
P
. & Lt; 0,05
Resultados
3.1. La expresión de MRP7 en HEK293-pcDNA3.1 y células HEK-MRP7-2
En este estudio, las dos líneas celulares utilizadas fueron células HEK293 transfectadas con el vector de expresión MRP7 o el control de vector vacío (pcDNA3.1 ). Se realizó un análisis por inmunotransferencia para detectar el nivel de expresión de la proteína MRP7 en las líneas antes mencionadas. proteína MRP7 (MW 171 kD) se expresó en células HEK-MRP7-2, pero no en células HEK293-pcDNA3.1 (Fig. 2A). Se detectó P-gp, con un peso molecular de 170 kD, en las líneas celulares de control KB-C2 positivos, pero no en la KB-3-1, HEK293-pcDNA3.1 o HEK-MRP7-2 líneas celulares de control negativo ( la Fig. 2B). También llevamos a cabo experimentos de Western blot para determinar si MRP1 y BCRP se expresaron en células HEK293-pcDNA3.1 y HEK-MRP7-2. Los niveles de MRP1 y BCRP tanto en células HEK-MRP7-2 y las células HEK293-pcDNA3.1 fueron indetectables. Estos hallazgos son importantes, ya que cualquier efecto observado con los inhibidores son poco probable que sea debido a su interacción con P-gp, MRP1 y /o BCRP.
(A) Expresión de MRP7 en HEK293-pcDNA3.1 ( carril 1) y células MRP7 transfectadas (carril 2). (B) Expresión de P-gp en células HEK293-pcDNA3.1 (carril 1), células HEK-MRP7-2 (carril 2), KB-3-1 (carril 3) y KB-C2 (carril 4). (C) Efecto de 5 M de imatinib en el nivel de expresión de MRP7 (HEK-MRP7-2) durante 36 y 72 h, respectivamente. (D) Efecto de 5 M de nilotinib en el nivel de expresión de MRP7 (HEK-MRP7-2) durante 36 y 72 h, respectivamente. Igual cantidad de proteínas (40 g) de lisado celular total se utilizaron para cada muestra. Las membranas de nitrocelulosa se inmunotransfirieron con el anticuerpo primario contra MRP7 o actina a dilución 1:500, o P-gp en la dilución 1:500 a 4 ° C durante la noche, y después se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP en 1:1000 diluciones a temperatura ambiente durante 3 h.
para evaluar el efecto de imatinib /nilotinib sobre la expresión de MRP7, las células HEK-MRP7-2 se incubaron con 5 M de imatinib o nilotinib el 36 y 72 h, respectivamente . La incubación de las células HEK-MRP7-2 con imatinib o nilotinib no alteró significativamente la expresión de los niveles de proteína de MRP7 en diferentes puntos de tiempo (Fig. 2C y D). Esto sugiere que el efecto de los inhibidores sobre la respuesta de las células a los fármacos contra el cáncer no se debe a la regulación de la expresión MRP7.
3,2. Análisis de la sensibilidad a los fármacos de las células HEK293 transfectadas MRP7-
Para determinar el perfil de resistencia a los medicamentos de MRP7, la sensibilidad de HEK-MRP7-2 células a fármacos antineoplásicos específicos transfectadas se comparó con la del control del vector de sólo células, HEK293-pcDNA3.1. Las células HEK-MRP7-2 exhiben un mayor nivel significativo de resistencia a paclitaxel y vincristina (9.5- y resistencia 6,7 veces comparación con las células de control, respectivamente) (Tabla 1). Estos resultados indican que la línea celular HEK-MRP7-2 fue capaz de conferir resistencia a varios fármacos antineoplásicos, lo cual es consistente con nuestro informe anterior [9].
3.3. El efecto de la ITC sobre la sensibilidad de las células HEK293 transfectadas MRP7 de medicamentos contra el cáncer
Hemos probado varios BCR-Abl ITC para determinar si podían revertir la resistencia de las células HEK293 que sobreexpresan MRP7 al fármaco paclitaxel y vincristina antineoplásico. La magnitud de la inversión producida por el TKIs a paclitaxel fue variable (Tabla 1; Fig. 3). La preincubación de las células con imatinib o nilotinib, a 2,5 M, invierte de manera significativa la resistencia de las células HEK-MRP7-2 a paclitaxel (Tabla 1, Fig. 3A y 3B). Imatinib y nilotinib producen una reversión 6.9- y 13,0 veces, respectivamente, de la resistencia a paclitaxel. El IC
50 de paclitaxel en las células HEK-MRP7-2 co-cultivadas con 2,5 M de nilotinib se redujo significativamente a partir de 207,0 ± 19,7 nM a 15,9 ± 0,9 nM, y esto fue significativamente inferior a la de paclitaxel en el grupo control (21,9 ± 1,9 nM). La resistencia a paclitaxel fue completamente revertido cuando imatinib se incubó-co con paclitaxel en células HEK-MRP7-2. Un significativamente mayor inversión se obtuvo en los 5 M (12,4 veces) en comparación con la concentración 1 M (4,7 veces). Imatinib, a 5 mM, también aumentó la sensibilidad de las células a paclitaxel en células HEK293-pcDNA3.1 por 2,2 veces, aunque este efecto en HEK293-pcDNA3.1 fue significativamente menor que en las células transfectadas MRP7 (12,5 veces) (Tabla 1). Estos resultados indican que el imatinib BCR-Abl TKIs y nilotinib atenúan significativamente la resistencia a paclitaxel mediada por MRP7. Aunque la co-incubación de HEK293-pcDNA3.1 (células de control) con nilotinib y paclitaxel también mejoró la sensibilidad a paclitaxel (un cambio de 2,5 veces en las células HEK293-pcDNA3.1), esta sensibilidad mejorada fue significativamente menor que la determinada para las células transfectadas MRP7 (Tabla 1; Fig. 3C). Por el contrario, otro BCR-Abl TKI, dasatinib a 2,5 M, no mejoró significativamente la sensibilidad paclitaxel, ya sea en células HEK-MRP7-2 (Tabla 1, Fig. 3C)
.
Dos HEK293-pcDNA3.1 o líneas celulares, HEK293-pcDNA3.1 y HEK-MRP7-2, se representan como HEK293 y MRP7, respectivamente. Después de la siembra y el cultivo de células durante 24 h, la misma cantidad de PBS o los agentes de reversión se añadieron en células HEK293-pcDNA3.1 (mostrada como y, respectivamente) y células HEK-MRP7-2 (mostrada como y, respectivamente) 1 h antes de la adición de paclitaxel. Las diversas concentraciones de paclitaxel se indican en la figura. La concentración final de imatinib, nilotinib o dasatinib fue de 2,5 mM. La figura anterior muestra un resultado representativo de imatinib, nilotinib o dasatinib.
Además de paclitaxel, que también examinó el efecto de la ITC seleccionado para sensibilizar a las células a otro medicamento contra el cáncer, vincristina. De manera similar a los hallazgos con paclitaxel, nilotinib e imatinib (1, 2,5 y 5 M) invirtió significativamente la resistencia a vincristina MRP7 mediada (2.1-, 6.8- y 9.0 veces, respectivamente, para el nilotinib; 2.4-, 6.9- y 8.2 veces , respectivamente, para imatinib) de una manera dependiente de la concentración (Tabla 1). También se examinó la respuesta de las células MRP7 transfectadas a otro fármaco contra el cáncer, doxorrubicina, en presencia de imatinib, como la doxorrubicina no es un sustrato de MRP7 [23]. Nuestros resultados indican que imatinib (1, 2,5 y 5 M) no sensibilizar significativamente la respuesta de control de los padres células HEK293-pcDNA3.1, o la resistencia en las células transfectadas HEK-MRP7-2, (Tabla 1) inversa a la doxorrubicina. Esto indica que la respuesta a estos TKIs fue específico para MRP7, como la doxorrubicina no es un sustrato para MRP7 y por lo tanto no mediar flujo de salida de la doxorrubicina. La doxorubicina es un sustrato de la P-gp, MRP1 y BCRP, pero tampoco imatinib ni nilotinib aumenta significativamente la sensibilidad de las células HEK doxorrubicina-MRP7-2, lo que sugiere que la P-gp, MRP y BCRP no contribuyen significativamente a la resistencia a los medicamentos de HEK MRP7-2.
En general, el imatinib y nilotinib invierten significativamente la resistencia mediada por MRP7 a paclitaxel y vincristina, doxorrubicina, pero no. Además, esta inversión era dependiente de la concentración (Tabla 1; Fig. 3). Aunque un aumento en la sensibilización de las células de control HEK293-pcDNA3.1 se produjo tras la exposición a nilotinib o imatinib, este efecto fue significativamente menor que la determinada para las células HEK-MRP7-2 transfectadas (Tabla 1; Fig. 3).
3.4. Los efectos de imatinib y nilotinib sobre la acumulación intracelular y flujo de salida de [
3H] -paclitaxel
Con el fin de determinar el mecanismo por el cual imatinib y nilotinib surmount o resistencia paclitaxel MRP7 mediada inversa, su efecto sobre la la acumulación de [
3H] -paclitaxel en células MRP7 transfectadas se examinó. La concentración intracelular de [
3H] -paclitaxel en las células HEK-MRP7-2 era 30% de la acumulada por las células HEK293-pcDNA3.1 (Fig. 4). La acumulación de paclitaxel fue significativamente mayor (1,9 veces) en células HEK-MRP7-2 (P & lt; 0,05) después de la incubación de las células, ya sea con imatinib o nilotinib a una concentración de 5 mM. En las células HEK293-pcDNA3.1, imatinib, pero no nilotinib, había dado lugar a un ligero aumento en la concentración intracelular de [
3H] -paclitaxel, pero esta sensibilización era modesto en comparación con el efecto de imatinib en células HEK-MRP7- 2 células.
las acumulaciones intracelulares de paclitaxel en células HEK-MRP7-2 HEK293-pcDNA3.1 y se midieron después de la incubación con 0,1 M de paclitaxel. La acumulación intracelular de paclitaxel en células HEK293-pcDNA3.1 en ausencia de imatinib y nilotinib se muestra en las barras izquierda (▪). La acumulación intracelular de paclitaxel en presencia de 5 M de imatinib en células HEK293-pcDNA3.1 se muestra a la derecha (□). La acumulación intracelular de paclitaxel en las células HEK-MRP7-2 en presencia de 5 M de nilotinib se muestra a la derecha (). Cada columna representa el medio (± SD). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. * P & lt; 0,05, prueba de la t de Student
Sobre la base de los resultados anteriores, es posible que el aumento de paclitaxel intracelular producida por imatinib y nilotinib podría ser debido a: (1) una disminución en la. flujo de salida de paclitaxel y /o, (2) un aumento en la absorción de paclitaxel. Por lo tanto, se llevó a cabo el siguiente experimento para determinar si el aumento en la acumulación de paclitaxel producido por imatinib y nilotinib era debido a una inhibición de flujo de salida de paclitaxel. células HEK-MRP7-2 y las células HEK293-pcDNA3.1 fueron incubadas con paclitaxel y un curso de tiempo para la acumulación intracelular de los fármacos se determinó (Fig. 5). Como era de esperar, las células HEK-MRP7-2 a conocer un porcentaje significativamente mayor de paclitaxel acumulada en comparación con las células HEK293-pcDNA3.1, y la cantidad de paclitaxel que se effluxed aumentó con el tiempo. La acumulación paclitaxel a 0 min de flujo de salida de fármaco se establece como 1. En 60 min, en las células incubadas en medio libre de fármaco, ~ 60% de la paclitaxel acumulada se exportó a partir de células HEK-MRP7-2 en ausencia de imatinib o nilotinib . En contraste, casi todo el paclitaxel estaba presente dentro de las células HEK-MRP7-2 incubadas con imatinib o nilotinib a una concentración final de 5 mM durante diferentes períodos de tiempo. Para las células de control, la concentración de paclitaxel sometido a flujo de salida también aumentó con el tiempo, pero el nivel de flujo de salida de solamente fue ligeramente menor que la observada en las células transfectadas con MRP7. Por el contrario, en las células HE293-pcDNA3.1, ~ 30% de la paclitaxel fue liberado después de 60 min en ausencia de los compuestos de ensayo. La incubación de las células HEK293-pcDNA3.1 con imatinib o nilotinib (5 M) también inhibió el flujo de salida de paclitaxel, aunque la magnitud del efecto fue significativamente menor que la observada para las células HEK-MRP7-2.
el porcentaje de paclitaxel liberado se representa como una función de tiempo. Después de 1 h de incubación de la TKIs, [
3H] -paclitaxel fue co-incubaron en HEK293-pcDNA3.1 con TKI () o sin TKI (), y mientras tanto en las células HEK-MRP7-2 con TKI () o sin TKI (). Las células se lavaron y se re-incubaron en medio libre de paclitaxel. En los puntos de tiempo de 0 min, 20 min, 60 min y 120 min, se recogieron las células y los niveles de [
3H] -paclitaxel se determinaron por recuento de centelleo. Los valores a 0 min de flujo de salida de drogas se establecen como 1 para la comparación con los valores medidos de otros puntos de tiempo. Cada punto representa el medio (± DE) de tres experimentos separados realizado utilizando muestras por triplicado.
Discusión
Este estudio fue el primero en identificar que el imatinib BCR-Abl ITC y nilotinib , pero no dasatinib, podría revertir MRP7 mediada por MDR de una manera dependiente de la concentración.
HEK293 células transfectadas con el gen recombinante MRP7 HEK-MRP7-2, y las células HEK293-pcDNA3.1 transfectadas con el vector vacío, se utilizaron para las pruebas de la función MRP7 flujo de salida. Estas líneas celulares transfectadas se han utilizado previamente en estudios diseñados para determinar los efectos de cefarantina en la inversión de la resistencia MRP7 mediada a paclitaxel [9]. En este estudio, el análisis de transferencia Western confirmó que la transfección de células con MRP7 tuvo éxito, como proteínas MRP7 se expresaron sólo en las células HEK-MRP7-2, y no en las células HEK293-pcDNA3.1 (Fig. 2). Las líneas celulares se expusieron a exactamente las mismas condiciones y procedimientos experimentales, y se cultivaron con los mismos fármacos antineoplásicos para el mismo tiempo de incubación. Se puede argumentar que las células transfectadas expresan MRP7 otras proteínas, además de MRP7, tales como P-gp, que pueden haber contribuido a la MDR. Sin embargo, el análisis de transferencia Western indicó que ni la línea celular de control HEK293-pcDNA3.1, ni la HEK-MRP7-2 transfectadas línea celular, expresaron niveles detectables de P-gp (Fig. 2), que también pueden mediar MDR. Además, MRP1 y BCRP fueron indetectables tanto en el control HEK293-pcDNA3.1 y transfectadas las células HEK-MRP7-2 a través de análisis de transferencia de Western (datos no presentados). Por lo tanto, estos resultados indican que la HEK-MRP7-2 transfectadas línea celular expresa específicamente MRP7, pero no P-gp, MRP, o BCRP.
Anteriormente, se ha informado de que cefarantina y nilotinib invierten significativamente P- gp mediada por MDR en las células HEK-MRP7-2 [9] y las líneas celulares que sobreexpresan BCRP [24], respectivamente. Desde MRP7 y P-gp son similares en estructura y actividad funcional, hemos diseñado experimentos para determinar si nilotinib podría revertir la resistencia a fármacos MRP7 mediada a paclitaxel. Debido a la similitud estructural entre MRP7 y P-gp, un estudio anterior indicó que algunos inhibidores de la P-gp fueron capaces de revertir significativamente la resistencia a paclitaxel en células HEK-MRP7-2 sobreexpresan MRP7 [9]. Se encontró que nilotinib (2,5 M) de las células HEK293 transfectadas sensibilizadas MRP7-significativamente a paclitaxel ya que disminuyó notablemente la IC
50 de paclitaxel en células MRP7-trasnfected, en comparación con las células control. Aunque nilotinib es un inhibidor de P-gp [24], esto no es un factor de confusión en los experimentos como la proteína P-gp no se expresa en células HEK-MRP7-2 HEK293-pcDNA3.1 o (Fig. 2) .
en este estudio, se encontró que los ITC específicas: 1) se redujo significativamente la resistencia a paclitaxel en células que sobreexpresan MRP7 (Tabla 1; la figura 3), 2) no sensibilizar significativamente la respuesta a paclitaxel en el vacío. vector células transfectadas, pero el efecto fue significativamente menor que en las células transfectadas MRP7 (Fig. 3), y 3) no inhibió de manera significativa o inducir la expresión MRP7 (Fig. 2C y D). En general, estos hallazgos sugieren tentativamente que la de los TKIs utilizados en este estudio, imatinib y nilotinib son capaces de revertir la resistencia a MRP7 mediada por la inhibición de la función de MRP7. Entre los TKIs que se ensayaron frente a paclitaxel, el imatinib BCR-Abl TKIs y nilotinib a 5 micras invertido completamente resistencia paclitaxel MRP7 mediada por una magnitud de 12,5 y 21,0 veces, respectivamente (Tabla 1). Por el contrario, otro BCR-Abl TKI, dasatinib, no produjo una inversión significativa de la resistencia a paclitaxel MRP7 mediada (Tabla 1; la Fig. 3C). Actualmente, la explicación de la diferencia entre dasatinib en comparación con nilotinib o imatinib queda por determinar. Un enfoque potencial que puede arrojar luz sobre este problema sería la de relación estructural-actividad (SAR). Sobre la base de sus estructuras químicas (Fig. 1), dasatinib carece de un anillo de 2-fenilaminopirimidina que está presente en las estructuras de nilotinib e imatinib. Es posible que la ausencia de este anillo en dasatinib podría ser un factor importante que diferencia actividad dasatinib de la de cualquiera de nilotinib o imatinib.