Extracto
En los mamíferos, el generador central de ritmo circadiano se compone de las interacciones entre los genes del reloj, incluyendo
Per1 /2/3
,
Cry1 /2
,
Bmal1
, y
Reloj
. alteración del ritmo circadiano puede conducir a mayor riesgo de cáncer en los seres humanos, y la desregulación de los genes del reloj se ha implicado en muchos tipos de cánceres. Entre estos genes,
Per2
se informa que tiene propiedades supresoras de tumores, pero se sabe poco acerca de la correlación entre el
Per2
y HIF, que es el principal objetivo de la terapia de carcinoma de células renales (RCC) . En este estudio, la expresión rítmica de la
Per2
gen no era detectable en líneas celulares de cáncer renal, con la excepción de Caki-2 células. En Caki-2 células, HIF1α aumentó la amplitud de
Per2
oscilación uniéndose directamente al sitio de unión de HIF-se encuentra en la
Per2
promotor. Estos resultados indican que HIF1α puede aumentar la amplitud de la
Per2
ritmo circadiano
Visto:. Okabe T, M Kumagai, Nakajima Y, Shirotake S, K Kodaira, Oyama M, et al. (2014) El impacto de la HIF1α en el
Per2
ritmo circadiano en líneas celulares de cáncer renal. PLoS ONE 9 (10): e109693. doi: 10.1371 /journal.pone.0109693
Editor: Shin Yamazaki, Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Enero, 2014; Aceptado: 12 de septiembre de 2014; Publicado: 21 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Okabe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de células renales (CCR) es el más común malignidad del riñón adulto, que representa aproximadamente el 2% de los cánceres en todo el mundo [1]. Una mutación somática de la enfermedad de Von Hippel-Lindau (
BVS
) gen es el cambio genético más frecuente observada en RCC [2], y los esfuerzos recientes se han dirigido al factor inducible por hipoxia-BVS (HIF) mediada por la hipoxia inducida por vía de gen para la terapia RCC [3]. HIF son factores de transcripción heterodiméricos con dos subunidades estructuralmente relacionadas: una subunidad HIFa sensible al oxígeno y una HIFß expresado constitutivamente o receptor de aril hidrocarburos translocador nuclear (ARNT) subunidad [4]. En normoxia, moléculas HIFa se someten a un proceso de regulación relativo a la hidroxilación enzimática de residuos prolil y asparaginilo conservadas, lo que lleva a un rápido VHL proteína mediada por la ubiquitinación y la degradación proteasomal [5]. Hipoxia o mutaciones en el
BVS
inactivan el gen de esta vía. Aumento de la actividad HIFa regula por incremento genes implicados en muchos aspectos de la progresión del cáncer, incluida la adaptación metabólica, resistencia a la apoptosis y la angiogénesis [3]. En RCC, redes vasculares intensa tumorales se pueden atribuir a la acumulación inapropiada de HIFa que conduce a la inducción del gen angiogénico. Factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) es uno de los factores pro-angiogénicos más potentes, cuya expresión es transactivado por HIF1α /ARNT través de la unión al elemento de respuesta hipoxia (HRE) en el
Vegf
promotor [6] , [7]. El aumento de expresión de VEGF también se asocia con la progresión maligna y un resultado de tratamiento pobre [8]. Por lo tanto, la supresión de la vía gen HIF mediada puede ser una estrategia terapéutica importante para el tratamiento de RCC [3].
Muchos procesos fisiológicos, bioquímicos y de comportamiento están bajo la regulación circadiana, que se genera por un tiempo interno mecanismo manteniendo así se hace referencia como el reloj biológico en casi todos los organismos desde las bacterias hasta los mamíferos [9], [10]. Los ritmos circadianos son controlados por determinados genéticamente redes de retroalimentación de transcripción-traducción bucles que involucra genes del reloj, incluyendo
Per1 /2/3
,
Cry 1/2
,
Bmal1
, y
Reloj
[11]. Un tema común ritmicidad circadiana subyacente es que las oscilaciones de la transcripción de genes de reloj son la consecuencia de los bucles de retroalimentación de transcripción-traducción intracelulares. Por ejemplo, en los mamíferos, los factores de transcripción y RELOJ heterodimerizan BMAL1 y activan la expresión de tres
Por
genes y dos
Cry
genes mediante la unión a elementos de E-box en sus promotores. Los productos proteicos de estos genes multimerize y trasladar al núcleo, donde las proteínas PER y CRY reprimen la actividad transcripcional del dímero-RELOJ BMAL1 [12], [13].
Entre estos genes reloj,
per2
es responsable de establecer el período de oscilación [14]. Por otra parte,
Per2
tiene propiedades supresores de tumores y, a menudo está mutado o downregulated en los cánceres de mama humanos [15], [16]. En el cáncer renal, alteraciones en la expresión de la
Per2
gen se informa, involucrados en la aparición de la enfermedad y la progresión, pero el mecanismo molecular responsable sigue siendo poco clara [17].
En este estudio, se midieron los niveles de
Per2
actividad promotora y el ARNm en ocho líneas celulares de cáncer renal después del tratamiento con dexametasona. El
Per2
promotor de la actividad y el nivel de ARNm oscilar en un ciclo de aproximadamente 24 h en células Caki-2, que contienen BMAL1, el reloj y las proteínas HIF1α. También se encontró que HIF1α aumento de la amplitud de la oscilación uniéndose directamente al elemento HRE-como se encuentra en la
Per2
promotor. Estos resultados muestran que HIF1α puede afectar a la amplitud de
Per2
ritmos circadianos en líneas celulares de cáncer renal.
Materiales y Métodos
Las células y cultivos celulares, productos químicos y enzimas
Establecido (A704, ACHN, 786-O, A498, 769-P, y Caki-2) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). RCC4 + vector solo y RCC4 + VHL se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Estas líneas de células renales se mantuvieron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medio (Kojin Bio, Tokio, Japón) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), 24 U /ml de penicilina y 25 mg /ml de estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) en un incubador humidificado estándar a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2. También utilizamos el de fibroblastos de ratón NIH3T3 y modelos celulares de osteosarcoma U2OS humanas del reloj circadiano autónoma [18], [19]. Estas líneas celulares también se obtuvieron de ATCC, y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado con 10% FBS, penicilina (24 U /ml) y estreptomicina (25 mg /ml). Chrysin fue adquirido de Sigma, y su pureza superó 96%. Una solución madre de crisina se preparó en dimetilsulfóxido (DMSO). Chrysin se disolvió en DMSO a tres concentraciones diferentes (1, 10, y 100 mM) y se añadió cada uno de 2 l a 2 ml de medio de cultivo (concentración final; 1, 10, 100 mM). Las células se trataron con medio de cultivo que contiene 1, 10, crisina 100 M o misma concentración de DMSO como control durante 2 horas.
plásmido construcción
Para construir vectores informadores que llevan el m
Per2
promotor, el m
Per2
fragmento del promotor (-279 a 112 pb, donde 1 indica el sitio de inicio de transcripción putativo) fue la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) -amplified del genoma del ratón C57BL /6J , y se clonó en el sitio NheI /XhoI de pGL3 básico (Promega, Madison, WI, EE.UU.). La luciferasa de luciérnaga (Fluc) fue sustituido por el
Nco I y
Xba I fragmento de
pSV40-dFLuc, lo que resulta en m
Per2
-dFLuc. El m-HRE mutante
Per2
promotor reportero se generó con PCR inversa usando un equipo de KOD-Plus-Mutagénesis (Toyobo, Osaka, Japón).
informes en tiempo real del gen circadiano reguladas expresión usando la bioluminiscencia de la luciferasa
se sembraron Todas las células (5 × 10
4 por placa) en una placa de 35-mm 2 días antes de la transfección, y el plásmido reportero se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Se determinó la cantidad apropiada de plásmido indicador para cada línea celular de acuerdo con las diferencias en la eficiencia de transfección entre las líneas celulares. Un día después de la transfección, las células fueron tratadas con 100 nM de dexametasona (Nakalai Tesque, Kyoto, Japón) durante 2 h, y el medio se reemplazó con en ausencia de rojo de fenol suplementado con 10% de FBS y 100 mM D-luciferina medio (Toyobo ). La bioluminiscencia se midió a 37 ° C bajo una CO 5%
2 atmósfera y se integró durante 1 min a intervalos de 10 minutos utilizando un luminómetro de tipo plato, AB-2550 de Kronos Dio (ATTO, Tokio, Japón) [20], [21]. actividad bioluminiscencia se expresó como unidades de luz relativas (RLUs). Cada experimento se repitió al menos cuatro veces. Las células se cultivaron en el luminómetro durante al menos 4 días, mientras que el instrumento cuenta su bioluminiscencia. Los datos brutos obtenidos (intervalos de 10 min) fueron suavizadas por un 10-punto que se mueve método de la media y sin tendencia restando una media móvil de 12 horas a partir de los datos suavizados [21].
Análisis de los ritmos circadianos usando bioluminiscencia
para probar la importancia de la ritmicidad circadiana y para calcular los parámetros circadianos (es decir, período, amplitud y acrophase), se realizó el análisis de datos informatizada en el software Cosinor descargado desde el ritmo circadiano de laboratorio (Walterboro, Carolina del Sur, EE.UU.) de software página de inicio (http://www.circadian.org/software.html) [22], [23]. parámetros circadianos se calcularon utilizando los datos de 1-5 días después del tratamiento con dexametasona.
captura de imágenes y análisis automatizado
Se sembraron células NIH3T3 (5 × 10
4 por pocillo) en 6- placas de pocillos 1 día antes de la transfección, y el plásmido de expresión se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Un día después de la transfección, las células fueron tratadas con 100 nM de dexametasona (Nakalai Tesque) durante 2 h, y el medio se reemplazó con en ausencia de rojo de fenol suplementado con 10% FBS medio. Las células se tiñeron con 0,1 mg /ml Hoechst 33342 (Invitrogen) durante 1 hora y se analizaron usando ArrayScan XTI (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.).
La cuantificación de ARNm por tiempo real de RT-PCR
Todas las células se recogieron a intervalos de 4 h de seis placas en cada punto de tiempo que comienza 24 horas después del tratamiento con dexametasona. El ARN total de estas células fue extraído utilizando ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japón) y se transcribió inversamente.
Per2
y
Gapdh
transcripciones fueron cuantificados usando un ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). PCR se realizó usando el One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio, Kyoto, Japón) con los siguientes parámetros de ciclo térmico: 94 ° C durante 5 min seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 20 s y 62 ° C durante 1 minuto. El
Gapdh Versión taquigráfica se utilizó para normalizar la expresión de cada transcripción. importancia ritmicidad circadiana se analizó usando el software Cosinor (circadiano Laboratorio Ritmo) [22], [23]. Los cebadores para cada gen se diseñaron basándose en la información disponible en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Las secuencias de los cebadores de PCR fueron las siguientes:
Per2 gratis (GenBank adhesión no, NM_022817; amplicón, 85 pb.): Cebador sentido 5'-CACACACAGAAGGAGGAGCA-3 'y el cebador antisentido 5' AGTAATGGCAGTGGGACTGG-3 '
Gapdh gratis (GenBank adhesión no, M33197; amplicón, 185 pb.):. cebador sentido 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3' y el cebador antisentido 5'-3-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG '.
luciferasa ensayo
se utilizaron células NIH3T3 transfectadas para ensayos de luciferasa. Un día antes de la transfección, se sembraron las células (5 × 10
4 por pocillo) en placas de 24 pocillos que contenían DMEM suplementado con 10% FBS, penicilina (24 U /ml) y estreptomicina (25 mg /ml). Las células se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Para cada muestra, se añadió ADN transfectado a cada pocillo. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se rompieron con 100 l de tampón de lisis pasivo (Promega). Se determinó la actividad luciferasa utilizando un Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega) y un luminómetro Ascenso FS II (Thermo Scientific).
Western Blot
Todas las células se sincronizan mediante tratamiento con dexametasona 100 nM para 2 h. A continuación, el medio se reemplazó con medio fresco. Después de 24 h de incubación, estas células se lisaron en la célula lítico-MT (Sigma). Los lisados celulares se centrifugaron a 15.000 rpm a 4 ° C durante 10 min. Los sobrenadantes se almacenan como extractos de células enteras a -80 ° C hasta su uso. Para la transferencia Western, 20 g de proteína se resolvieron en 7,5% de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAA) geles y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las membranas fueron bloqueadas con solución salina tamponada con Tris (TBS) Tween que contiene 5% sin grasa leche en polvo. Las proteínas se detectaron utilizando anticuerpos contra HIF1α (dilución 1: 500; BD Transducción Laboratories, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.), PER2 (dilución, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), CRY1 (dilución, 1:2000; Santa Cruz Biotechnology), reloj (dilución, 1:1000; Thermo Scientific), GAPDH (dilución, 1:10000; Sigma), y BMAL1 (dilución, 1:100; anticuerpo monoclonal de ratón generado en nuestro laboratorio). Se realizó cuatro replicados Western blots; Se muestra una mancha representante
chip de ensayo
chip experimentos se llevaron a cabo utilizando un kit disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Magna-chip; Millipore, Bedford, MA, EE.UU.).. En pocas palabras, Caki-2 células se sembraron en placas de diámetro de 100 mm (5 × 10
4 células por placa); después de 24 h, las células se incubaron con formaldehído (concentración final, 1%) durante 10 min a 37 ° C a las proteínas de enlace transversal al ADN. formaldehído sin reaccionar se inactivó con 1 ml de 10 × glicina. La placa se lavó dos veces con PBS enfriado en hielo y los sedimentos se recogieron en 1 ml de PBS con cóctel inhibidor de la proteasa y se agruparon juntos en un tubo de 1,5 ml. La cromatina reticulada se cortó por sonicación de 20 veces durante 1 min cada vez con 1 min de enfriamiento en hielo entre pulsos usando un Branson 2510 limpiador ultrasónico (Branson, Danbury, CT, EE.UU.). Inmunoprecipitación (IP) se realizó con 5 g de cualquiera de anti-HIF1α (dilución, 1: 500; Novus Biologicals, Inc., Littleton, CO, EE.UU.) o anticuerpo anti-IgG (Millipore) como un control negativo. Los lavados y la elución del ADN IP se realizaron de acuerdo con el protocolo Magna-chip (Millipore). El diez por ciento (10%) del ADN de la cromatina esquilada original fue de manera similar inversa reticulado y purificada, y se utilizó el ADN recuperado como un control de entrada. Se realizó la PCR con cebadores específicos que flanquean la secuencia HRE-como dentro de la región promotora del ser humano
Per2
gen (-476 a -284 pb, sentido: 5'-ACGCCGGAAGTGGATGAGAC 3 'y antisentido: 5' CGACTCCGTCTCATCTGCATACAT -3 ') con los siguientes parámetros de ciclo térmico: 94 ° C durante 3 min, seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 20 s, hibridación a 59 ° C durante 30 s y extensión a 72 ° C durante 30 s.
El análisis estadístico
Cada experimento se repitió al menos cuatro veces. Los datos se expresan como medias ± error estándar. Para evaluar la importancia de las diferencias, Estudiante de
t-test se realizó
. Se utilizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para las comparaciones entre los grupos de concentración de fármaco, seguido de la aplicación de pruebas post hoc de Tukey. Para todos los análisis, el nivel de significación se fijó en
P Hotel & lt; 0,05. El software Cosinor (Laboratorio del ritmo circadiano) [22], [23] se utilizó para analizar la ritmicidad circadiana.
Resultados
expresión circadiana de la
Per2
gen en el cáncer renal líneas celulares
Para explorar la oscilación de la transcripción de
Per2
, todas las líneas celulares fueron transfectadas con un gen reportero de luciferasa dirigido por el
Per2
promotor, y una monitorización en tiempo real ensayo se realizó utilizando Kronos Dio (AB-2550; ATTO). Un promotor de luciferasa-atado en Caki-2 células muestra los ritmos circadianos después de 2 h de tratamiento con dexametasona (Fig. 1A, Tabla 1), pero la ritmicidad no se detectó en las otras líneas celulares (Fig. S1). Cada experimento se repitió cuatro veces y los resultados fueron consistentes. 24 h después del tratamiento con dexametasona,
Per2
niveles de mRNA tenía un ritmo circadiano en Caki-2 células (Fig. 1B, Tabla 1). Estos resultados mostraron que el ritmo circadiano de la
Per2
gen no era detectable en líneas celulares de cáncer renal, excluyendo Caki-2 células.
Todas las líneas celulares de cáncer renal (A) se transfectaron con el reportero promotor Per2 (2 g) y la bioluminiscencia entonces se midió usando un ensayo de monitoreo en tiempo real. monitoreo en tiempo real de la actividad de la luciferasa de la
Per2
promotor mostró que la actividad osciló durante un ciclo de aproximadamente 24 h. Se muestran las actividades de luciferasa de cuatro muestras replicadas. Estos cultivos mostraron ritmos circadianos significativa (Tabla 1). (B) los niveles de ARNm de
Per2
fueron determinados por PCR en tiempo real durante seis placas en cada momento. El ARN total se extrajo de cada 4 h, a partir de 24 h después del tratamiento con dexametasona para un ciclo de 24 h, y
se cuantificaron Per2
transcripciones. Las barras de error indican los errores estándar de los valores medios (
n
= 6). Los datos de un solo 24 horas después del tratamiento con dexametasona se analizaron usando el software Cosinor para ritmicidad (Tabla 1). (C) La estructura de la
Per2
promotor y un análisis de los posibles motivos de unión del factor de transcripción-en esta región. La región de 2.994 pb que contiene una secuencia de E-caja (CACGTT) y una secuencia de HRE-como (ATGTG), similar a la secuencia de consenso HRE (ACGTG) situado aguas arriba del sitio de inicio de transcripción (TSS). (D) La comparación de secuencias: línea superior, secuencia de ratón; línea inferior, secuencia humana. La secuencia de nucleótidos de los posibles motivos de unión del factor de transcripción-de-secuencia E en forma de caja y la secuencia HRE-como se conservan 100% entre el ratón y humano.
Análisis de la
Per2
región promotora
un estudio previo demostró que una secuencia de e-caja (CACGTT) y su región aguas abajo son esenciales para la oscilación de la transcripción de
Per2
, un componente crucial de los relojes moleculares [24]. Nos centramos en esta región E-caja y EDH. Los motivos de unión del factor de transcripción-ubicados en el
Per2
promotor en ratones y seres humanos fueron analizados utilizando el software MatInspector (Genomatix, Munich, Alemania). Análisis de secuencias de la
Per2
región promotora reveló una alta homología entre los ratones y los seres humanos. El análisis de secuencia reveló también una secuencia E-caja (CACGTT) y una secuencia de HRE-como (ATGTG), similar a la secuencia de consenso HRE (ACGTG) [25] que se encuentra aguas arriba del sitio de inicio de transcripción (TSS) (Fig. 1C ). Estas secuencias fueron 100% conservado entre ratones y seres humanos (Fig. 1D). Un ensayo de monitoreo en tiempo real (fig. 1A) indicó que la región promotora hemos clonado es suficiente para producir una oscilación circadiana transcripcional en líneas celulares humanas.
La expresión de los genes del reloj en líneas celulares de cáncer renal
Para examinar la diferencia entre otras líneas celulares Caki-2 y, se analizó la expresión de BMAL1, RELOJ, PER2, y las proteínas CRY1. células Caki-2, 786-O, y A498 expresan la proteína BMAL1. Todas las líneas celulares de cáncer renal expresaron RELOJ y proteínas CRY1, pero no expresan la proteína PER2 (Fig. 2A). borrones de longitud completa de PER2 y BMAL1, además de un control positivo, se presentan en la Figura S2, S3.
Todas las líneas celulares se lisaron y se cosecharon 24 h después de la sincronización por 2-h tratamiento con dexametasona. Se realizó cuatro replicados Western blots; Se muestra una transferencia de tipo representativo. (A) se muestran transferencias de Western de extractos de células enteras de cáncer renal (20 g) con BMAL1, RELOJ, PER2, CRY1 y anticuerpos GAPDH. borrones de longitud completa de PER2 y BMAL1, además de un control positivo, se presentan en la Figura S2, 3. (B) transferencias Western de extractos de células enteras de cáncer renal (20 g) con HIF1α y anticuerpos GAPDH se muestran.
expresión de la proteína HIFa en condiciones de normoxia en líneas celulares de cáncer renal
Dado que la proteína HIF1α puede ser generalmente sobreexpresada en el CCR, que también examinó la expresión de la proteína HIF1α. En Caki-2 y RCC4 + vector solo, la proteína se sobreexpresa HIF1α (Fig. 2B). Teniendo en cuenta los resultados que el
Per2
ritmo circadiano se demostró sólo en Caki-2 células, que contenían BMAL1, el reloj y la proteína HIF1α, es posible que HIF1α está relacionado con el
Per2
circadiano ritmo en líneas celulares de cáncer renal.
el impacto de HIF1α en
Per2
actividad transcripcional
Para examinar el impacto de HIF1α en
Per2
actividad transcripcional, células NIH3T3 y U2OS fueron transfectadas con un gen reportero de luciferasa dirigido por el
Per2
promotor y co-transfectadas con
Hif1α
y
Arnt
vector de expresión. La co-transfección con HIF1α /ARNT aumento de la amplitud de oscilación y no tenía ninguna influencia en el período o acrophase de oscilación en estas líneas celulares (Fig. 3A-D, Tabla 2). Los mismos resultados se observaron en Caki-2 células (Fig. 3E, F, Tabla 2).
células (A) NIH3T3 fueron co-transfectadas con el
Per2
promotor reportero (400 ng ) y los plásmidos de expresión indicados (300 ng) para HIF1α /ARNT o pcDNA3 vector vacío (600 ng) como control. entonces bioluminiscencia se midió usando un ensayo de monitoreo en tiempo real. Control, transfectadas con el vector vacío pcDNA3 (control no clonado en vectores); + HIF1α /ARNT, transfectadas con los plásmidos de expresión. se muestran las actividades de luciferasa de cuatro muestras replicadas. se muestra (B) Detrended bioluminiscencia. Periodo, la amplitud y acrophase de las oscilaciones se midió en los días 2 a 5 utilizando el software de Cosinor (Laboratorio ritmo circadiano). Amplitud aumentó significativamente (media ± SEM,
n
= 4) en comparación con el control (
p Hotel & lt; 0,01, Estudiante de
t-
prueba). Véase la Tabla 2. Las células U2OS (C) fueron co-transfectadas con el
Per2
promotor reportero (400 ng) y los plásmidos de expresión indicados (300 ng) para HIF1α /ARNT o pcDNA3 vector vacío (600 ng) como un control. entonces bioluminiscencia se midió usando un ensayo de monitoreo en tiempo real. Control, transfectadas con el vector vacío pcDNA3 (control no clonado en vectores); + HIF1α /ARNT, transfectadas con los plásmidos de expresión. se muestran las actividades de luciferasa de cuatro muestras replicadas. se muestra (D) Detrended bioluminiscencia. Periodo, la amplitud y acrophase de las oscilaciones se midió en los días 2 a 5 utilizando el software de Cosinor (Laboratorio ritmo circadiano). Amplitud aumentó significativamente (media ± SEM,
n
= 4) en comparación con el control (
p Hotel & lt; 0,01, Estudiante de
t-
prueba). Véase la Tabla 2. Caki-2 células (E) fueron co-transfectadas con los
Per2
promotor reportero (2 g) y los plásmidos de expresión indicados (1,5 g) para HIF1α /ARNT o pcDNA3 vector vacío (3 g ) como un control. A continuación, la bioluminiscencia se midió usando un ensayo de monitoreo en tiempo real. Control, transfectadas con el vector vacío pcDNA3 (control no clonado en vectores); + HIF1α /ARNT, transfectadas con los plásmidos de expresión. Se muestran las actividades de luciferasa de cuatro muestras replicadas. se muestra (F) Detrended bioluminiscencia. Período, amplitud, y acrophase de las oscilaciones se mide desde días 2-5 usando el software Cosinor (Laboratorio ritmo circadiano). Amplitud aumentó significativamente (media ± SEM,
n
= 4) en comparación con el control (
p Hotel & lt; 0,01, Estudiante de
t-test
). Véase la Tabla 2.
HIF1α no tiene ningún efecto en el número de células NIH3T3
Para determinar si HIF1α mejorar la amplitud de oscilación de
Per2
actividades promotoras aumentando el número de células, se realizó el recuento de células mediante el uso de ArrayScan XTI (Thermo Scientific). La co-transfección con HIF1α /ARNT no tuvo influencia en el número de células NIH3T3 (Fig. 4). Esto indica que HIF1α /ARNT aumentó la bioluminiscencia de
Per2
promotor de las actividades que no afectan al número de células.
Las células NIH3T3 se co-transfectadas con el reportero promotor Per2 (400 ng) y el indicado plásmidos de expresión (300 ng) para HIF1α /ARNT o pcDNA3 vector vacío (600 ng) como control. Las placas se leyeron en el ArrayScan XTI (Thermo Scientific) durante el tiempo indicado recuento de células después del tratamiento con dexametasona. El número de células viables no fueron afectados por HIF1α /ARNT en todos los puntos (media ± SEM,
n = 6
,
t de Student
).
HIF1α se une directamente a la secuencia HRE-como en el
Per2
promotor
para determinar si HIF1α afectada
Per2
la transcripción a través del elemento HRE-como, un putativo HIF1α- secuencia de unión, se examinaron los efectos de HIF1α /ARNT en
Per2
expresión usando un ensayo de luciferasa en células NIH3T3. HIF1α /ARNT aumentado
Per2
actividad transcripcional, pero no tuvo ningún efecto sobre la EDH-mutante
Per2
promotores (Fig. 5A, B). CoCl
tratamiento 2 induce la expresión HIF1α mediante la unión al dominio PAS, lo que resulta en la obstrucción de HIF1α-pVHL de unión y estabilidad de ese modo HIF1α [26], [27]. Para investigar el efecto de CoCl
2 inducida por la sobreexpresión HIF1α en
Per2
actividad transcripcional, las células fueron tratadas con CoCl
2. CoCl
2 upregulated
Per2
la transcripción pero no tuvo efecto sobre el HRE-mutante
Per2
promotor (Fig. 5C). Estos resultados sugieren que la secuencia HRE-como en el
Per2
promotor clonado respondió a HIF1α sobreexpresión. Para investigar si HIF1α se une directamente a la secuencia HRE-como en el
Per2
promotor
in vivo
, se realizó un chip de ensayo. Reticulado Caki-2 células se inmunoprecipitaron con anticuerpo de conejo anti-HIF1α o IgG de conejo normal. Los inmunoprecipitados resultantes se analizaron mediante ensayos de PCR usando cebadores que flanquean las secuencias HRE-como (-476 a -284 pb) del
Per2
promotor. Se observó un aumento notable en la intensidad de la banda de ADN para el conejo anti-HIF1α anticuerpo (Fig. 5D, carril 3), pero no para la IgG normal de conejo (Fig. 5D, carril 2). Estos resultados indican que puede aumentar HIF1α
Per2
actividad transcripcional uniéndose directamente al elemento HRE-like y mejorar la amplitud de oscilación de
Per2
actividades promotoras.
(A ) representación esquemática del ratón
Per2
promotor. El área superior representa el ratón de tipo salvaje
Per2
promotor y la zona inferior representa el HRE-mutante
Per2
promotor. (B) HIF1α /ARNT potentemente inducida
Per2
actividad promotora. La
Per2
promotor y el HRE-mutante
Per2
reportero promotor (60 ng) fueron co-transfectadas con los plásmidos de expresión indicados (+; 50 ng).
Per2
actividades promotoras aumentaron significativamente (media ± SEM,
n = 4
,
p Hotel & lt; 0,01,
t de Student
) en comparación con el control (sin el plásmido de expresión), pero el HRE-mutante
Per2
promotor no se vio afectada. (C) Veinticuatro horas después del tratamiento con CoCl (10, 30, 100 M durante 6 h), se midió
2 la actividad de luciferasa.
Per2
actividades promotoras aumentaron significativamente (media ± SEM,
n = 4
,
p Hotel & lt; 0,05, ANOVA de un factor seguido de pruebas post hoc de Tukey) de concentración -dependently comparación con el control, pero el HRE-mutante
Per2
promotor no se vio afectada. (D) HIF1α interactúa específicamente con la secuencia HRE-como en el
Per2
promotor. células Caki-2 fueron reticuladas, se lisaron y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-HIF1α anticuerpo o IgG de conejo normal (control negativo). El ADN precipitado fue sometido a PCR con cebadores específicos para la región diana (-476 /-284). Una alícuota de ADN de entrada se utilizó como control positivo. El producto de PCR se observó en el anti-HIF1α ChIP (carril 3) y el ADN de entrada 10% (carril 4). Sustancialmente se detectó menos en el chip sin anticuerpos (carril 1) y conejo IgG normal de chip (carril 2) carriles.
El efecto de inhibir HIF1α en el
Per2
ritmo circadiano
Chrysin es un flavonoide natural, que es conocida para inhibir la expresión HIF1α mediante la reducción de la síntesis de proteínas y por lo tanto reduce la estabilidad HIFa sin afectar la viabilidad celular [28]. Para examinar el efecto de la inhibición de la proteína HIF1α en
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ritmo circadiano, las células fueron pretratadas con diferentes concentraciones Chrysin. La expresión de la proteína HIF1α se suprimió significativamente después de un 2-h de incubación con 100 crisina mu M en Caki-2 células (Fig. 6A, B). La amplitud del ritmo circadiano de la
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promotor de la actividad disminuyó significativamente después de un 2-h de incubación con 100 crisina mu M en Caki-2 células (Fig. 6C, D, Tabla 3). Sobre la base de estos resultados, HIF1α puede aumentar los ritmos circadianos de
Per2
a nivel promotor.
Caki-2 células (A) se cultivaron a 60-70% de confluencia. Las células fueron tratadas con DMSO como control, o diferentes concentraciones Chrysin (1, 10, 100 mM) durante 2 h. (B) los niveles de proteína HIF1α se midieron en valores de densidad óptica normalizada a su respectivo control de GAPDH de carga, a continuación, un promedio ± SEM, y se representan (expresión relativa) para comparar los niveles de proteína semicuantitativamente (
n
= 4). HIF1α expresión se suprimió significativamente por 100 nM crisina comparación con el control se incubaron con DMSO (
p
& lt; 0,05, ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey). Caki-2 células (C) se transfectaron con el
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promotor reportero (2 g). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se incubaron con crisina 100 M o DMSO durante 2 h. entonces bioluminiscencia se midió usando un ensayo de monitoreo en tiempo real. Se muestran las actividades de luciferasa de cuatro muestras replicadas. se muestra (D) Detrended bioluminiscencia. Periodo, la amplitud y acrophase de las oscilaciones se midió en los días 2 a 5 utilizando el software de Cosinor (Laboratorio ritmo circadiano). Amplitud disminuyó significativamente (media ± SEM,
n
= 4) en comparación con el control (
p Hotel & lt; 0,05). Véase la Tabla 3.
Discusión
En este estudio, la expresión rítmica de la
se observó Per2
génica en células Caki-2. Sin embargo,
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promotor de las actividades y los niveles de mRNA no tenían ritmos circadianos en las otras líneas celulares. Pueden existir algunas diferencias entre las otras líneas celulares de cáncer renal Caki-2 y. Debido a
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la transcripción de genes que se activa por el factor de transcripción heterodimerized BMAL1 /RELOJ mediante la unión a la caja E-como secuencia [24], se analizó la expresión de BMAL1 y reloj de proteínas en estas líneas celulares. células Caki-2, 786-O, y A498 expresadas BMAL1, y todas las líneas celulares reloj de proteínas contenidas. Además, todas las líneas celulares de cáncer renal expresan la proteína CRY1, pero no expresan la proteína PER2. En las células Caki-2, que también examinó la expresión de la proteína PER2 a intervalos de 4 h a partir del 24 h después del tratamiento con dexametasona. Sin embargo, no se detectó proteína PER2 en todos los puntos de tiempo (Fig. S4).