Extracto
Las variantes en las regiones reguladoras se prevé que desempeñar un papel importante en la susceptibilidad a la enfermedad de las enfermedades comunes. Polimorfismos de mapeo para microRNA (miRNA) sitios de unión han sido demostrado que alteran la capacidad de los miRNAs para dirigir genes que resultan en diferencial de mRNA y expresión de proteínas.
susceptibilidad del tumor de la piel 5 gratis (
Skts5
) fue identificado como una susceptibilidad que confiere al locus inducida químicamente el cáncer de piel en células NIH /Ola por SPRET /retrocruzamientos F1 no consanguíneos. Para determinar si la expresión de polimorfismos entre las cepas que asignan a sitios de unión putativos miARN en la región no traducida 3 '(3'UTR) de los genes a
Skts5
influenciados, llevamos a cabo una evaluación sistemática de 3'UTRs de genes candidatos a través de este locus. Nueve genes tenían polimorfismos en sus 3'UTRs que se ajustan a los datos de vinculación y ocho de estos polimorfismos contenidos sospechosos de interferir con la unión o introducir miARN. 3'UTRs de seis genes,
Bcap29
,
Dgkb, PM1, Pik3cg, Twistnb
, y
Tspan13
diferencialmente afectados expresión de luciferasa, pero no parecía ser regulados diferencialmente por los miRNAs evaluados predicho para unirse sólo a una de las dos isoformas. Se evaluaron 3'UTRs de cuatro genes adicionales elegidos entre el locus que se ajustan a criterios menos estrictos.
IFRD1
y
Etv1
mostró diferencias y contenida polimorfismos previstos para interrumpir o crear sitios de unión miARN pero no mostró diferencias en la regulación de los miRNAs ensayadas. En resumen, múltiples 3'UTRs con variantes funcionales putativos entre las cepas susceptibles y resistentes de ratones influenciados expresión diferencial independiente de unión previsto miARN
Visto:. Skeeles LE, Fleming JL, Mahler KL, Toland AE (2013) La impacto de la 3'UTR variantes en la expresión diferencial de genes candidatos de susceptibilidad al cáncer. PLoS ONE 8 (3): e58609. doi: 10.1371 /journal.pone.0058609
Editor: Akio Kanai, Universidad de Keio, Japón
Recibido: 16 de octubre de 2012; Aceptado: 6 Febrero 2013; Publicado: 5 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Skeeles et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte del MGO RSG-07-083 de la Sociedad Americana del cáncer, CA134461 del Instituto Nacional del cáncer y el Centro de cáncer Integral de la OSU. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dr. Toland es un editor académico de PLOS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Mus spretus
ratones son resistentes al cáncer de piel en comparación con
Mus musculus
ratones. En los estudios de ligamiento anteriores de dimetilbenz [a] antraceno (DMBA) /12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) - inducida por el cáncer de piel se identificaron una serie de cáncer de piel loci de susceptibilidad en SPRET /Outbred por los ratones NIH /Ola F1 de retrocruzamiento [1] - [4]. Los estudios de ligamiento También se realizaron usando SPRET /IER por FVB /N, SPRET /IER por el NIH /Ola y STF /Pas por los ratones NIH /Ola F1 de retrocruzamiento que identificaban loci de susceptibilidad adicional. Uno de los loci de susceptibilidad de la piel,
tumor de la piel susceptibilidad 5 gratis (
Skts5
), fue encontrado en el SPRET /Outbred por el NIH /Ola cruza, pero no en STF /Pas por el NIH /Ola F1 o SPRET /IER por FVB /N cruces [3], [4]. vinculación resultados para SPRET /IER por el NIH /Ola fueron equívocos para esta región. Análisis de secuencias de 54 genes y elementos de codificación a través de una región vinculación pico de 14 Mb a
Skts5
ha llevado a la identificación de una serie de cambios de codificación en consonancia con el análisis de vinculación (Mahler et al., 2008).
La expresión génica diferencial se postula a ser tan importante, si no más importante, para la susceptibilidad a la enfermedad como los cambios de codificación no es sinónimo [5]. La expresión de genes diferencias debidas a factores hereditarios pueden ser causados por variaciones en potenciador o sitios de unión al promotor, las variaciones en la regulación epigenética que impactan metilación o la cromatina modificaciones, variaciones en la expresión de factores que actúan en trans o diferencias en la regulación de los microRNAs (miRNAs) [6] - [9]. polimorfismos de nucleótido único (SNP) que caen específicamente en la región 3 'no traducida (3'UTR) de los genes pueden interferir con la estabilidad del ARNm y la traducción a través de efectos sobre la poliadenilación y regulatorio proteína-mRNA y las interacciones miARN-mRNA [10] - [12]. Los estudios preliminares en humanos han identificado variaciones en la 3'UTR de los genes que parecen afectar el riesgo de cáncer mediante la interrupción de la unión [13] miRNA normal [14]. Una de esas variantes en el
KRAS2
gen aumenta el riesgo de cáncer de pulmón y cáncer de ovario cambiando la capacidad de los miARN
let-7
de obligar a [15], [16]. Otro estudio en ratones miraba miARN sitios complementarios para los tres miRNAs que se introdujeron o interrumpido por SNPs por alélica desequilibrio secuenciación [17]. No se observaron diferencias en la expresión de ajuste con los datos de secuencia de ARN de un gran porcentaje de los genes diana putativos, lo que sugiere que las variaciones en 3'UTRs tienen un papel clave en la expresión de genes diferencias entre individuos.
Para determinar si los polimorfismos en putativo miARN sitios de unión estaban afectando a la expresión génica y podrían ser candidatos funcionales para
Skts5
, hemos realizado un análisis sistemático de las regiones 3'UTR de los genes a través del locus. Se identificaron variantes en la secuencia nueve genes que responden a los análisis de ligamiento (estábamos polimórficos entre SPRET /Outbred y NIH /Ola y no se diferenció entre STF /PAS y NIH /Ola o SPRET /IER y FVB /N). SNPs de ocho de estos 3'UTRs se prevé asignar a los sitios de unión putativos de microARN. Un 18 genes adicionales fueron polimórficos entre SPRET /Outbred y NIH /Ola y SPRET /IER y FVB /N, pero no entre los STF /PAS y NIH /Ola. A continuación, describimos los efectos de las variantes de estos genes de susceptibilidad al candidato sobre la expresión.
Materiales y Métodos
líneas
material de origen animal y los teléfonos
No hay animales vivos se utilizaron en este estudio ; ADN y tejidos existentes fueron proporcionados por los colaboradores oa través de fuentes comerciales. La UCSF y la Universidad de Roswell Park Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités (IACUC) aprobaron el trabajo con animales original que produjo las muestras utilizadas en este estudio. orígenes de laboratorio de cada una de las cepas de ratones en el estudio son los siguientes: STF /PAS (línea consanguínea mantenida por el Instituto Pasteur), SPRET /IER (línea consanguínea mantenida por el Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), no consanguínea
spretus gratis (línea SPRET /outbred, consanguínea mantenida por Hiroki Nagase, Instituto Roswell Park), FVB /N (línea consanguínea mantenida por los laboratorios Jackson) y NIH /Ola (línea consanguínea mantenida por Allan Balmain). NIH /Ola y SPRET /Outbred son homocigotos por el
Skts5
. Los tejidos para los ratones NIH /Ola fueron proporcionados por el Dr. Allan Balmain y tejidos para SPRET /ratones no consanguíneos fueron proporcionados por Hiroki Nagase. ADN fue aislado de colas o bazos de SPRET /Outbred y NIH /Ola ratones utilizando métodos estándar [18]. SPRET /IER y el ADN FVB /N y los tejidos se adquirieron de los Laboratorios Jackson. ADN STF /PAS fue un regalo de Xavier Montagutelli, DVM, PhD, del Instituto Pasteur. C5N, una línea celular de queratinocitos de murino no inmunogénico obtenido a partir de Allan Balmain, se mantuvo en 1x de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina /estreptomicina antibiótico.
Secuencia el análisis
3'UTRs de la asignación de 39 genes a
Skts5
para los que no teníamos datos de secuencia para todas las cepas utilizadas en los análisis de ligamiento fueron identificados usando la base de datos Ensembl, construye 35-48 . Hemos diseñado cebadores de PCR utilizando el programa basado en la web de SciTools PrimerQuest Integrado Tecnología de ADN [http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest; San Diego, CA]. Los productos de PCR fueron tratados con Exo /SAP-IT (USB, Cleveland, OH) para eliminar el ADN de cadena sencilla. la secuenciación automatizada de los productos de la PCR se realizó en un ABI 3700 (Applied Biosystems /Life Technologies, Carlsbad, CA) por métodos estándar. Los cebadores utilizados para la PCR también se utilizaron para la secuenciación. Hacia adelante y secuencia inversa lecturas se analizaron y se compararon mediante Lasergene /DNAstar 3.0 (DNASTAR, Madison, WI). Los rastros de secuencia se inspeccionaron visualmente cada vez que se indicaba una sustitución de nucleótidos.
identificación de los posibles sitios de unión microARN
polimorfismos 3'UTR que se observaron sólo entre NIH /Ola y SPRET /Outbred fueron evaluados para determinar si se rompen o se introducen
in silico
sitios de unión predichos microARN. Se utilizaron cuatro programas: Miranda (www.microRNA.org) [19], MicroInspector (http://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/) [20], el buscador Patrocles (www.patrocles.org) [21] y MicroSNiPer (http://cbdb.nimh.nih.gov/microsniper/getSeqByNM.php) [22]. Miranda nos permitió predecir si nuestros SNPs de interés interrumpidos miARN sitios de unión en la cepa de referencia del ratón, lo cual era muy similar a la NIH /3'UTRs Ola. Los otros tres programas permiten secuencias únicas para ser analizados por los sitios de unión de microARN. Para los sitios predichos por MicroInspector, que examinó por primera vez las que tenía una energía predicha libre mínimo (MFE) superior a -15 kcal /Joule en una forma y un MFE de menos de -20 kcal /julios en la otra forma. Cuando reevaluado, sólo aquellos que se estima que tienen una MFE mayor de -18 kcal /Joule en una forma y un MFE de -22 kcal /julios o menos en la otra forma, como se ha utilizado anteriormente para
Mus musculus
[20], se ensayó adicionalmente experimentalmente. -22 Kcal /J o menos fue considerado una unión fuerte y -18 kcal /J o mayor se consideró nula o muy débil unión. Patrocles y MicroSNiPer permiten la comparación de dos secuencias únicas para las diferencias en los sitios de unión predichos. MicroSNiPer requiere SNPs que se introducirán en el programa de predicción, por lo que esta herramienta no fue capaz de predecir los sitios creados o interrumpidos por inserciones o deleciones. Usando MicroInspector, Patroclo, y MicroSNiPer, recogimos candidato miRNAs que se prevé que se unen a la única cepa de ratón (NIH /Ola o SPRET /Outbred), que demostraron la expresión más baja, medida por nuestra expresión ensayo de luciferasa 3'UTR y que contenía una polimorfismo en el sitio de unión de miARN que encaja con los resultados de la vinculación del ratón.
clonación
Una sección de cada 3'UTR del gen candidato que incluía sitios polimórficos que se ajustan a la vinculación del ratón y se predijeron interferir con la unión de los genes miARN se clonó en el control de vectores pGL3 Clontech (Mountain View, CA) (Tabla S1). El vector se linealizó mediante PCR inversa (iPCR) utilizando Advantage HD polimerasa Mix (Clontech), según el protocolo del fabricante. iPCR cebadores fueron diseñados utilizando el software de IDT PrimerQuest. Artículos lineales fueron separados de vector circular usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Frederick, MD). Los cebadores de PCR para la clonación utilizando protocolo del kit de clonación HD-fusión de Clontech fueron diseñados utilizando el software de IDT PrimerQuest (Tabla S2). Los productos de PCR fueron amplificados de NIH /Ola y el ADN SPRET /Outbred, purificados y clonados en el vector 3 'del gen de la luciferasa por recombinación usando el kit de clonación en-Fusion HD de Clontech, de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN del plásmido se analizó por digestión de restricción y los clones se verificó la secuencia mediante secuenciación de Sanger.
Site-Directed Mutagenesis
Para los genes en los que el NIH /Ola o SPRET /Outbred 3'UTR era difícil de clon, sitios polimórficos que se ajustan con el varillaje del ratón se cambiaron mediante mutagénesis dirigida al sitio (SDM) usando plásmidos que contienen el 3'UTR de la otra cepa como plantilla. SDM cebadores fueron diseñados utilizando Primer Programa de Diseño QuikChange de Stratagene, y SDM se realizó utilizando QuikChange Multi Rayo de mutagénesis dirigida Kit de Stratagene por el fabricante de condiciones (Agilent, Santa Clara, CA), recomendó. plásmidos mutados se verificaron secuencia.
ensayos
Las transfecciones /luciferasa
C5N células fueron co-transfectadas con pGL3 los In-Fusión productos, PRL-TK del vector de Renilla luciferasa de luciérnaga (Promega, Madison, WI) y pre-miRNAs o precursores mirVana imitan miARN (Ambion /Life Technologies, Grand Island, NY) para los ensayos de miARN. Las transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamina Plus con el reactivo (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island NY) para transfecciones de ADN 3'UTR y Lipofectamine 2000 (Invitrogen) para transfecciones utilizando plásmidos (600 ng /pocillo de cada plásmido) y precursores miARN o controles revueltos ( 13 pmol /pocillo de una placa de 12 pocillos). Veinticuatro horas después de la transfección, la proteína se aisló utilizando M-PER (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL), y el ARN se aisló utilizando Ribozol (ISC BioExpress, Kaysville, UT). Para las mediciones de luciferasa, se añadió una D-luciferina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) mezcla, que contenía DTT y glicilglicina a 30 l de proteínas aisladas en un Vertias microplaca luminómetro usando el programa Veritas ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI). Para activar la reacción de una mezcla de ATP, con la TDT, glicilglicina, EGTA, sulfato de magnesio
4, y K2PO, se añadió
4. Un ensayo indicador de control incluyó Coelenterizine nativa (NanoLight Technologies, Pinetop, AZ) con el ATP, la TDT, glicilglicina, EGTA, sulfato de magnesio
4, y K2PO
4, añadido a 30 l aislados de proteínas siguiendo el protocolo de Promega Renilla. unidad de luz relativa luciferasa lecturas se normalizaron a la luciferasa de Renilla. se muestran las proporciones relativas de luciferasa de las células transfectadas de manera simulada. Las transfecciones y ensayos de luciferasa se realizaron un mínimo de dos veces para cada conjunto de construcciones 3'UTR miRNA y el ensayo con la excepción de
miR-3064-3p gratis (
Pik3cg
), que sólo se puso a prueba una vez y mostró resultados convincentes de diferencias. T de Student pruebas se utilizaron para calcular la significación de las diferencias de expresión.
condiciones experimentales adicionales fueron probados para transfecciones con el
Twistnb
3'UTRs junto con
miR-3074-5p
y /o
miR-691
. Los experimentos se realizaron como se describe anteriormente, excepto que las células C5N se cosecharon a las 24, 48, y 72 horas usando una concentración más alta de los genes miARN (26 pmoles) o ambos miRNAs juntos (26 pmoles cada uno). Una dosis más baja de miARN transfectadas (7 pmoles) o ambos juntos miRNAs (7 pmol de cada uno) se evaluó también por un efecto de
Twistnb
3'UTRs a las 24 y 48 horas. Los experimentos adicionales para evaluar los efectos de los
miR-3074-5p
en
Twistnb
isoformas incluido transfecciones en células C5N con un anti-miARN para
miR-3074-5p
o un inhibidor de control negativo a las 24 y 48 horas después de la transfección a dos concentraciones (13 pmoles y 30 pmoles).
Confirmación de los genes miARN transfección mediante PCR cuantitativa (qPCR)
Para confirmar miARN transfección, el RNA se aislado como se describe anteriormente. La transcripción inversa (RT) se realizó utilizando el kit de RT Multiscribe de Applied Biosystems de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante (Life Technologies /Applied Biosystems, Carlsbad, CA). sondas TaqMan qPCR para miRNAs se compraron de Applied Biosystems.
Sno202
se utilizó para calcular la expresión relativa. qPCR se realizó por triplicado para cada muestra. Los experimentos incluyeron no-RT y sin controles de plantilla. ciclo umbral valores (CT) fueron promediados a través de los triplicados y valores CT delta se calcularon entre cada prueba miARN y control simulado.
Identificación de candidatos de microARN
Para refinar nuestra lista de candidatos microARN (miARN) , se analizaron tanto los NIH /Ola y /SPRET formas no consanguínea de estos sitios de unión en dos herramientas de predicción de mínimos de energía libre (MFE), RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/) [23] y RNAcofold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAcofold.cgi) [24]. Hemos mejorado aún más nuestra lista de candidatos 3'UTRs a aquellos cuyos SNPs se prevé que inducen a 5 kcal /J o mayor diferencia en miRNAbinding MFE entre NIH /Ola y SPRET /Outbred por ambas herramientas de predicción (Tabla S3).
Evaluación de la expresión del ARNm por qPCR
para identificar los genes que muestran expresión diferencial, RNA fue aislado de las colas de los NIH /Ola y SPRET /outbred ratones utilizando Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el fabricante de las condiciones recomendadas. Un microgramo de ARN de cada animal se invirtió transcrito utilizando el kit de síntesis de cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA). Para evaluar la expresión del ARNm del candidato
Skts5
genes, sondas Taqman fueron adquiridos de Applied Biosystems (Life Sciences Technologies). Cada muestra se midió por triplicado. Tres genes de control,
L19
,
Ppia
y
HPRT
, se utiliza para calcular la expresión relativa y la diferencia media en la expresión se calculó en los tres controles. Los experimentos incluyeron controles con agua y los controles no-RT. Importancia de la expresión diferencial se determinó mediante pruebas t de Student.
Resultados
Identificación de 3'UTRs candidatos para el estudio
Skts5
es un tumor cutáneo locus de susceptibilidad previamente identificada en ratones F1 de retrocruzamiento entre susceptibles NIH /Ola y SPRET /cepas de outbred [4], [25]. La vinculación con este lugar no se encontró en retrocruzamientos F1 entre NIH /Ola y STF /PAS o entre FVB /N y SPRET /IER, otras cepas resistentes de la piel de Mus spretus lo que sugiere que potencialmente funcionales variantes de secuencias que estaban presentes en SPRET /Outbred, pero no en STF /PAS o SPRET /IER, que podría considerarse como variantes candidatos. En estudios anteriores, hemos secuenciado exones de codificación de 54 genes en el mínimo
Skts5
vinculación región en cepas de ratones susceptibles a cáncer de piel (NIH /Ola y FVB /N) y ratones resistentes al cáncer de piel (SPRET /Outbred , SPRET /IER, STF /PAS) [4]. En nuestro estudio inicial, que no se ha completado el genotipado de todo el 3'UTRs para todos los genes en todas las cepas de ratones utilizados en el estudio. Para generar los datos que faltan secuencias, la secuencia 3'UTR la versión más larga de 39 genes de las cepas para los que nos faltaban datos, principalmente STF /PAS. De los genes evaluados, hubo 24 polimorfismos 3'UTR de nueve genes que se ajustan a los datos de vinculación más conservadores en cuanto a que sólo eran polimórficos entre NIH /Ola y SPRET /Outbred, pero no eran polimórficos entre STF /PAS y NIH /o Ola entre FVB /N y SPRET /IER (Tabla 1).
Efecto de la 3'UTR variantes en la expresión
esperábamos que sólo un subconjunto de los 24 polimorfismos 3'UTR haría predecirse para alterar la unión miARN. Para identificar estos SNPs, entramos en tanto el NIH /Ola y /secuencias Outbred SPRET en dos programas de predicción de genes miARN vinculante, MicroInspector [20] y Miranda [19]. Quince polimorfismos se predice que afectan miARN vinculante.
Cbll1
era el único gen con una variante 3'UTR montaje de la articulación que no tiene al menos un candidato SNP prevé que interrumpir o introducir un sitio de miARN (Tabla 2, Tabla S3; Figura S1).
para determinar si los polimorfismos 3'UTRs afectadas expresión, hemos clonado fragmentos de la 3'UTRs de 245 a 1.652 pb de tamaño que contenía las variantes de interés para los ocho genes con los polimorfismos de ajuste de los datos de vinculación y predijo para interferir con la unión de los genes miARN (Tabla S1). El 3'UTR de
Cbll1
también fue clonado. Tras la clonación de fragmentos 3'UTR de
Bcap29
,
Cbll1
,
Dgkb
,
PM1
,
MEOX2
,
Pik3cg
,
STXBP1
,
Tspan13
, y
Twistnb
, en el vector pGL3-control de la luciferasa, transfectadas las construcciones en células de queratinocitos normales y medido C5N los niveles de luciferasa de las dos isoformas. La hipótesis de que si la variante dentro de la 3'UTR se predijo para mostrar la unión sólo en una cepa miRNA, no debería ser menor expresión de la luciferasa en comparación con la variante no predicho de obligar a la miRNA. Las regiones no traducidas de
Bcap29
,
Dgkb
,
PM1, Pik3cg
,
STXBP1
, y
Twistnb
tenido sitios polimórficos, que se prevé que ambos introducir y alterar los sitios de unión putativos miARN. Así, para estos seis genes, no estaba claro cómo el polimorfismo podría afectar a la expresión. De los nueve 3'UTRs evaluados, seis mostraron estadísticamente significativa la expresión de luciferasa diferencial entre las cepas (Figura 1 y los datos no presentados). Las diferencias más pronunciadas en la expresión de luciferasa se encontraban en la 3'UTRs de
PM1
y
Bcap29 gratis (Figura 1). Para muchos de los genes, las dos isoformas 3'UTR mostraron una disminución de la expresión de luciferasa en comparación con el vector pGL3 lo que sugiere que los miRNAs u otros mecanismos de regulación tienen efectos en ambas formas 3'UTR.
unidades relativas de luciferasa representativos normalizados para burlarse de se muestra el vector de luciferasa pGL3 (gris oscuro), NIH 3'UTR (negro) y SPRET /Outbred 3'UTRs (gris claro) para los seis genes. P-valores de expresión diferencial entre NIH /Ola y SPRET /Outbred se indican. A.
Bcap29
; B.
Dgkb
; C.
PM1
; D.
Pik3cg
; E.
Twistnb
; F.
Tspan13
.
Identificación de las variantes que afectan putativo sitios de unión de microARN
A medida que las variantes en las regiones 3'UTR se ha demostrado que afectan a la unión de miRNA y posterior gen y la expresión de la proteína [15], [16], la hipótesis de que el 3'UTR variantes de ajuste de los datos de vinculación podría afectar a la regulación de genes y, por tanto, afectar a la diferencia en la susceptibilidad al cáncer entre los NIH /Ola y /ratones no consanguíneos SPRET. Seis de los nueve 3'UTRs evaluados,
Bcap29
,
Dgkb
,
PM1
,
Pik3cg
,
Twistnb
y
Tspan1
, mostró la expresión de luciferasa diferencial entre NIH /Ola y SPRET /Outbred, sin embargo, ya que muchos de ellos tenían múltiples SNPs que se prevé que afectar a la unión, hemos querido priorizar qué SNPs y miRNAs eran más propensos a hacer esto. Además, ya que algunos SNPs se determinaron previamente tanto a introducir y alterar posibles sitios de unión, se quiere utilizar nuestros datos de la luciferasa para elegir miRNAs que se adapten a los datos de expresión. Para perfeccionar nuestra lista SNP candidato y elegir miRNAs potenciales para el estudio, la secuencia de 3'UTRs de genes con variantes candidatos fueron evaluados utilizando programas adicionales de predicción de genes miARN vinculante Patrocles, y MicroSNiPer. También utilizamos MicroInspector, para identificar sitios de unión con un MFE de menos de -22 kcal /J, de una forma (fuerte unión) y mayor que -18 kcal /J en la otra forma (unión débil o nula), como se recomienda para Mus musculus [20]. Para todos los sitios de unión predijo miARN, se determinó en qué medida el polimorfismo se prevé que afectará a la fuerza de unión. Usando RNAhybrid y RNAcofold, se calculó una energía libre de unión de los miRNAs putativo. Hemos probado las diferencias de expresión de todas las interacciones miARN que mostraron diferencias de más de 5 kcal /J entre las dos formas variantes en ambas herramientas de predicción de predecir. Todos los seis genes con variantes que se ajustan a los datos de vinculación y mostraron diferencias en la expresión de luciferasa tenían variantes con diferencias significativas en la unión de miRNAs, algunas de las cuales contenían SNPs en la región de semillas predicho (Tabla 2, Figura S1).
Efecto de microRNAs en la expresión
Para determinar si los miRNAs predicho podrían influir en las diferencias de expresión de luciferasa de
Bcap29
,
Dgkb
,
PM1
,
Pik3cg
,
Twistnb
y
Tspan13
, que las células C5N co-transfectadas con el NIH /Ola o SPRET /construcciones de luciferasa no consanguínea y un precursor de miARN prevé que se unen a las variantes consistentes con nuestros datos de expresión de luciferasa iniciales (Tabla 2) y la vinculación. Elegimos 13 miRNAs candidatos para su evaluación. Comenzamos nuestros estudios sólo por la evaluación de la isoforma predijo que quedará vinculado por el miARN y evaluado ambas isoformas cuando vimos un efecto en la dirección esperada de la miARN en los niveles de luciferasa. miRNAs para
Pik3cg gratis (
miR-707
),
PM1 gratis (
miR-127
,
miR-183
, y
miR-873
),
Twistnb gratis (
miR-718
, y
miR-691
), y
Dgkb gratis (
miR-489) no tuvo ningún impacto en la expresión de luciferasa (Figura 2A y datos no presentados).
MIR-1940 Vaya con el
Tspan13
3'UTR y
miR-31 Vaya con el
PM1
3'UTR disminución de la expresión de luciferasa de las dos isoformas de manera similar lo que sugiere que estos miRNAs obligados los 3'UTRs en el mismo grado (Figura 2B y datos no presentados). Otros miRNAs,
miR-128 (Bcap29), miR-3064-3p (Pik3cg)
,
miR-3074-5p gratis (
Twistnb
) y
MIR -485 (Dgkb)
disminuyó la expresión de luciferasa del control pGL3 vector vacío en el mismo grado como el vector que contiene el 3'UTR clonado (Figura 2C y datos no presentados). Estos datos sugieren que los miRNAs que elegimos para el análisis no eran responsables de las diferencias observadas en la expresión de luciferasa entre SPRET /Outbred y NIH /Ola.
experimentos representativos que muestran ningún efecto sobre la expresión de los genes miARN luciferasa y efectos similares de la se muestran miARN en ambas isoformas. A.
Dgkb
3'UTR con
miR-489
; B.
Tspan13
3'UTR con
MIR-1940; C. Dgkb con miR-485
. pGL3, pGL3 vector de luciferasa sin inserto; NIH, NIH /Ola 3'UTR; SPRET, SPRET /Outbred 3'UTR; Carolina del Norte, revueltos miARN de control; Las barras grises oscuros, pGL3 luciferasa vectorial; barras de color negro, vector pGL3 con el NIH /Ola 3'UTR; barras de color gris claro, vector pGL3 que contiene el SPRET /Outbred 3'UTR.
Para descartar la posibilidad de que nos faltaba efectos diferenciales de los miRNAs en la expresión de luciferasa a causa de las condiciones experimentales utilizadas, se evaluaron
Twistnb
3'UTR el uso de dosis adicionales de miRNAs
miR-3074-5p
y
miR-691
y los puntos temporales adicionales después de la transfección. Este 3'UTR fue elegido para un estudio más detallado debido a que contenía variantes predijeron que se unen a la región de la semilla de ambos de estos genes miARN (Figura S1). No se observaron diferencias en el efecto de los miRNAs en comparación con nuestros experimentos originales (Figura 3A, 3B y los datos no se muestra). Como miRNAs pueden actuar en combinación, también se evaluó
miR-3074-5p Opiniones y
miR-691 en combinación
en el
Twistnb
3'UTR NIH /Ola y SPRET /outbred isoformas y se encontró que los resultados de la combinación de
miR-691
y
miR-3074-5p
eran idénticos a los de la
miR-3074-5p
solo (Figura 3A, 3B y datos no presentados). Estos resultados sugieren que nuestros datos no es probable que sea un artefacto de las condiciones experimentales utilizadas.
experimentos representativos que muestran el efecto no específico de
miR-3074-5p
y /o
miR-691
en ambas isoformas de
Twistnb
se muestran en una dosis baja de transfección de genes miARN precursores. A.
Twistnb
3'UTRs a las 24 horas después de la transfección con
miR-3074-5p
,
miR-691
o ambos miRNAs. B.
Twistnb
3'UTRs a las 48 horas después de la transfección con
miR-3074-5p
,
miR-691
o ambos miRNAs. pGL3, pGL3 vector de luciferasa sin inserto; NIH, NIH /Ola 3'UTR; SPRET, SPRET /Outbred 3'UTR; Carolina del Norte, revueltos miARN de control; Las barras grises oscuros, pGL3 luciferasa vectorial; barras de color negro, vector pGL3 con el NIH /Ola 3'UTR; barras de color gris claro, vector pGL3 que contiene el SPRET /Outbred 3'UTR.
A fin de evaluar el efecto de
miR-3074-5p
en pGL3 y NIH /Ola y SPRET /outbred
Twistnb
3'UTRs, transfectadas un inhibidor de
miR-3074-5p Opiniones y comparación de expresión de un inhibidor de control negativo y
miR-3074-5p
. Si los miARN se dirigen directamente a la SPRET predicho /Outbred
Twistnb
isoforma y el efecto observado sobre el vector pGL3 y los NIH /Ola
Twistnb
eran efectos no específicos (Figura 3 A y B) , sería de esperar que la adición del inhibidor tendría el mayor efecto en el vector pGL3 con el SPRET /Outbred 3'UTR. Además de la lucha contra la
miR-3074-5p
mostraron el mayor incremento en la expresión de luciferasa pliegue del vector pGL3 y mostraron incrementos no específicos en la expresión de la SPRET /Outbred y NIH /Ola isoformas lo que sugiere que la reducción es la expresión de luciferasa no específica (datos no mostrados)
.
es posible que los miRNAs endógenos pueden estar ejerciendo máxima knock-down y la adición del precursor de miARN a nuestras células C5N no induciría una mayor reducción en la expresión de luciferasa. Para evaluar esta posibilidad medimos miARN expresión de nuestra ARN a partir de células cosechadas C5N que fueron transfectadas de manera simulada. Es de destacar que todos los miRNAs evaluados mostraron evidencia de expresión en el no transfectadas por qPCR, pero la mayoría de ellos se expresaron en niveles relativos de 1% o menos del control,
sno-202
. Por lo tanto, para la mayoría de los miRNAs en este estudio, los niveles endógenos de expresión en las células C5N es poco probable que causando caída máxima de la 3'UTR prevista del blanco. Los microARN que muestran un mayor nivel de expresión endógena incluyen
miR-31 gratis (252% del control),
miR-183 gratis (12,5% del control),
miR-675-3p
(2,2% del control) y
miR-3074-5p gratis (3,7% del control).
expresión de mRNA de los genes diana candidatos
Uno de los efectos de los genes miARN unión a ARNm es la degradación del producto mRNA y disminución de la expresión. Mapeo de genes a
Skts5
fueron evaluados por qPCR para determinar si había diferencias en el ARNm cola entre NIH /Ola y SPRET /Outbred. De los genes probados que contienen variantes candidato 3'UTR se encontraron diferencias significativas en la expresión de ARNm en
Bcap29
,
PM1
,
Pik3cg
,
Twistnb y Tspan13
, pero no hubo diferencias significativas en la expresión de
Dgkb
y
MEOX2
(Figura 4 y datos no mostrados). Expresión para
Stxbp6
era demasiado bajo para la comparación. Los genes que mostraron resultados consistentes entre los ensayos de expresión de luciferasa y la qPCR son
Bcap29 gratis (mayor expresión en células NIH /Ola),
PM1 gratis (mayor expresión en SPRET /Outbred),
MEOX2 gratis (no hubo diferencias significativas en la expresión),
Twistnb gratis (mayor expresión en células NIH /Ola) y
Tspan13 gratis (mayor expresión en SPRET /Outbred).
Bcap29
mostró el más alto grado de diferencia, aproximadamente 15 veces más alta expresión en células NIH /Ola de SPRET /Outbred (Figura 4).
Dgkb
no mostró diferencias significativas en la expresión de ARNm, pero más alta expresión de luciferasa de los NIH 3'UTR.
Pik3cg
mostraron una mayor expresión de ARNm SPRET /Outbred, pero menor expresión de luciferasa. Por lo tanto, cinco de los siete genes evaluados por qPCR mostraron patrones de expresión coherentes entre mRNA y el efecto de la 3'UTR de la expresión de luciferasa. Como miRNAs funcionan de dos maneras, una mediante el aumento de la degradación del ARNm y la otra al interferir con la traducción, es posible que no hay diferencia en la expresión de ARNm se observa incluso cuando diferencial miARN unión tiene lugar [26], [27].
PCR cuantitativa de los siete genes evaluados para la expresión de la luciferasa diferencial entre SPRET /Outbred y NIH /Ola 3'UTR se muestran.