Extracto
1-metil-D-triptófano (1-D- MT) se está utilizando actualmente en ensayos clínicos en pacientes con tumores sólidos recaída o refractario, con el objetivo de inhibir indoleamine-2,3-dioxigenasa (IDO) mediada tumor escape inmune. IDO se expresa en los tumores y los ganglios linfáticos de drenaje tumorales y degrada triptófano (trp) para crear un micromilieu inmunosupresora tanto por el agotamiento de trp y por la acumulación de metabolitos inmunosupresores de la vía de quinurenina (kyn). Aquí nos muestran que la proliferación de las células T alorreactivas cocultured con células de cáncer humano IDO1 positivo paradójicamente fue inhibida por 1-D-MT. Sorprendentemente incubación con 1-D-MT aumento de la producción kyn de células de cáncer humano. Los ensayos libres de células reveló que 1-D-MT no alteró la actividad enzimática IDO1. En lugar de ello, 1-D-MT inducida IDO1 mRNA y expresión de la proteína a través de vías de participación de MAPK p38 y la señalización de JNK. El tratamiento de pacientes con cáncer con 1-D-MT tiene efectos transcripcionales que pueden promover en lugar de suprimir escape inmune anti-tumor mediante el aumento de IDO1 en las células cancerosas. Estos efectos fuera de la meta deben ser cuidadosamente analizados en los ensayos clínicos en curso con 1-D-MT
Visto:. Opitz CA, Litzenburger UM, U Opitz, Sahm H, K Ochs, Lutz C, et al. (2011) La indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) Inhibidor de 1-metil-D-triptófano regula al alza IDO1 en células de cáncer humano. PLoS ONE 6 (5): e19823. doi: 10.1371 /journal.pone.0019823
Editor: Matej Oresic, Centro de Investigación Técnica de Finlandia Gubernamental, Finlandia
Recibido: 25 Noviembre 2010; Aceptado: 18 de abril de 2011; Publicado: 20 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Opitz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Asociación Helmholtz (VH-NG-306) para MP y la Fundación Hertie de WW. CAO está apoyado por una Universidad de Heidelberg Facultad de Medicina beca posdoctoral. Como Uta Opitz y Christian Lutz son empleados de Heidelberg Pharma, Heidelberg Pharma tuvo un papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que existen conflictos de intereses. Uta Opitz y Christian Lutz son empleados de Heidelberg Pharma. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
En los últimos años la degradación del triptófano (trp) ha recibido una creciente atención como un mecanismo potente inmunosupresor involucrados en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. La enzima indolamina-2,3-dioxigenasa trp-degradantes (IDO) ha sido implicado en la tolerancia materna hacia concepti alogénico [1], el control de las enfermedades autoinmunes [2], [3] y la infección crónica [4], así como la promoción de tumor escape inmune [5], [6], [7]. mediada por IDO degradación trp no se limita a las células tumorales [7], pero también se detecta en los ganglios linfáticos de drenaje de tumores [8]. En ambos ganglios linfáticos y los tumores de drenaje tumorales, IDO1 crea tolerancia local suprimiendo directamente las respuestas de células T y la mejora de la inmunosupresión mediada por las células T reguladoras (T
reg
) [6]. IDO se activa crónica en muchos pacientes con cáncer [9] y su expresión o actividad de la enzima se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes con varios tipos de cáncer como el carcinoma de ovario [10], [11], el carcinoma de endometrio [12], [13], hepatocelular carcinoma [14] y el carcinoma colorrectal [15].
a pesar de la mayor parte de la evidencia que soporta un papel para IDO en la promoción de la formación de tumores y el escape inmunológico del tumor, se han realizado estudios que muestran una actividad anti-tumor de IDO1. La inducción de IDO1 ha sido descrito como un mecanismo por el cual el interferón (IFN) -γ inhibe la proliferación de las células malignas [16], [17]. Algunos experimentos con animales demostraron que la expresión IDO1 se asoció positivamente con la eliminación de las células malignas [18], [19]. Estos hallazgos fueron corroborados en estudios clínicos que demuestran que a pesar de ser un potente inductor de IDO1, IFN-γ fue eficaz en la terapia del carcinoma de ovario y cáncer de vejiga [20], [21], [22]. Además, la expresión IDO1 en muestras de carcinoma hepatocelular y en las células endoteliales de carcinoma de células renales correlacionó positivamente con la supervivencia libre de progresión y la supervivencia a largo plazo, respectivamente [23], [24]. Hay por lo tanto mantiene la incertidumbre acerca de la relevancia clínica de expresión IDO1 en los tumores.
En los estudios preclínicos del IDO-inhibidor 1-metil-triptófano (1-MT) redujo el volumen del tumor de los ratones preinmunizados con un antígeno tumoral [7 ] y - en combinación con agentes quimioterapéuticos - causado la regresión de los cánceres de mama murino establecidos [5]. La inhibición de la IDO en combinación con quimioterapia o como un adyuvante de vacuna, por tanto, representa un enfoque atractivo para la inmunoterapia del cáncer [5], [6], [7], [25], [26]. Recientemente, una nueva isoforma IDO, denominado IDO2 se descubrió, que - al igual que IDO1 - se expresa en los tumores y ganglios linfáticos de drenaje del tumor [27]. La tercera enzima trp-degradantes en los seres humanos, triptófano-2,3-dioxigenasa (TDO) se expresa principalmente en el hígado y regula las concentraciones de trp después de la absorción trp nutricional. El inhibidor de IDO 1-MT existe como dos estereoisómeros, 1-D-MT y 1-L-MT. La mayoría de los estudios preclínicos han empleado la mezcla racémica 1-D /L-MT para inhibir IDO. Estudios recientes han demostrado que IDO1 es el objetivo preferente de 1-L-MT, mientras que 1-D-MT inhibe preferentemente IDO2 [26], [27], [28], [29]. 1-D-MT se usa actualmente en ensayos clínicos de fase I como un complemento a la quimioterapia convencional basado en los estudios preclínicos en modelos de ratón de cáncer. Estábamos interesados en los efectos inmunomoduladores de 1-D-MT en células cancerosas humanas IDO1-positivos.
Resultados
1-D-MT induce inmunosupresión de células cancerosas humanas
Skov-3 células se degradan de forma constitutiva trp de kyn y expresan altos niveles de ARNm IDO1 mientras IDO2 y TDO ARNm se expresan en niveles bajos (fig. 1A). Desmontables de IDO1 por siRNA en células SKOV-3 disminución de la expresión de ARNm por IDO1 87,5% (Fig. 1B) que conduce a una fuerte reducción en la expresión de proteínas IDO1 como se evidencia por transferencia de Western (Fig. 1C) e inmunocitoquímica (Fig. 1D). Finalmente, la producción kyn fue inhibida por 91,4% en las células IDO1 caída en comparación con la producción kyn medio de células SKOV-3 transfectadas sin siRNA o con un control de siRNA no la orientación (Fig. 1E), lo que sugiere que IDO1 es principalmente responsable de la producción kyn constitutiva en células SKOV-3. Para determinar el efecto del tratamiento 1-MT sobre el fenotipo inmunomoduladora de las células cancerosas, se realizaron SKOV-3 experimentos de cocultivo /MLR. La adición de kyn (Fig. 2A) o la presencia de células SKOV-3 (Fig. 2B) inhibió la proliferación de células T alorreactivas en MLR. Desmontables de IDO1 por siRNA no sólo invirtió la SKOV-3 de células mediada por la supresión de la proliferación de células T, pero incluso aumento de la proliferación de células T (Fig. 2C), probablemente debido a la estimulación alogénica adicional de las células T por la IDO deficientes SKOV-3 Células. Siguiente hemos probado los efectos de los dos estereoisómeros de 1-MT. La adición de 1-metil-L-triptófano (1-L-MT) también invirtió la supresión de la proliferación de células T en los experimentos de cocultivo SKOV-3 /MLR (Fig. 2D). Sorprendentemente, la proliferación de células T no se ha mejorado pero inhibe en cocultivos tratados con 1-metil-D-triptófano (1-D-MT, Fig. 2E). La adición de trp no alteró esta inhibición, lo que indica que el agotamiento trp no está implicado en este efecto paradójico de 1-D-MT (Fig. 2F). A continuación se analizó el efecto de 1-D-MT en la progresión del ciclo celular y la proliferación de células SKOV-3, como un efecto inhibidor de la 1-D-MT en células SKOV-3 podría explicar la absorción reducida
3H timidina en los experimentos de cocultivo (Fig. 3). Sin embargo, 1-D-MT alterada ni
captación de 3H timidina (Fig. 3A) ni la progresión del ciclo celular de las células SKOV-3 (Fig. 3B). Para descartar, que 1-D-MT podría haber inhibido
captación de timidina 3H de SKOV-3 células sólo cuando éstas se cultivaron en la proliferación de células MLR, T en cocultivos de células SKOV-3 con MLR en presencia de diferentes concentraciones de 1-D-MT se midió por tinción con CFSE y citometría de flujo (Fig. 3C). 1-D-MT-concentración dependiente inhibió la proliferación de células T también en estos ensayos (Fig. 3C), lo que confirma que 1-D-MT inhibe la proliferación de células T y no la proliferación de SKOV 3-células en las cocultivos.
(A) mRNA expresión relativa de las tres enzimas degradadoras de trp IDO1, IDO2 y triptófano-2,3-dioxigenasa (TDO) (barras blancas) y la producción de kyn (barra de color negro) de Skov-3 células, medida por cuantitativa RT-PCR y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). (B) Derribo de
IDO1
ARNm de siRNA medidos mediante qRT-PCR. (C) Análisis de transferencia Western que muestra IDO1 expresión de proteínas en células SKOV-3 mediada desmontables con siRNA de IDO1 en comparación con los controles. (D) La inmunocitoquímica (rojo, tinción IDO1; azul, DAPI tinción nuclear) de control de SKOV-3 células y las células SKOV-3 con IDO1 caída. liberación (E) Kyn de SKOV-3 células después de desmontables de IDO1 en comparación con los controles. Los experimentos se realizaron al menos por triplicado. Los datos son la media ± SEM. * (P & lt; 0,05)
(A) la proliferación de células T alorreactivas después de la adición de 25 M kyn a las reacciones de leucocitos mixtos (MLR).. (B) la proliferación de células T alorreactivas en presencia de 6000 SKOV-3 células. (C) proliferación de células T en la MLR cocultured con 2000 de control Skov-3 células (barra blanca) o 2000 Skov-3 células con una caída de IDO1 (barra de color negro). la proliferación de células (D) T en co-cultivos de MLR con 2000 células SKOV-3 después de la adición de concentraciones crecientes de 1-L-MT. la proliferación celular (E) T en co-cultivos de MLR con 2000 células SKOV-3 después de la adición de concentraciones crecientes de 1-D-MT. (F) resultado representativo de MLR /SKOV-3 experimentos de cocultivo con PBMC de cinco donantes diferentes y 2000 o 6000 células SKOV-3. Las células fueron tratadas con o sin 1 mM 1-D-MT en combinación con o sin 250 trp M. La proliferación se midió mediante
3 [H] captación methylthymidine. Los experimentos se realizaron al menos por triplicado. Los datos son la media ± SEM. * (P & lt; 0,05) guía empresas
(A)
3 [H] methylthymidine incorporación de células Skov-3 tratadas con 1 mM de 1-D-MT (barra de color negro) o vehículo (blanco. bar) durante 6 días. (B) Análisis del ciclo celular de SKOV-3 células tratadas con 1 mM 1-D-MT o vehículo durante 48 h. (C) Análisis de proliferación de linfocitos teñidos con CFSE a partir de 6 cocultivos día de MLR con 2000 células SKOV-3, se trataron con las concentraciones indicadas de 1-D-MT (panel superior). Parcela de los números de células en cada generación del experimento anterior (panel inferior).
1- D-MT aumenta la producción de kyn en células cancerosas humanas
A continuación, probamos el efecto de 1-MT en la producción de kyn SKOV-3 células. Sorprendentemente, 1-D-MT dependiente de la concentración aumento de la formación kyn (Fig. 4A), mientras que su estereoisómero 1-L-MT formación kyn inhibida como se esperaba (Fig. 4A). La mezcla racémica de 1-MT, que se ha utilizado en muchos estudios, incluidos los que han establecido IDO1 como una enzima inmunosupresor, la formación de kyn inhibido, aunque menos de 1-L-MT solo (Fig. 4A). Como las concentraciones de trp en los medios de comunicación pueden haber limitado el aumento de la producción kyn, también medimos las concentraciones kyn producidos por células SKOV-3 en respuesta a la 1-D-MT en presencia de concentraciones crecientes del PRT. Bajo estas condiciones se alcanzaron concentraciones kyn mucho más altas (Fig. 4B), lo que sugiere que la meseta observó por encima de concentraciones de aproximadamente 250 mM 1-D-MT (Fig. 4A) era debido a la disponibilidad limitada trp. concentraciones PRT en medios de cultivo celular por lo general varían entre 12 y 20 mM mientras que las concentraciones en suero humano rango entre 50 y 70 mM. formación Kyn en células tratadas con 1-D-MT fue más pronunciado cuando se utilizaron concentraciones trp presentes en el suero humano (62,5 M) en lugar de concentraciones trp presentes en el medio de cultivo celular (15 M) (Fig. 4C). Sin embargo, el aumento de veces en kyn por adición de trp fue igual en las células tratadas con o sin 1-D-MT (Fig. 4C). A fin de probar si la 1-D-MT influye directamente IDO1 actividad enzimática se midió la producción de kyn mediada por IDO1 en Skov-3 extractos de células. 1-D-MT no alteró la formación de kyn independientemente de si trp estaba presente a una concentración fija de 100 mM (Fig. 4D) o a concentraciones equimolares a 1-D-MT (Fig. 4E), lo que sugiere que el aumento en la formación de kyn por 1-D-MT en Skov-3 no está mediada por un efecto directo de la 1-D-MT sobre la actividad enzimática IDO1.
concentraciones (a) kyn liberados por Skov-3 células después del tratamiento con 1- D-MT (círculos blancos), 1-L-MT (círculos negros) y la mezcla racémica de 1-MT (triángulos negros) se mide después de 48 h por HPLC. (B) de liberación Kyn de SKOV-3 células en respuesta a 500 mM 1-D-MT en presencia de concentraciones crecientes del PRT. de liberación (C) de las células Kyn Skov-3 tratados con diferentes concentraciones de trp solo (círculos abiertos) o en combinación con 1 mM 1-D-MT (círculos rellenos) se mide después de 48 h por HPLC. la producción de (D) Kyn en IDO1 ensayos enzimáticos llevados a cabo en la presencia de trp 100 mu M en combinación con el aumento de 1-D-MT concentraciones. de producción (E) Kyn de enzima IDO1 en presencia de concentraciones crecientes de trp solo (círculos abiertos) o en combinación con 1-D-MT (círculos rellenos). Los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos son la media ± SEM. * (P & lt; 0,05).
IDO1 expresión se ve reforzada por 1-D-MT en las células cancerosas humanas
A continuación, se investigó si la 1-D-MT influyó en la expresión de enzimas metabolizadoras de trp. Para nuestra sorpresa, encontramos que 1-D-MT aumentó IDO1 ARNm y proteína en Skov-3 células, mientras que IDO2 y TDO permanecieron inalterados (Fig. 5A). Upregulation de IDO1 mRNA fue dependiente de la concentración (Fig. 5B) y se detectó primero después de 16 h de incubación con 1-D-MT (Fig. 5C). Es importante destacar que los efectos de promoción de IDO1 no se limitaron a SKOV-3 células. Mientras 1-D-MT no indujo
de novo
IDO1 mRNA expresión y kyn producción en células de carcinoma cervical HeLa IDO1-negativas, aumentó IDO1 mRNA y la producción de kyn después de la inducción de la expresión y la producción IDO1 kyn por IFN- γ (Fig. 6A, B). Curiosamente, la regulación al alza mediada por D-MT-1 de IDO1 mRNA en muchas células de cáncer de IDO1-negativo fue dependiente diferencialmente de la concentración de IFN-γ que se utilizó para inducir
de novo
expresión de IDO1 (Fig. 6C). Después de la estimulación con concentraciones de IFN-γ apropiadas, 1-D-MT aumentó IDO1 mRNA y la producción de kyn en un panel de diferentes células cancerosas (Fig. 6C-F), lo que indica un mecanismo universal de la activación mediada por 1-D-MT de IDO1 .
(a) izquierdo del panel: la expresión del ARNm de IDO1, IDO2 y TDO en Skov-3 células después del tratamiento con 1 mM de 1-D-MT, analizó después de 24 h de QRT-PCR. Panel derecho: análisis Western Blot de la expresión IDO1 en células SKOV-3 lleva a cabo después de 48 h 1 mM 1-D-MT. GAPDH sirvió como control de carga. (B) la expresión de ARNm IDO1 en respuesta a concentraciones crecientes de 1-D-MT medidos después de 24 h de QRT-PCR. análisis (C) Tiempo de curso de IDO1 mRNA inducción por 1 mM 1-D-MT, se analizan mediante qRT-PCR. Los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos son la media ± SEM. * (P & lt; 0,05).
(A) gráficos de HPLC representativo de producción kyn de células HeLa, que se dejaron sin tratar, tratados con 1 mM 1-D-MT y /o 1.000 U de IFN gamma por 72 h. La absorción de kyn se midió a 365 nm. (B) en las células HeLa no tratadas 1 mM 1-D-MT no indujo
de novo
IDO1 mRNA, pero aumentó IDO1 mRNA después de su inducción por 1000 U expresión de ARNm de IFN-γ se analizó mediante qRT-PCR 24 h después del tratamiento. (C) ejemplo representativo del efecto de diferentes concentraciones de IFN-γ sobre la inducción de mRNA IDO1 por 1-D-MT, que se muestra en las células de glioma U251. (D) la expresión de mRNA IDO1 de las líneas celulares indicadas que se estimularon durante 24 h con concentraciones apropiadas de IFN-γ por sí solos (barras blancas) o en combinación con 1 mM 1-D-MT (barras negras). (E) ejemplo representativo de la inducción IDO1 mRNA por 200 M 1-D-MT en células de glioma T98G IFN-gamma estimulada. de liberación (F) Kyn de las líneas celulares indicadas que se estimularon durante 72 h con concentraciones apropiadas de IFN-γ por sí solos (barras blancas) o en combinación con 1 mM 1-D-MT (barras negras), medida por HPLC. Los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos son la media ± SEM. * (P & lt; 0,05).
IDO1 expresión mediada por 1-D-MT implica JNK y p38 MAPK
A continuación, explorar vías implicadas en la regulación al alza de IDO1 en respuesta a la señalización tratamiento 1-D-MT. fosforilación STAT1 mediada por IFN está implicado en la inducción de IDO1 en muchas células y tejidos [30] diferentes, pero desmontables de STAT1 por siRNA no disminuyó la producción kyn de 1--tratados con MT D células (Fig. 7A). En línea con este resultado, 1-D-MT no indujo la expresión de ARNm de IFN-β o IFN-γ (Fig. 7B). Se han notificado las vías activadas por mitógenos proteína quinasa (MAPK) para ser modulada por la mezcla racémica de 1-MT y de ese modo influir en la polarización de las células dendríticas (DC) [31]. Por lo tanto, si la prueba de inhibición de la señalización de MAPK afectó el aumento mediado por D-MT-1 en la expresión IDO1. La inhibición de la fosforilación de ERK por PD98059 afectada expresión IDO1 mRNA y la liberación kyn ni en sin tratamiento ni en 1-D-MT células tratadas (Fig. 8A). Mientras que la inhibición de la fosforilación de p38-MAPK por SB203580 [32] reducido ligeramente IDO1 mRNA en células no tratadas, casi por completo mitigó el aumento de la expresión mRNA IDO1 en respuesta a 1-D-MT (Fig. 8B). La ligera inhibición de IDO1 Transcripción en células no tratadas no se tradujo en la liberación kyn reducido significativamente, mientras que la reducción en la liberación de kyn convirtió significativo en 1-D-MT células tratadas (Fig. 8B). Se obtuvieron resultados similares cuando la inhibición de JNK por SP600125 (Fig. 8C) [33]. En conjunto, estos datos sugieren que p38 MAPK y la señalización de JNK están implicadas en la mediación de la inducción de IDO1 en respuesta a 1-D-MT
.
(A) Desmontables de STAT1 mRNA por si-ARN (barras blancas) no afectó liberación kyn (barras negras) de 1-D-MT (1 mM) tratados SKOV-3 células. (B) Análisis de IFN-γ y la expresión del ARNm de IFN-β en Skov-3 células después de la estimulación con 1 mM de 1-D-MT durante 24 h.
IDO1 ARNm (panel izquierdo) y kyn liberación (panel derecho) de las células SKOV-3 tratados con (A) 50 mM del inhibidor PD98059 MEK1, (B) 20 M de la SB203580 p38 inhibidor de MAPK y (C) 20 M de la SP600125 inhibidor de JNK o control 1 h antes adición de 1 mM 1-D-MT analizado por qRT-PCR después de 24 h y HPLC después de 48 h, respectivamente. Los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos son la media ± SEM. * (P & lt; 0,05) guía empresas
Discusión
En la inhibición IDO pasado se logró sobre todo el uso de la mezcla racémica de 1-MT [34].. Como se puso de manifiesto que la inhibición IDO puede ser un objetivo prometedor para la terapia del cáncer, los estereoisómeros individuales de 1-MT se investigaron con más detalle [5], [35]. Aunque 1-L-MT ha demostrado inhibir de manera más eficaz IDO1 en ensayos enzimáticos y en líneas celulares de cáncer, 1-D-MT mostró que la actividad anti-tumor superior en modelos de ratón y por lo tanto se eligió para los ensayos clínicos [35]. Un estudio posterior sugirió que la actividad anti-tumor Superior de 1-D-MT puede resultar de la inhibición de la isoforma IDO2 [27]. Estudios recientes indican que 1-D-MT inhibe la actividad de IDO ni en las células dendríticas, ni en células tumorales [26], [28] y no restaura eficazmente detención inducida por IDO de la proliferación de células T [36]. En nuestro estudio, 1-D-MT suprime la proliferación de células T cuando las células que expresan constitutivamente IDO1 Skov-3 fueron cocultured con reacciones mixtas de linfocitos (Fig. 2E, F). La investigación de los mecanismos subyacentes sorprendentemente reveló que 1-D-MT aumentó la producción kyn de las células cancerosas con actividad IDO1 (Fig. 4, 6), debido a la regulación positiva de IDO1 mRNA y expresión de la proteína (Fig. 5, 6). Se observó la regulación positiva de la expresión y la actividad IDO1 sólo en las células de cáncer con expresión IDO1 constitutiva o IFN-γ inducida (Fig. 5, 6). Upregulation de IDO1 por 1-D-MT en muchas células cancerosas fue más prominente en concentraciones moderadas de IFN-γ que pueden parecerse a concentraciones fisiológicas (Fig. 6C). Las bajas concentraciones de IFN-γ no pueden haber inducido una expresión suficiente IDO1 (Fig. 6C), posiblemente explicar por qué 1-D-MT no aumentó IDO1 a estas concentraciones, mientras que la estimulación con concentraciones muy altas de IFN-γ puede haber resultado en maximal IDO1 inducción (Fig. 6C), lo que explica por qué no se observó un aumento adicional de 1-D-MT. En todas las células IDO1 expresan examinados un aumento de la expresión y kyn liberación IDO1 se observó en respuesta al tratamiento con 1-D-MT, lo que indica un mecanismo general implicado en la inducción IDO1 mediada por 1-D-MT (Fig. 4, 5, 6).
En un estudio previo, se ha informado de la mezcla racémica de 1-MT para modificar la polarización de las células dendríticas (DC) mediante la modulación de MAPK [31]. La inhibición de la fosforilación de p38 MAPK impidió el aumento de la IDO1 mRNA y la producción de kyn por la señalización de 1-D-MT (Fig. 8B), lo que sugiere que p38-MAPK participa en 1-D-MT mediada. En línea con este resultado, MAPK p38 ha sido previamente demostrado que contribuyen a la inducción de IDO1 en una línea celular de leucemia y en la CC [37], [38]. También la inhibición de la señalización de JNK mitigado la inducción de mRNA IDO1 y liberación kyn en presencia de 1-D-MT (Fig. 8C). La inhibición de la fosforilación de JNK se ha descrito recientemente para disminuir IDO1 expresión inducida por LPS en microglia de ratón [39]. 1-D-MT mediada por la modulación de p38-MAPK y JNK sugiere que el 1-D-MT puede tener más efectos que sólo la regulación al alza de IDO1.
A nuestro entender este es el primer reporte de 1-D- efectos sobre la expresión de genes en células humanas MT-mediada. El estereoisómero de 1-D-MT, 1-L-MT se informó recientemente para suprimir la expresión inducida por IFN-γ de IDO1 en células de carcinoma de recto ratón [40]. Además, se ha descrito previamente que 1-MT influye en la maduración de las DC con independencia de IDO [31]. Sin embargo se usó la mezcla racémica de 1-MT en este estudio y por lo tanto, no se conoce que estereoisómero era responsable de los efectos observados [31]. Queda por dilucidar si el 1-D-MT ejerce más efectos sobre la expresión génica de la regulación de IDO1. En contraste con IDO1, la enzima IDO2 trp-catabolizantes no fue inducida por 1-D-MT. Este hallazgo subraya la noción de que IDO1 y IDO2 son regulados diferencialmente en un nivel transcripcional [27]. Otros posibles efectos de la 1-D-MT sobre la expresión génica pueden contribuir a la alta eficacia de anti-tumor de 1-D-MT observado en modelos de tumores de ratón [35]. Existen diferencias significativas en la expresión y regulación IDO entre humanos y ratones [29], [41], lo que podría explicar las discrepancias observadas en relación con la acción 1-D-MT en modelos de ratones y células humanas. En un estudio con 1-D-TM en SIV infectados macacos rhesus, un modelo más parecido a los humanos que los modelos de ratón, Boasso y colegas observó que los niveles plasmáticos kyn no se redujeron, sino que indujeron durante el tratamiento con 1-D-MT [42 ]. El aumento de expresión IDO1 mRNA en los ganglios linfáticos de macacos después del tratamiento 1-D-MT fue interpretado como un mecanismo compensatorio counterregulatory activado por 1-D-MT, que puede haber contabilizado la falta de efecto sobre kyn plasma [42]. Nuestros datos muestran que la regulación positiva de IDO1 y kyn tienen lugar también en las células humanas aisladas, en el que un mecanismo de counterregulatory que media la inmunosupresión es poco probable.
Como existen pruebas de que IDO1 puede restringir el crecimiento del tumor como un mediador de tumoricida IFN -γ en modelos experimentales y los pacientes [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22] y como la expresión en tumores IDO1 correlacionó positivamente con la supervivencia a largo y libre de progresión supervivencia a largo plazo en algunos estudios [23], [24], es tentador especular que la inducción de IDO1 por 1-D-MT en realidad puede dar cuenta de algunos de los efectos antitumorales de 1-D-MT.
en conclusión, hemos identificado la regulación positiva de la expresión IDO1 en las células de cáncer humano como un profundo efecto del 1-D-MT, un compuesto utilizado actualmente en estudios clínicos en pacientes con tumores sólidos en recaída o refractarios con el objetivo de inhibir (IDO ) mediada escape inmune del tumor. expresión IDO1 se sabe que es inmunosupresora y puede mejorar escape inmune tumor, sino que también ha sido implicado en los efectos directos anti-tumorales. Se necesitan más estudios para comprender mejor el papel de IDO en la biología del cáncer y el uso potencial de 1-D-MT como un agente anti-cáncer.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
SKOV-3 y NIH: OVCAR-3 células de carcinoma de ovario se cultivaron en medio de McCoy 5A (BioConcept, Allschwil, Suiza) suplementado con L-Trp, como se indica (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania), 300 mg /L glutamina (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania), 10% de FBS (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE.UU.) y 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (PAA Laboratories, Pasching, Austria). HeLa células de carcinoma cervical, células de melanoma maligno A375, se mantuvieron células de glioma maligno LN18, LNT229, T98G y U251 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, PAA) que contiene 10% de FBS (Thermo Fisher Scientific Inc) y 100 U /ml de penicilina y 100 g /ml de estreptomicina (PAA Laboratories). células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron a partir de cinco, no relacionadas con la sangre de donantes sanos por centrifugación en gradiente de densidad usando separación de linfocitos LSA medio 1077 (PAA Laboratories) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (PAA Laboratories) que contiene 10% de FBS (Thermo Fisher Scientific Inc) y 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (PAA Laboratories). Todas las células se ensayaron de forma rutinaria para la contaminación por la célula Multiplex contaminación de prueba [43]. Los cultivos se incubaron a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera
20 mM de soluciones madre de 1-metil-D-triptófano (1-D-MT, números de lote: 09315BH, 08007EJ). y 1-metil-L-triptófano (1-L-MT, números de lote: 08023HE, 15399MJ) (Sigma-Aldrich) se prepararon disolviendo los inhibidores en NaOH 0,1 N. El pH se ajustó a 7,5 usando ácido clorhídrico. Para evitar la contaminación de los cultivos celulares, las soluciones madre se filfotered por 0,2 micras filtros. IFN-γ se adquirió de ImmunoTools (Friesoythe, Alemania). fosforilación de ERK se inhibió mediante el inhibidor de MEK1 PD98059 (Cell Signaling Technology, Beverly MA, EE.UU.). La quinasa c-Jun N-terminal (JNK) SP600125 inhibidor y el inhibidor de la fosforilación de la quinasa p38 SB203580 se adquirieron de Enzo Life Sciences (Lörrach, Alemania).
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se realizó de acuerdo con [44] utilizando un Beckman HPLC con matriz de fotodiodos (PDA) detección y Lichrosorb columna RP-18 (250 mm x 4 mm ID, 5 m, Merck, Darmstadt, Alemania ). liberación Kyn y la degradación trp se midieron en el medio de 3 * 10
5 células en 2 Medio de ml McCOY 5A (BioConcept) que contiene 10% de FBS (Perbio), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (PAA Laboratories ) suplementado con 0-125 mM L-trp (Sigma-Aldrich). El medio se recolectó a partir de placas de 6 pocillos en los puntos de tiempo indicados, se centrifugó y se congeló hasta el análisis adicional. Después de la descongelación, las muestras se complementaron con ácido tricloroacético para precipitar las proteínas, se centrifugaron y 100 l del sobrenadante se analizó por HPLC. Las curvas de calibración se generaron con L-kyn y L-trp (Sigma-Aldrich) en el mismo medio. Desde FBS contiene kyn, kyn bajas concentraciones (aproximadamente 1 M) se detectaron en todas las muestras y medio sin células siempre se midió para la comparación.
Cuantitativa (q) RT-PCR
El ARN total fue aisló con el kit de aislamiento de ARN Qiagen RNAeasy (Hilden, Alemania) y el ADN se sintetizó con el de Applied Biosystems transcripción inversa-kit (Foster City, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. QRT-PCR se preformados en un termociclador ABI 7000 con SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) de acuerdo con protocolos estándar. Las reacciones de PCR se verificó mediante la inclusión de no-RT-controles, por omisión de las plantillas y por tanto la curva de fusión y análisis en gel. Las curvas de calibración se generaron para cada gen. Cuantificación relativa de la expresión génica se determinó por comparación de los valores de umbral. Todos los resultados se normalizaron a GAPDH, que variaba ni con IFN-γ ni tratamiento con 1-D-MT
Primer secuencias fueron (5'-3 'hacia adelante, hacia atrás):.
CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC, TGAGCGATGTGGCTCGGCT (GAPDH), Francia
TTCAGTGCTTTGACGTCCTG, TGGAGGAACTGAGCAGCAT (IDO1), Francia
TGCTTCATGCCTTTGATGAG, GAAGGCCTTATGGGAAGGAG (IDO2), Francia
ACTGCCTCAAGGACAGGATG; AGCCAGGAGGTTCTCAACAA (IFN-β), Francia
TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA; TCCTTTTTCGCTTCCCTGTTTT (IFN-γ), Francia
AGGAAAAGCAAGCGTAATCTTCA; TATTCCCCGACTGAGCCTGAT (STAT1), Francia
GGTTCCTCAGGCTATCACTACC; CAGTGTCGGGGAATCAGGT (TDO) guía empresas
fue utilizado siRNA experimentos
a desmontables IDO1 (INDO) y STAT1 EN-TARGETplus SMART-piscina siRNA por Dharmacon ARN Tecnologías (Lafayette, CO, EE.UU.).
Las secuencias fueron los siguientes:
INDO humano, NM_002164
, sentido, 5'-UCACCAAAUCCACGAUCAUUU-3 ', antisentido, 5'-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3'; sentido, 5'-UUUCAGUGUUCUUCGCAUAUU-3 ', antisentido, 5'-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3'; sentido, 5'-GUAUGAAGGGUUCU GGGAAUU -3 ', antisentido, 5'-PUUCCCAGAACCCUUCAUACUU-3'; sentido, 5'-GAA CGGGACACUUUGCUAAUU-3 ', antisentido, 5'-PUUAGCAAAGUGUCCCGUUCUU-3'
STAT1 humano, NM_139266
, sentido, 5'-GCACGAUGGGCUCAGCUUUUU-3 ', antisentido, 5 '-PAAAGCUGAGCCCAUCGUGCUU-3'; sentido, 5'-CUACGAACAUGACCCUAUCUU-3 ', antisentido, 5'-PGAUAGGGUCAUGUUCGUAGUU-3'; sentido, 5'-GAACCUGACUUCCAUG CGGUU-3 ', antisentido, 5'-PCCGCAUGGAAGUCAGGUUCUU-3'; sentido, 5'-AGAAAGAG CUUGACAGUAAUU-3 ', antisentido, 5'-PUUACUGUCAAGCUCUUUCUUU-3'.
ON-TARGETplus siCONTROL no director piscina (D-001810-10-05, Dharmacon) y una transfección sin siRNA se utilizaron como controles negativos.
Para la transfección de ARNsi, se utilizó el Kit Amaxa Nucleofector V (Applied Amaxa, Köln, Alemania). Brevemente, 3 * 10
5 células se resuspendieron en 100 l de la solución nucleofector V y se mezcla con 1,5 g de siRNA, a continuación, a electroporación usando V005 programa. El medio se cambió después de 24 h, el análisis del contenido de kyn del medio por HPLC, la recolección de las células para la extracción de ARN o la generación de lisados y análisis inmunocitoquímico se lleva a cabo después de 48 h.
análisis de transferencia de Western
lisados de células enteras se prepararon en hielo frío tris (hidroximetil) aminometano clorhidrato (TRIS-HCl, 50 mM, pH 8,0; Carl Roth) que contiene NaCl 150 mM (JT Baker, Deventer, Países Bajos), 1% de Triton X-100 (AppliChem, Darmstadt, Alemania), EDTA 10 mM (Gerbu Biotechnik, Gaiberg, Alemania), ditiotreitol 200 mM (Carl Roth), 3% de 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich), 100 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF),