Extracto
La infección por el virus del papiloma humano (VPH) puede causar neoplasia intraepitelial cervical (CIN) y cáncer. El descenso de regulación de la expresión de E6 y E7 pueden ser responsables de los resultados clínicos positivos observados con el tratamiento con IFN, pero la base molecular no ha sido bien determinado. Como miRNAs juegan un papel importante en la carcinogénesis cervical HPV inducida, que postula que IFN-β puede regular la expresión de miRNAs específicos en células de cáncer cervical, y que estos miRNAs puede mediar E6 y E7 expresión, por lo tanto modular su potencial oncogénico. En este estudio, encontramos que el miR-129-5p para ser un candidato de IFN-β inducible miARN. los niveles de miR-129-5p disminuyen gradualmente con el desarrollo de lesiones intraepiteliales cervicales. Manipulación de la expresión de miR-129-5p en las células Hela modula el VPH-18 E6 y E7 expresión de genes virales. Exógenos miR-129-5p inhibe la proliferación celular en células HeLa, promueve la apoptosis y bloquea la progresión del ciclo celular en células HeLa. SP1 es un objetivo directo de miR-129-5p en células HeLa. Este estudio es el primer informe de un miARN celulares con actividad anti-VPH y proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos de regulación entre el VPH y el sistema de IFN en células huésped a nivel miARN
Visto:. Zhang J, Li S , Yan Q, Chen X, Yang Y, Liu X, et al. (2013) El interferón-β inducida por
microARN-129-5p
regula a la baja el VPH-18 E6 y E7 Viral de la Expresión Génica por orientación SP1 en células de cáncer de cuello uterino. PLoS ONE 8 (12): e81366. doi: 10.1371 /journal.pone.0081366
Editor: Junming Yue, la Universidad de Tennessee Health Science Center, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Julio, 2013; Aceptado: 11 Octubre 2013; Publicado: 16 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La presente estudio fue apoyado por los Fondos nacionales de Ciencias Naturales de china (Nos. 81072139 y 30872760) y la fundación 2011 Shanghai especial municipal para el cuidado de la salud (No.201002013). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El carcinoma de cuello uterino y de la neoplasia intraepitelial cervical (NIC) son causadas por la infección persistente por el virus del papiloma humano de alto riesgo (VPH), los serotipos más comúnmente HPV16 y HPV18 [1]. Por lo tanto, el tratamiento de la infección por el VPH es la clave para la prevención del cáncer de cuello de útero y CIN. Dos oncoproteínas, E6 y E7, que codificaban por HPV16 y HPV18, pueden unirse y estimular la degradación del supresores de tumores p53 y pRb [2] - [5]. IFN ha sido ampliamente utilizado en el tratamiento de CIN y cáncer cervical. Baja regulación de la expresión de E6 y E7 puede ser responsable de los resultados clínicos positivos observados con el tratamiento con IFN, pero la base molecular no ha sido bien determinada.
Los microARN (miRNA) son 19-25 nt ARN reguladores que participan en la regulación de diversas funciones biológicas, así como en la defensa contra patógenos en numerosos linajes eucariotas. Se cree generalmente para actuar mediante la unión a secuencias complementarias de manera imperfecta en la región 3 'no traducida (UTR) de los genes diana, lo que resulta en la traducción o degradación disminuida de la transcripción diana. En particular, la secuencia complementaria en el par 6-8 base "región de la semilla" en el extremo 5 'de los genes miARN-mRNA heterodúplex parece determinar la especificidad de las interacciones entre los genes miARN-targetRNA. MiRNAs pueden tener efectos pleiotrópicos sobre la proliferación celular, la apoptosis y la diferenciación celular [6]. Se han reportado alteraciones en los patrones de miARN celulares en el tejido de cáncer cervical o células de cáncer cervical. Regulación a la baja de los recursos humanos de miR-218 [7], [8] y miR-34a [9] en células de cáncer de cuello uterino se dirigieron a los VPH 16 E6 oncogén, mientras que la inhibición de miR-21 en el VPH 18 que contienen las células de cáncer de cuello uterino Hela causa una fuerte supresión de la proliferación celular [10]. Por tanto, parece que los miRNAs juegan un papel importante en la carcinogénesis cervical por VPH.
MiRNAs pueden desempeñar un papel en el IFN-β inducida E6 y E7 represión. Se ha miRNAs 1shown puede ser inducida por IFN-β. En las células RSA, IFN-β puede inducir la expresión de miR-431, que puede regular a la baja IGF1R y IRS2 expresión y por lo tanto inhibir la proliferación celular mediante la supresión de la vía MAPK [11]. En los hepatocitos, IFN-β media la modulación de la expresión de numerosos miRNAs celulares con casi perfecta complementariedad en sus secuencias de semillas con el genoma de ARN del VHC que son capaces de inhibir la replicación del VHC y la infección [12]. Como miRNAs juegan un papel importante en la carcinogénesis cervical HPV inducida, que postula que IFN-β puede regular la expresión de miRNAs específicos en células de cáncer cervical, y que estos miRNAs puede mediar E6 y E7 expresión, por lo tanto modular su potencial oncogénico. Para comprobar esto, hacen pruebas de miRNAs expresados y regulados diferencialmente en 18 VPH-Hela células positivas después de la exposición a IFN-β, y encontramos que el miR-129-5p para ser un candidato IFN-ß inducible miARN que puede regular a la baja E6 y E7 expresión.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares y tejidos humanos
La línea 18 del VPH-positivo de células Hela [13], el VPH 16-negativo línea celular Siha [13] , C33A línea de VPH-negativas cervical de células de cáncer [13] y el carcinoma de células línea bien diferenciado de células escamosas del cuello uterino HCC94 [14] se utilizaron en este estudio. Todas estas células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% FBS a 37 ° C y 5% de CO
2. Las líneas celulares se recogieron después de IFN-β (3 × 10
5 UI L
-1) el tratamiento durante 2 h.
cuello uterino normal y tejidos de cáncer de cuello uterino se obtuvieron de las mujeres de edades comprendidas entre 28 a 77 años de edad. Cuatro muestras cervicales normales se obtuvieron de pacientes que se sometieron a histerectomía para tratar otros tipos de enfermedades como el mioma o adenomiosis. Ninguno de los pacientes había sufrido la terapia hormonal, radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Las etapas y grados histológicos de estos tumores se establecieron de acuerdo con los criterios de la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO). Cada muestra de tejido fue inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C hasta la extracción de ARN. Antes consentimiento escrito e informado se obtuvo de cada paciente, y el estudio fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiao Tong. Los datos clínicos y patológicos relacionados con las muestras clínicas se presentan en la Tabla 1.
microarrays de perfiles de expresión y análisis de datos
El ARN total de las células o los tejidos se aislaron utilizando Tri-reactivo (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) según las instrucciones del fabricante. Después de pasar mediciones de la calidad del ARN en un instrumento Nanodrop, las muestras se marcaron utilizando el kit de etiquetado de alimentación miRCURY ™ HY3 ™ /hY5 ™ y se hibridaron en la matriz de miRCURY ™ LNA (v.11.0). Las muestras se hibridaron en una estación de hibridación siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. Escaneo se realizó con el escáner GenePix 4000B microarrays Axon. GenePix Pro V6.0 se utiliza para leer la intensidad en bruto de la imagen. Los valores límite utilizados para detectar diferencialmente expresado miRNAs fueron ≥1.5 veces los cambios o ≤0.7, y
P
valora ≤0.05 en pruebas t se consideraron significativos.
semillas Crucial análisis de la secuencia complementariedad
procesamiento de datos de la matriz y el análisis fundamental secuencia de semillas complementariedad se realizaron con los sitios web (http://www.mirbase.org/, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db = PubMed y http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/).
Análisis de los genes miARN ARNm y por qPCR
ARN total fue extraído a partir de células cultivadas y tejidos usando Tri-reactivo. Para el análisis de los genes miARN, miRNAs maduros fueron transcritas inversa a partir de ARN total usando cebadores específicos de genes miARN RT en los TaqMan microARN Los ensayos y los reactivos en el kit TaqMan MicroARN transcripción inversa. qPCR se realizó usando cebadores TaqMan MicroARN de ensayo con el Master Mix TaqMan PCR Universal y se analizó con un sistema ABI Prism 7000 de detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante.
U6B
se detectó como un control interno para normalizar todos los datos. Los nombres de ensayo para
miR-129-5p
y
U6B
eran HSA-mir-129-5p y RNU6B, respectivamente (Applied Biosystems). El cDNA se generó usando el Kit Primer Guión RT Reactivo (Takara, Dalian, República Popular China). Para la cuantificación de HPV18
E6
, HPV18
E7
y
ISG54
, PCR en tiempo real se llevó a cabo en el sistema de detección de secuencias ABI 7000 Prism con SYBR Premezcla Ex Taq ( Takara). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 2. Para todos los ensayos de qPCR, expresiones se calcularon por la fórmula 2
(- ΔΔCt), donde Ct es la diferencia entre Ct gen y gen normalizador Ct. Ct representa el ciclo de umbral en el que la fluorescencia aumenta de forma estadísticamente significativa por encima de la línea de base. Los experimentos se realizaron por triplicado en tres experimentos independientes.
transfecciones celulares
Las células se lavaron con PBS y se cambiaron a medio de cultivo libre de antibióticos durante 24-48 h antes de la transfección. Las células fueron transfectadas transitoriamente con
pre-miR-129-5p
, control de miARN no específica (pre-miR-negativo) o control en blanco (Applied Biosystems) en Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando agente SIPORT NeoFX transfección (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo del fabricante. El medio se reemplazó 8 h más tarde. número de copias iguales de plásmidos se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Luciferasa reportero vector que lleva los sitios diana para
miR-129-5p Red de la
SP1
región 3'-UTR fue comprada por Shanghai choseasy co., Ltd. La información detallada sobre las construcciones utilizadas en este experimento se muestran en la Tabla 3.
ensayos de proliferación
Las células (3000 por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 72 h después de la transfección (concentración final miARN de 100 nM) en DMEM /F12 que contiene 10% de FBS. La proliferación celular se documenta cada 24 h durante 3 días usando el ensayo MTT colorimétrico (Sigma, St. Louis, MO), y la absorbancia a 490 nm se evaluó por un lector Spectra Max 190 de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
las células, incluyendo las células transfectadas, se mueren de inanición durante 24 h reemplazando el medio con fenol medio DMEM /F12 sin rojo y libre de suero (Hyclone Laboratories, Logan, UT), y el control del vehículo apropiado con rojo fenol libre de medio que contiene despojada de carbón 5% de FBS (Hyclone Laboratories) durante 48 h. La proliferación celular se documenta cada 24 h durante 2 días. Dentro de un experimento individual, la proliferación en cada condición se ensayó por triplicado, y el experimento global se repitió al menos dos veces.
ciclo celular análisis
Las células fueron fijadas con 70% de etanol a 72 h después de la transfección y se tiñeron con 25 mg /PI ml (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) en tampón FACS (PBS que contiene 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,05% de Triton X-100, y 50 mg /ml de RNasa a) . Después de 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz, las células se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un Becton Dickinson FACScan, y las fracciones de las células en la fase G0 /G1, S y G2 /M fases se analizaron utilizando la célula de Quest Pro Software (BD Biosciences, San Jose, CA). Los experimentos se realizaron por triplicado en tres experimentos independientes.
Anexina V ensayo
Las muestras se lavaron con PBS y el uso de la anexina V-FITC y PI tinción para la determinación de la exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática externa . Después de incubación durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz, las muestras se cuantificaron por citometría de flujo, utilizando un Becton Dickinson FACScan. Los experimentos se realizaron por triplicado en tres experimentos independientes.
ensayos de reportero de luciferasa
Para los ensayos de luciferasa, las células (15.000 por pocillo) se sembraron 24 horas antes de la transfección en blanco, de fondo transparente de 96 pocillos platos. Las células se co-transfectaron con 100 ng de
SP1
3'-UTR plásmido reportero con 50 nM pre-MIR construir usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La actividad de luciferasa se ensayó 24 h después de la transfección con el Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) y se midió con un lector de placas Envision (Perkin Elmer Inc., Wellesley, MA). Las muestras se analizaron por triplicado en tres experimentos independientes.
Western blot
Después de los tratamientos indicados, se recogieron las células y las proteínas preparadas usando NE-PER nuclear y citoplasmática reactivo de extracción (Pierce, Rockford , IL) con un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics). Todos los extractos fueron lisadas de acuerdo con el protocolo del fabricante. El contenido total de proteína se determinó por el método de proteínas de Bradford utilizando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). Las proteínas (60 g) se cargaron en prefabricado 4% de apilamiento, 10% en geles de Tris glicina y se separaron por electroforesis en gel seguido de transferencia electroforética a una membrana de PVDF. Después de lavar con solución salina tamponada con Tris, las membranas se bloquearon con 5% BSA /PBS durante 1 h. Las membranas se incubaron con anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra SP1 y p21 (1:1000 dilución) (Abcam, UK). Las membranas se incubaron con un anti-anticuerpo secundario de conejo de cabra (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y las proteínas borrados se visualizaron utilizando el sistema mejorado de detección de quimioluminiscencia (Pierce), con pre-manchado marcadores (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) como patrones de tamaño molecular. Las intensidades de las bandas de proteína se cuantificaron utilizando el software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
El análisis estadístico
Todas las pruebas se realizaron con el paquete estadístico para el software de Ciencias Sociales versión 17.0 (Chicago, IL, EE.UU.). Los datos se representan como medias con desviación estándar (SD). La significación estadística se determinó con pruebas t Student, y
P
los valores inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras.
Resultados
miARN expresión de perfiles en las células HeLa inducidas por el IFN-β
Hela Los miRNAs expresados diferencialmente entre los no tratados y IFN-β inducida las células se analizaron utilizando microarrays. Las expresiones de
miR-129-5p
,
miR-637
,
miR-744
y
miR-943
resultaron ser más altamente inducida en células Hela por IFN-β y seleccionado para su posterior análisis (Tabla 4, y la Fig. S1). La secuencia de semillas de
miR-129-5p
muestra perfecta complementariedad con el VPH-18 genoma (Fig. 1). Cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) fue entonces llevada a cabo para validar el análisis de microarrays, y los resultados demostraron que las expresiones de
miRNA-744
,
miR-943
y
miR 129-5p
eran básicamente consistente con el de la micromatriz; tiempo de análisis de expresión reveló que la inducción de
miR-129-5p
se produjo rápidamente, alcanzando un máximo a las 48 h. Al igual que en la inducción de
ISG54
, un gen bien caracterizado IFN-β regulada, la regulación positiva de
miR-129-5p
siguió una curva dosis-respuesta clásica entre 3 y 3000 UI
-1 ml de IFN-β (Fig. 2).
(A) la validación de los datos de microarrays por qPCR. ensayos por triplicado se realizaron para cada muestra. Inducciones de los genes de IFN-regulada conocidos
ISG54
y
ISG56
se muestran para comparsion. (B) Evolución temporal de la inducción de los genes miARN por IFN-β. Hela células fueron estimuladas con 300 UI ml
-1 IFN-β durante los tiempos indicados, y
miR-129-5p y
ISG54
ISG56
expresiones /se cuantificaron por qPCR. (C) Análisis de dosis-respuesta de la inducción de los genes miARN por IFN-β. Hela células fueron estimuladas con las dosis indicadas de IFN-β durante 2 h, y
miR-129-5p
y
ISG54
/
ISG56
expresiones fueron cuantificados por qPCR.
niveles de miR-
129-5p disminuyen gradualmente con el desarrollo de lesiones cervicales intraepiteliales y se correlacionan con el VPH-18 E6 y E7 expresión
Por qPCR análisis en muestras de lesión intraepitelial cervical humano y los tejidos cervicales normales, la
miR-129-5p
niveles de expresión eran mucho más bajos en cáncer que en NIC I-II y muestras cervicales normales (Fig. 3 a). las expresiones promedio de
miR-129-5p
fueron 10.90 ± 4.01, 4.54 ± 3.12, 1.07 ± 0.65 y 0.57 ± 0.67, respectivamente, en los tejidos normales del cuello uterino (control), grupo NIC I-II, CIN grupo III, y los grupos de carcinoma de células escamosas. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas en las expresiones
miR-129-5p al comparar los cuatro grupos (
P Hotel & lt; 0,05). Las etapas clínicas y patológicas grados del grupo CIN I-II en comparación con los otros grupos se confirmó que eran significativamente diferentes (
P
& lt; 0,05). VPH-18 E6 y E7 expresión se incrementaron significativa del grupo cuello uterino normal, el grupo de CIN I-II, grupo CIN III, y el grupo de carcinoma de células escamosas (P & lt; 0,05, Fig 3 B, C.). Las expresiones promedio de VPH-18 E6 fueron 1,67 ± 0,41, 3,55 ± 0,73, 4,70 ± 0,53 y 0,94 ± 0,33, respectivamente, en los tejidos cervicales normales (control), el grupo de CIN I-II, grupo CIN III, y el carcinoma de células escamosas grupos, mientras que las expresiones medios de HPV-16 E7 fueron 1,90 ± 0,35, 3,67 ± 0,55, 6,87 ± 1,33 y 1,23 ± 0,24 en estas muestras. correlación negativa se ha encontrado entre la expresión de miR-129-5p y VPH-18 E6 /E7 en muestras de tejido del cuello del útero (P & lt;. 0.05, la figura 3 D, E).
(A) La expresión de miARN-129-5p en muestras de lesión intraepitelial cervical humano y los tejidos normales del cuello uterino. (B) La expresión de HPV-18 E6 en las mismas muestras. (C) La expresión de HPV-18 E7 en estas muestras. (D, E) Correlación entre la expresión de VPH-18 E6 /E7 y miR-129 en estas muestras.
Manipulación de
miR-129-5p
expresión en células HeLa modula el VPH-18
E6
y
E7
expresión de genes virales
Para evaluar si
miR-129-5p
tiene un papel funcional en la descendente regulación de HPV18
E6
y
E7
, hemos manipulado el nivel de expresión de
miR-129-5p Hoteles en células HeLa. Los tres grupos incluyen células control (sin tratar), células transfectadas con el control miARN no específica
(pre-miR-negativo)
, las células transfectadas con
pre-miR-129
. A las 72 h después de la transfección transitoria de pre-miRNAs, las expresiones de ARNm de VPH-18
E6
y
E7 Hoteles en células HeLa fueron detectados por qPCR. La transfección de
pre-miR-129-5p
disminuyó significativamente el VPH-18
E6
y
E7
ARNm (Fig. 4B, la Fig. 4C y la Fig. S2), y este efecto fue altamente específica, como
pre-miR-negativo
transfección mostraron ningún efecto sobre la expresión de VPH-18 E6 y E7.
Fig. (a) demostró la eficacia de miR-129 transfección. Doblar cambios en las expresiones de (B) por VPH-18
E6
y (C) el VPH-18
E7 Hoteles en células Hela determinados por qPCR. El experimento se repitió dos veces, cada uno con tres repeticiones. Se muestran los medios (barras) y SDC (barras de error). *
P
. & Lt; 0,001
exógena
miR-129-5p
inhibe la proliferación celular en células Hela
A continuación se probó si el aumento niveles de
miR-129-5p
podrían disminuir el potencial de proliferación de las células HeLa como se informa en las células de cáncer de vejiga. Un ensayo basado en MTT se realizó para evaluar la proliferación de células HeLa por hasta 72 h después de la transfección con
miR-129-5p
. El ensayo de proliferación reveló que
miR-129-5p
sobreexpresión inhibe el crecimiento celular (Fig. 5), mientras que las células transfectadas con los genes miARN de control continuó creciendo durante este período.
El crecimiento celular se medido mediante un ensayo MTT. El experimento se repitió al menos dos veces, cada una con tres réplicas, y los datos se expresan como absorbancias medias con SD. *
P Hotel & lt; 0,001;#
P
. & Lt; 0,05
exógena
miR-129-5p
promueve la progresión del ciclo celular y la apoptosis en las células Hela bloques
determinado por el etiquetado Anexina V, las células no tratadas y las tratadas con
controles pre-miR-negativos permanecieron viables y eran principalmente Anexina V y yoduro de propidio (PI) negativo. Un desplazamiento hacia la derecha en la célula activada por fluorescencia perfil (FACS), indicativo de apoptosis, se observó para las células HeLa transfectadas con
pre-miR-129-5p
(Fig. 6).
análisis de la anexina V mostró que las células HeLa transfectadas con
pre-miR-129-5p
muestran un nivel significativamente mayor apoptosis de los grupos de control. *
P Hotel & lt; 0,01,#
P
. & Lt; 0,05
Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo demostró que la proporción de células en G0 /G1 y S fases en los controles negativos se mantuvieron sin cambios en comparación con las células no tratadas. La transfección de células HeLa con
pre-miR-129-5p
resultó en una acumulación de células en la fase G0 /G1 y una disminución de las células en la fase S en comparación con las células de control. Análisis de citometría de flujo sugirió que
miR-129-5p
podría detener las células Hela en el G1 /S de control y retrasar el ciclo celular de entrar en la fase S. En consecuencia,
miR-129-5p
sobreexpresión frenado la progresión del ciclo celular y causó un bloque de la fase G1 del ciclo celular, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa.
SP1
es un objetivo directo de
miR-129-5p Hoteles en células Hela
un ensayo doble-informador de luciferasa se utilizó para determinar si
miR-129-5p
podía se unen a los sitios de destino
miR-129-5p dentro del
SP1
3'-UTR. Se utilizó construcciones que contienen la secuencia de semillas predicho para probar el efecto inhibidor de
miR-129-5p
. La transfección de
pre-miR-129-5p
en células HeLa durante 48 h disminución de la actividad de luciferasa en comparación con el control negativo. Si bien no se observó cambio en la actividad cuando se transfectan con el control (Fig. 7B), análisis de transferencia Western verificó que exógeno
miR-129-5p
podría reducir los niveles de proteína de SP1 (Fig. 7C).
mapa de restricción (A) Vector. (B) SP1 fue el objetivo de miR-129-5p a través de su 3'UTR en células HeLa como se evaluó utilizando un ensayo de luciferasa. (C) análisis de Western blot de p21, SP1 y GAPDH en células HeLa después de miR-129-5p sobre-expresión. Se muestran los medios (barras) y SD (barras de error) * P & lt;.. 0,05
Discusión
En este informe, hemos identificado miRNAs inducidas con IFN-beta en el VPH-18 células Hela positivos. el análisis de microarrays miARN mostró las expresiones de
miR-129-5p
,
miR-637
,
miR-744
y
miR-943 se incrementaron
, mientras que
miR-526 *
fueron regulados a la baja después de la estimulación con IFN-β.
miR-129-5p
fue escogido para el estudio adicional, como el análisis bioinformático reveló que
las secuencias de genes virales del VPH-18 miR-129-5p Opiniones y son totalmente complementarias. Se ha demostrado que el miR-129-5p fue desregulado en varios tipos de tumores, incluyendo cáncer endometrial, cáncer de esófago, cáncer de colon y cáncer de vejiga, y sus genes diana verificadas incluido SOX4 [15] - [17], VCP /p97 [18] y CDK6 [19]. La sobreexpresión de miR-129-5p puede inhibir el crecimiento celular e inducir la muerte celular en el cáncer de vejiga [17] y el cáncer hepatocelular [18], sin embargo, su papel en el cáncer de cuello uterino no está claro.
Hemos encontrado que miR-129-5p sobre-expresión podría inhibir el crecimiento de células Hela a aproximadamente 70,23% de las células de control. Mientras tanto, el pre-miR-129-5p transfectadas aumenta la detención de las células Hela en la fase G0-G1 (68,34%), mientras que las células de fase S disminuyeron, lo que indica que la proliferación celular se inhibió la síntesis de ADN como ralentizado. Estos resultados del efecto de miR-129-5p sobre la proliferación celular y el ciclo celular, junto con su capacidad para aumentar la apoptosis estaban en línea con lo observado en las células del cáncer de vejiga [17]. Nuestro estudio también mostró que la expresión de miR-129-5p fue inducida por IFN-β en una dosis y manera dependiente del tiempo. Estos resultados implican que el efecto anti-proliferación y apoptosis de las pro-IFN en el cáncer cervical puede, en parte debido a la inducción de la expresión de miR-129-5p.
El cáncer cervical causado por la infección por VPH se asocia principalmente con el E6 y E7 oncogenes virales. Por análisis de qPCR, se encontró que la transfección de pre-miR-129-5p en células HeLa disminución la expresión de E6 y E7 por 69,01% y 77,15%, respectivamente. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe que un microARN inducida por IFN-β puede regular a la baja el VPH-18 E6 y E7 expresión de genes virales. Nuestra mayor investigación encontró que el factor de transcripción SP1 será un objetivo directo de miR-129-5p. SP1 es una proteína de unión a ADN específica de secuencia que contiene un sitio de unión de miR-129-5p en su extremo 3 'UTR. Las regiones reguladoras aguas arriba de HPV-18 genes contienen el sitio de unión SP1, y se ha demostrado para determinar E6 y E7 expresión de genes [20] - [22]. En el presente estudio, se encontró que la expresión de SP1 podría ser reducido regulado de manera significativa por sobre-expresado miR-129-5p. Por otra parte, se confirmó la existencia de un sitio de unión para el miR-129-5p al SP1 3'-UTR mediante el ensayo de actividad de luciferasa. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que la expresión de miR-inducida 129-5p por IFN-β suprime la progresión del cáncer de cuello uterino por E6 y E7 de HPV-18 expresión regular a la baja, y SP1 será un objetivo directo de miR-129- 5p. Un resultado interesante revelado por nuestra investigación es que la expresión de miR-129-5p fue alta en los tumores CIN I, pero disminuyó gradualmente durante el curso del desarrollo del cáncer y el aumento del grado patológico. la infección por VPH puede inducir alteración de la expresión de los genes miARN celular durante el desarrollo del cáncer de cuello uterino. Regulación a la baja de los recursos humanos de miR-218 y miR-34a en células de cáncer de cuello uterino se dirigieron a los VPH 16 E6 oncogén. Un estudio reciente mostró que el 25 miRNAs fueron regulados diferencialmente en dos o tres tipos de HPV (VPH 16/11/45) [23]. Es razonable que la expresión de miR-129-5p puede ser suprimida por la infección por VPH, ya que la tasa de infección de VPH de alto riesgo incrementa a través de NIC I con el cáncer de cuello uterino. Sin embargo, se necesitan más estudios para determinar el mecanismo exacto de la disminución de la expresión de miR-129-5p durante la progresión del cáncer de cuello uterino.
Apoyo a la Información
Figura S1. Francia El mapa de calor de los miRNAs expresados diferencialmente entre células HeLa inducidas no tratados e IFN-beta
doi:. 10.1371 /journal.pone.0081366.s001 gratis (TIF)
figura S2. Un
La expresión de VPH-18 E6 en células HeLa; S2B La expresión de HPV-18 E7 en las células HeLa
doi:. 10.1371 /journal.pone.0081366.s002 gratis (TIF): perfil
Reconocimientos
Un agradecimiento especial a Youji Feng Wang Feng y del hospital Afiliado de Shanghai primeras personas en la Universidad Shanghai Jiao Tong de proporcionar orientación tecnológica a lo largo del curso de este estudio.