Extracto
Antecedentes
El kaempferol se ha propuesto como un fármaco potencial para la quimioprevención y tratamiento del cáncer, ya que es un polifenol natural contenido en los alimentos de origen vegetal. Estudios recientes han demostrado que kaempferol protege contra la enfermedad cardiovascular y el cáncer. Sobre la base de este hallazgo, hemos investigado los mecanismos por los que el kaempferol produce el efecto anti-metastásico en células de carcinoma de células escamosas de la lengua humana SCC4.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio, hemos proporcionado molecular evidencia asociada con el efecto anti-metastática de kaempferol demostrando una supresión sustancial de la migración de células SCC4 y la invasión. Este efecto se asoció con expresiones reducidas de los niveles de proteína MMP-2 y TIMP 2-mRNA y. Análisis de la regulación transcripcional indicó que kaempferol inhibe MMP-2 de la transcripción mediante la supresión de la actividad de c-jun. Kaempferol también produjo un efecto inhibitorio sobre la fosforilación de ERK1 /2.
Conclusiones
Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares implicados en el efecto anti-metastásico del kaempferol, y son valiosos en la prevención de la metástasis del cáncer oral
Visto:. Lin CW, Chen PN, Chen MK, Yang WE, Tang CH, Yang SF, et al. (2013) El kaempferol Reduce MMP-2 expresión de la regulación negativa de ERK1 /2 y la proteína-1 del activador vías de señalización en las células de cáncer oral. PLoS ONE 8 (11): e80883. doi: 10.1371 /journal.pone.0080883
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 2 Octubre, 2013; Aceptado: October 18, 2013; Publicado: noviembre 20, 2013
Derechos de Autor © 2013 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado financieramente por las subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC-100 a 2632-B-040-001-MY3). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Oral carcinomas de células escamosas (COCE) son el sexto cáncer más común en todo el mundo y la cuarta causa de muerte por cáncer entre los hombres en Taiwán [1]. La cirugía y la radioterapia son una modalidad de tratamiento crítico en la etapa temprana de CCCA [2]. A pesar de los avances en la terapia, CCCA sigue caracterizándose por recurrencia y metástasis a los ganglios linfáticos regionales de cuello uterino, lo que produce un mal pronóstico de los pacientes. La tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con cáncer es inferior al 50%, pero las posibilidades de diagnóstico precoz y la prevención de esta enfermedad es probable que aumente si se ha identificado el mecanismo molecular [3]. Aunque la causa de la CCCA es multifactorial, la metástasis, que es resistente a las terapias convencionales, es probable que sea la principal causa de muerte [4].
La degradación de las membranas basales y los componentes de la matriz extracelular del estroma (ECM) constituye una proceso crucial durante la invasión del tejido local y la metástasis [5]. Mediante la secreción de enzimas proteolíticas, las células tumorales pueden crear un camino para migrar tanto local como remotamente. Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) pertenecen a una familia de endopeptidasas dependientes de cinc que degradan varios componentes de la ECM [6]. La estructura y el sustrato de la familia de las MMP permite que sea dividido en subgrupos de colagenasas, estromelisinas, gelatinasas, de tipo membrana de MMPs y otras MMPs [7]. Estos son cruciales para los procesos fisiológicos normales, como el desarrollo embrionario, la inflamación, la angiogénesis y la curación de heridas. Sin embargo, la investigación reciente ha demostrado que los altos niveles de MMPs a menudo se correlacionan con los cánceres humanos, tales como de pulmón [8], de mama [9], el hígado [10], y los cánceres orales [11]. Las actividades de las MMP se regulan por inhibidores fisiológicos, inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP) [12]. El desequilibrio de las MMPs y TIMPs activos es un elemento crucial que participa en la remodelación de la ECM exhibido en varios estados de la enfermedad [13]. Gohji et al. sugirió que el suero de MMP-2:. TIMP-2 es un indicador pronóstico independiente de recidiva del cáncer urotelial [14]
Los flavonoides son compuestos polifenólicos que se encuentran en las frutas y hortalizas [15]. Los flavonoides se utilizan comúnmente en la prevención de enfermedades cardiovasculares [16], [17]. Además, estudios previos han demostrado que los flavonoides en la dieta inhiben el desarrollo de diversos cánceres humanos, tales como cáncer de mama [18], cáncer de próstata [19] y el cáncer de colon [20]. Kaempferol, un polifenol natural, que pertenece al grupo de flavonoides, está presente en altos niveles en el té, uva, brócoli, bayas y [21], [22]. Varios estudios anteriores han indicado que el kaempferol exhibe antioxidantes [23], anti-inflamación [24] y propiedades antitumorales [25]. Hay por lo menos seis diferentes tipos de flavonoides. Kaempferol pertenece a la flavonol y tienen una estructura similar a quercein y miricetina, que también tienen efectos contra el cáncer [26]. Kaempferol fue descubierto para inhibir la angiogénesis y la expresión de VEGF en células de cáncer de ovario humano, y las rutas implicadas la regulación de HIF-1α [27]. Kaempferol también produjo un efecto apoptosis a través de la expresión de AKT en las células humanas de glioma [28] y las células de leucemia [29]. Estudios recientes han indicado que kaempferol induce G2 /M detención del ciclo celular y la muerte celular autofágica en células de cáncer hepático humano [30]. Por otra parte, Kang et al., Informó que kaempferol y quercetina indujo apoptosis caspasa-3-dependiente en células de cáncer de cavidad oral [31]. Sin embargo, el efecto de kaempferol en la metástasis del cáncer de CCCA, y los mecanismos subyacentes de este efecto, todavía no se ha estudiado. En este estudio, hemos demostrado que la supresión de la capacidad metastásica de kaempferol se produce por la baja regulación de la expresión de MMP-2, y esperamos proporcionar una base para futuras investigaciones.
Materiales y Métodos
celular y cultivo celular
SCC-4, una línea celular de carcinoma de células escamosas lengua humana obtenida a partir de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.) se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con un volumen igual de un nutriente mezcla, medio F-12 de Ham (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.), suero bovino fetal al 10% (Hyclone Laboratories, Logan, UT, EE.UU.), glutamina 2 mM, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 400 ng hidrocortisona /ml. Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
ensayo de viabilidad celular (ensayo MTT)
SCC4 células fueron sembradas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo y se trató con kaempferol a una concentración entre 0-100 micras, con 37 ° C durante 24 h. Después de que el período de exposición, se retiró el medio, y las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se incubó con 20 l de MTT (5 mg /ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.) para 4 marido. El número de células viables por placa es directamente proporcional a la producción de formazan, por deshidrogenasas en las mitocondrias dentro de las células vivas, que se pueden medir espectrofotométricamente a 563 nm siguientes solubilización con isopropanol.
migración celular y la invasión ensayos
Después de un tratamiento con kaempferol (0, 20, 40, 60, 80 y 100 mM) durante 24 h, se recogieron las células supervivientes y se sembraron a la cámara de Boyden (Neuro Probe, Cabin John, MD, EE.UU.) a 10
4 células /pocillo en medio libre de suero y se incubaron a continuación durante 24 h o 48 h a 37 ° C en el ensayo de ensayo de migración o invasión, respectivamente. Para el ensayo de invasión, 10 l de Matrigel (/50 ml 25 mg; BD Biosciences, MA, EE.UU.) se aplicó a 8 micras de poro de filtros de membrana de policarbonato de tamaño y la cámara inferior contenía medio estándar. Las células invadidas se fijaron con metanol al 100% y se tiñeron con 5% de Giemsa. Los números de células fueron contados bajo un microscopio de luz. El ensayo de migración se llevó a cabo como se describe en el ensayo de invasión sin la capa de Matrigel.
gel sustrato gelatina zimografía
Las actividades de MMP-2 en medio condicionado se midieron mediante ensayos de proteasa zimografía de gelatina . En pocas palabras, los medios de comunicación recogidos con un volumen apropiado (ajustados por el número de células vitales) se prepararon con tampón de muestra SDS sin hervir o reducción y se someten a un 0,1% de gelatina-8% electroforesis en SDS-PAGE. Después de la electroforesis, los geles se lavaron con 2,5% Triton X-100 y después se incubaron en tampón de reacción (40 mM Tris-HCl, pH 8,0; mM CaCl 10
2 y 0,01% NaN
3) durante 12 horas a 37 DO. Entonces gel se tiñó con azul brillante de Coomassie R-250. Las bandas correspondientes a MMP-2 la actividad se visualizaron por tinción negativa con 0,3% azul de Coomassie en 50% de metanol y 10% de ácido acético.
análisis de transferencia de Western
lisados celulares se prepararon mediante la suspensión de 2 x 10
6/10 cm plato en 200 l de RIPA que contiene inhibidores de la proteasa cóctel de amortiguamiento. Los lisados celulares se sometieron a una centrifugación de 10.000 rpm durante 10 min a 4 ° C, y el sedimento insoluble se desechó. La concentración de proteína de los lisados de células totales se determinó por el ensayo de Bradford. Los 20 g de muestras de lisados de células totales o fracciones nucleares fueron separados por SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el Sistema de Electroforesis Tetra Mini-Protean como se describe anteriormente [32]. La transferencia se incubó a continuación con 5% de leche no grasa en solución salina tamponada con Tris (Tris 20 mM, NaCl 137 mM, pH 7,6) durante 1 h para bloquear la unión no específica y después durante la noche con anticuerpos policlonales contra MMP-2, TIMP -2 o tres MAPKs (ERK 1/2, 1/2 JNK y p38) con los anticuerpos específicos para las formas no fosforiladas o fosforiladas de la ERK 1/2 correspondiente, JNK y p38 media. Las transferencias se incubaron después con una peroxidasa de rábano picante de cabra anti-conejo o anti-IgG de ratón durante 1 h. Después, la señal se detectó mediante el uso de un aumento de quimioluminiscencia (ECL) kit comercial (Amersham Biosciences) y la densidad fotográfica relativa se cuantificó mediante el escaneo de los negativos fotográficos en una documentación y el análisis de gel del sistema (Sistema HP AlphaImager, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, EE.UU.).
El aislamiento de ARN, semi-cuantitativos RT-PCR cuantitativa y TaqMan PCR en tiempo real
El ARN total se aisló de 1 × 10
6 SCC4 células utilizando Trizol (Life Technologies , Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total (2 mg) se transcribió de forma inversa en ADNc por superíndice III primer capítulo de síntesis Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA). La PCR se realizó en una mezcla de reacción que contiene 2 l de ADNc, mezcla de 0,2 mM dNTP, 2 mM de cada uno de los cebadores, 1 U Taq ADN polimerasa, y la concentración de 1-pliegue de Thermal Pol Buffer (New England Biolabs, MA, EE.UU.) mediante desnaturalización a 95 ° C durante 5 min, seguido de la amplificación de los ciclos indicados de 95 ° C durante 30 segundos, 62 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 30 seg. Las secuencias de los cebadores específicos para estos genes son los siguientes: MMP-2: 5'-GGCCCTGTCACTCCTGAGAT-3 '(hacia adelante), 5'-GGCATCCAGGTTATCGGGG A-3' (hacia atrás), y TIMP-2: 5'-GGCGTTTTGCAATGCAGATGTAG-3 ' (avance), 5'-CACAGGAGCCGTCACTTCTCTTG-3 '(hacia atrás). El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real se realizó utilizando Taqman de un paso PCR Master Mix (Applied Biosystems). Se añadieron 100 ng de cDNA total por 25 l de reacción con MMP-2 o GAPDH cebadores y sondas Taqman. Los cebadores y sondas de MMP-2 y GAPDH fueron diseñados utilizando el software comercial (sistema de detección de secuencias ABI PRISM; Applied Biosystems). ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real se llevaron a cabo por triplicado en un sistema de detección de secuencias StepOnePlus. El umbral se fija por encima del fondo de control no plantilla y dentro de la fase lineal de la amplificación de genes objetivo para calcular el ciclo en el cual se detectó la transcripción.
Luciferase reportero ensayo de gen
células SCC4 se sembraron a una concentración de 5 × 10
4 células por pocillo en placas de cultivo celular de 6 pocillos. Un fragmento del promotor de MMP-2 se insertó en el vector pGL3-basic para generar la MMP-2 promotor plásmido. Después de 24 h de incubación, pGL3-basic (vector) y MMP-2 promotor plásmido se co-transfectadas con un vector de expresión galactosidasa β- (pCH110) en las células usando Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). Después de 12 h de transfección, las células se trataron con vehículo o kaempferol (0, 20, 40, 60, 80 y 100 mM) durante 24 h. Las actividades de luciferasa y β-galactosidasa se ensayaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega). La luminiscencia se midió usando un luminómetro de microplacas Tropix TR717 (Applied Biosystems). El valor de la actividad de la luciferasa se normalizó a la eficacia de transfección y se controló por la expresión de β-galactosidasa.
electroforética ensayo de cambio de movilidad
ensayos de unión en extractos nucleares 1 AP-se realizaron con doble marcado con biotina -cables oligonucleótidos de c-jun (5'-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3 ') de ensayo y el desplazamiento de la movilidad electroforética se llevó a cabo utilizando el kit LightShift (Promega). Brevemente, las reacciones de unión que contienen 10 g de proteína nuclear, Tris 10 mM, KCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM, MgCl 5
2, 2 g de poli (dI · dC) y 2 pmoles de sonda de oligonucleótidos se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. complejos de DNA de proteínas se separaron por electroforesis en un gel de acrilamida no desnaturalizante al 6%, transferidos a membranas de nylon cargada positivamente y luego reticulado en un Stratagene reticulante. turnos de gel se visualizaron con una peroxidasa de rábano picante estreptavidina seguido de la detección quimioluminiscente. Se añadieron los oligonucleótidos no marcados de la AP-1 a 200 × específicamente para competir con la unión etiqueta oligo en el EMSA competitiva.
análisis de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
Se realizó un análisis de inmunoprecipitación de la cromatina como se ha descrito anteriormente [33]. En resumen, la cromatina y proteínas a partir de aproximadamente 2 × 10
6 células se reticularon con 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente. Se recogieron estas células, se lisaron y sometieron a ultrasonidos en hielo para cortar el ADN de la cromatina a una longitud entre 200 - 1000 pares de base mediante el uso de Sonicator 3000 (Misonix, Nueva York, EE.UU.). El lisado cromatina sonicado se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-c-Jun, y se recoge con perlas de agarosa Proteína A /G (Pierce, IL, EE.UU.). Las reticulaciones proteína /ADN de los complejos inmunoprecipitados se invirtieron por incubación en 0,2 M de NaCl a 65 ° C durante 4 h, y después el ADN se purificó y se aplican a PCR como se describió anteriormente para determinar la capacidad de unión de c-Jun a MMP 2 promotor. Las secuencias de los cebadores son 5'-CTCTTTAGCTCTTCAGGTCTCAGC-3 '(hacia adelante), y 5'-TGTTGGGAACGCCTGACT-3' (hacia atrás).
El análisis estadístico
Para todas las mediciones, análisis de la varianza seguido de Scheffe comparación posteriori se utilizó para evaluar las diferencias entre el control y las células tratadas con diversas concentraciones de kaempferol. Una diferencia en p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa y los experimentos se repitieron tres veces