Extracto
Antecedentes
Las células tumorales se caracterizan por un crecimiento acelerado acompañado generalmente por vías regulados hasta que finalmente aumentan la tasa de producción de ATP. Estas células pueden sufrir reprogramación metabólica, lo que resulta en fenotipos bioenergéticos distintas, en general la mejora de la glucólisis canalizado a la producción de lactato. En el presente trabajo hemos demostrado reprogramación metabólica mediante inhibidores de la histona deacetilasa (HDACIs), butirato de sodio y tricostatina. Este tratamiento fue capaz de cambiar el metabolismo de la energía mediante la activación de los sistemas mitocondriales tales como la fosforilación oxidativa y la cadena respiratoria que fueron reprimidos en gran medida en los controles no tratados.
Metodología /Principales conclusiones
Varios parámetros celulares y bioquímicos se evaluaron en el cáncer de pulmón de células H460 tratadas con los inhibidores de la histona deacetilasa (HDACIs), butirato de sodio (NaB) y tricostatina a (TSA). Nab y TSA reduce el flujo glucolítico, se ensayó mediante la liberación de lactato por H460 células de una manera dependiente de la concentración. NaB inhibió la expresión de transportador de glucosa tipo 1 (GLUT 1), pero aumentó sustancialmente mitocondrias hexoquinasa unido actividad (HK). NAB inducida por aumento de la actividad de HK se asoció a la isoforma HK I y fue acompañado por aumento de 1,5 veces en la expresión de ARNm HK I y la biosíntesis de proteínas afines. actividades de piruvato quinasa (PYK) La lactato deshidrogenasa (LDH) y se mantuvieron sin cambios por HDACIs lo que sugiere que el aumento en la actividad HK no se acopló a flujo glucolítico. Respirometría de alta resolución de las células H460 reveló NAB-dependientes mayores tasas de consumo de oxígeno acoplado a la síntesis de ATP. análisis metabolómico mostró que NaB alteró el perfil de metabolitos de las células H460 glicolítica intactas. Al mismo tiempo se detectó una activación de la ruta de la pentosa fosfato (PPP). El alto O
2 consumo en las células tratadas con NAB se demostró no estar relacionado con la biogénesis mitocondrial, ya citrato sintasa (CS) la actividad y la cantidad de ADN mitocondrial se mantuvo sin cambios.
Conclusión
Nab y TSA induce un aumento en la función mitocondrial y el metabolismo oxidativo en las células tumorales de pulmón H460 concomitante con un fenotipo celular proliferativo menos
Visto:. AMOEDO ND, Rodrigues MF, Pezzuto P, Galina a, RM da Costa, de Almeida FCL, et al. (2011) Metabolismo Energético en H460 células de cáncer de pulmón: Los efectos de los inhibidores de histona deacetilasa. PLoS ONE 6 (7): e22264. doi: 10.1371 /journal.pone.0022264
Editor: Alicia J. Kowaltowski, Instituto de Química - Universidad de Sao Paulo, Brasil |
Recibido: 1 de Febrero, 2011; Aceptado: 20 Junio 2011; Publicado: 18 Julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Amoedo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), la Fundación de Amparo a la Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), la Fundación hacer Cáncer, Instituto brasileño de Neurociencia - IBNnet FINEP, INCT - La excitotoxicidad y Neuroprotección#01.06 0,0842 y INCT - cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la proliferación sin control y la invasión típica de las células cancerosas son procesos que sólo puede sostenerse cuando hay suministro de energía suficiente, una característica que indica la aparición de células transformadas de fenotipos distintos que implican necesariamente elementos del metabolismo intermediario. En tumores sólidos, se ha demostrado por Otto Warburg que las células se han adaptado a confiar en la glucólisis anaeróbica como una estrategia para mantener su estado anabólico predominante [1]. Sin embargo, la regulación al alza de la glucólisis exhibida por las células de cáncer no implica necesariamente una estricta fenotipo anaeróbico ni un sistema de fosforilación oxidativa disfuncional (fosforilación oxidativa). Más bien, se cree que la interacción normal entre la glucólisis en el citosol y la fosforilación oxidativa en la mitocondria se perturba o reprogramado en las células tumorales. El efecto Crabtree observado en células de cáncer, o en células que proliferan rápidamente ejemplifica la íntima conexión entre la glucólisis y el metabolismo oxidativo [2].
Curiosamente, el fenotipo anaeróbica exhibida por las células de cáncer de hecho, puede representar la causa en lugar de la consecuencia de la presión de adaptación. Al tener en cuenta que el interruptor glicolítico típico de las células cancerosas se adquiere en el mismo inicio de la carcinogénesis, surgió la idea de que las alteraciones en la vía glucolítica pueden predisponer a las células a la transformación maligna [3], [4]. ventajas selectivas para las células transformadas podrían ser el resultado de diversas características. Por ejemplo, se sabe que la hipoxia-inducible factor-1 de (HIF-1α) estimula en gran medida la expresión de la glucosa y los monocarboxilato transportadores, enzimas glucolíticas e induce una regulación a la baja en piruvato deshidrogenasa complejo [5]. Por otra parte, las células tumorales presentan la isoforma de HK que se une a la proteína que forma el canal de aniones dependiente de voltaje del poro mitocondrial (VDAC). Al evitar la interacción de las proteínas pro-apoptóticas con las mitocondrias de la enzima unida actúa esencialmente como un agente anti-apoptótica. De hecho, se ha demostrado que la liberación de proteínas de apoptosis, tales como citocromo
c
depende de la integridad de la porción N-terminal de VDAC [6]. Desde que se demostró que HK y Bcl-2 fueron capaces de conferir protección contra la apoptosis mediante la interacción con la región N-terminal 1 VDAC, se fortaleció la participación de HK II como un promotor de la diferenciación celular.
Las enzimas de las vías glucolíticas y oxidativas son, como las proteínas en general, susceptibles de regulación de la expresión génica a nivel de la cromatina. estructuras de cromatina se alternan entre conformaciones compactadas y relajado que a su vez dependen de acetilación y desacetilación de la histona núcleo proteico. Los sistemas enzimáticos implicados en estos procesos son histonas (HAT acetil transferasa) que añaden grupos acetilo de los restos de lisina y desacetilasas de histonas (HDAC) que permiten eliminarlos. cromatinas compactados y relajado se han relacionado con gen de la represión y la activación de la expresión, respectivamente. Aunque histonas constituyen los sustratos principales para sombreros y HDCAs, otras proteínas no histonas tales como transcripcional factores-p53, la proteína retinoblastoma pRb y HIF-1α; chaperones (HSP90), enzimas metabólicas (piruvato quinasa; acetil-CoA sintasa) y los receptores de esteroides también son acetilados /desacetilado por estas enzimas. Por lo tanto, los sombreros y HDACs pueden afectar a un amplio espectro de procesos biológicos que incluyen la detención del crecimiento, la reparación del ADN, la bioenergética celular, vías de muerte celular (apoptosis, y la autofagia), la mitosis, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), la senescencia y la angiogénesis [7 ], [8]. Debido a sus acciones represivas, las HDAC se han convertido en objetivos interesantes para el desarrollo de fármacos que podrían recuperar la capacidad de las células transformadas para someterse a la apoptosis. Actualmente, se han caracterizado varios inhibidores de HDAC (HDACIs) obtenidos a partir de fuentes naturales o sintéticas. Se agrupan en clases de cinco químicas que incluyen ácido hidroxámico y compuestos derivados, benzamidas, péptidos cíclicos, ácidos grasos de cadena corta y cetonas.
Como se mencionó anteriormente, los HDACIs cambiar varias funciones en condiciones normales y células transformadas que lo hace difícil establecer claramente un mecanismo de acción de estos fármacos. Varios informes existen que muestra la acción de HDACi en el ciclo celular y la apoptosis. El presente trabajo ha diseccionado estas amplias acciones, centrándose en el metabolismo de la energía y la demostración de que HDACIs puede afectar a la proliferación actuando sobre las enzimas individuales de las vías glucolíticas y oxidativas. La información disponible mitocondrias hasta el momento que estudian de hígado de rata tratada con el ácido graso de cadena corta valproato derivado (VPA) han demostrado que inhibe de ácidos grasos β-oxidación y, en general deprime el metabolismo oxidativo celular que conduce a una disminución tanto, la tasa de O
2 consumo acoplado a la actividad de la síntesis de ATP y el citocromo oxidasa [9], [10], [11]. células adenocarcinomas colorrectales (HT29) tratados con butirato, otra cadena corta de ácidos grasos clase HDACi, la captación de glucosa y la oxidación inhibida, así como la síntesis de ribosa y el aumento de
síntesis de novo
ácido graso junto con la activación de la PPP. Sin embargo células MIA, adenocarcinoma pancreático butirato resistente, no mostraron ningún cambio en su perfil de lípidos después del tratamiento. Estos cambios metabólicos se correlacionaron a la inducción de procesos de diferenciación mediadas por butirato y en consecuencia con sus efectos inhibidores sobre el crecimiento. Se obtuvieron resultados similares con las células expuestas a TSA [12], [13]. En las células de mieloma, el HDACIs VPA y ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) indujo una disminución en la captación de glucosa, GLUT 1 expresión y actividad HK, lo que lleva a la apoptosis en las células tumorales. Además, estos inhibidores se incrementaron el catabolismo de aminoácidos [14].
El presente estudio examinó el papel de la AGN y la TSA en varios parámetros, bioquímicos y morfológicos, de la línea celular H460 de células de cáncer de pulmón con el fin de aclarar cómo estos HDACIs interfiere con la homeostasis de las células tumorales. Los datos demostraron de manera concluyente que el tratamiento con NAB durante 24 h conducen a un metabolismo oxidativo en general, lo que sugiere una mayor claridad que HDACIs puede trascender su función canónica en el nivel de la cromatina.
Métodos
Cell Culture
H460, una célula de cáncer de pulmón humano (ATCC, depositado por AF Gazdar, 1982), se mantuvo en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), pH 7,4 a 37 ° C en una cámara de incubación humidificada con 5% de CO
2. Las células fueron sub-cultivadas cada 2 días y se utiliza en los experimentos cuando alcanzaron 85% de confluencia. Las células H460 se genotipo en nuestro laboratorio utilizando 8 loci más amelogenina. Todos los loci se correspondía con el perfil ATCC ADN STR.
viabilidad celular y Citotoxicidad de ensayo
Para los ensayos se cultivan las células en 24 y placas de 96 pocillos. 24 h después de la siembra, las células se incubaron con tres concentraciones diferentes de NaB (1, 3 y 10 mM) y TSA (0,02, 0,2 y 1 M) para un máximo de 48 h. Después de cada tratamiento, se accedió a la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT, tal como se describe anteriormente [15], y el ensayo de exclusión tripano colorante azul. Citotoxicidad se ensayó mediante la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) después del tratamiento NAB utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad CytoTox96 no radiactivos (Promega).
Análisis de Ciclo Celular
Para las células H460 de tinción de ADN fueron cultivadas en 6 pocillos placas y se trató con 3 o 10 NaB mM y 0,2 mM TSA durante 24 h. Las células se sedimentaron (1000
xg
durante 5 min. a 4 ° C) y ressuspended en 500 l de solución de tinción PI, compuesta de 50 ug /ml de yoduro de propidio (PI), 1 mg /ml de RNAsa y 0,2% de Triton X-100. Las muestras se incubaron en hielo durante 15 min. en el software oscuro y después se analizaron en citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson) utilizando CellQuest (Becton Dickinson), respectivamente, para la adquisición de datos y análisis de la distribución del ciclo celular.
Cinética de la liberación de lactato en la cultura medios
Después del tratamiento con diferentes concentraciones de NaB y TSA durante 24 h, el medio de cultivo fue reemplazado por fresco 1,640 medio RPMI sin rojo fenol y FBS. A los tiempos indicados (0, 15, 30, 40, 50 y 60 min.), Alícuotas del medio de cultivo se recogieron para evaluar la liberación de lactato a través de este ensayo enzimático: la medición de lactato se realizó en un tampón de hidrazina /glicina (pH 9,2), que contiene 5 mg /ml β-NAD
+ y 15 unidades /ml de lactato deshidrogenasa. La absorbancia debido a la formación de NADH se monitorizó en un lector de microplacas (SpectraMax M5, Molecular Devices) a 340 nm y se correlacionó con la presencia de lactato en muestras de una curva estándar [16].
Preparación de mitocondrial y fracciones de proteína citosólica
sedimento de células H460 se mezcló para un tampón de lisis que contiene mM Tris-HCl 10 pH 7,4, 0,25 M de sacarosa, NaF 20 mM, DTT 1 mM, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM e inhibidores de proteasa cóctel (quimostatina, leupeptina, antipaína, pepstatina A - Sigma-Aldrich). La suspensión celular se transfirió a homogeneizadores (Wheaton Potter-Elvehjem) para la lisis celular. La suspensión se centrifugó a 100
x g
por 5 min. a 4 ° C, el sedimento con los desechos se desechó y el sobrenadante resultante se centrifugó a 10.000
x g
para 15 min. a 4 ° C. A continuación, se utilizó el sobrenadante (fracción citosólica) para la medición de las actividades recuperadas de HK, PYK, LDH y deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato (G6PDH) y el sedimento (fracción mitocondrial) se utilizó para la medición de las actividades recuperadas de mt-HK y CS. Estos extractos se utilizaron para la transferencia de Western y ensayos de actividad enzimática. La concentración de proteína se realizó mediante el método de Bradford
Ensayos de actividad enzimática
Las actividades enzimáticas se midieron utilizando los siguientes medios de reacción:. (a) para HK, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl
2, β-NAD 1 mM
+, 1 unidad /ml de G6PDH (
Leuconostoc mesenteroides
), 0,1%-100 X, Triton ATP 2 mM y 5 mM de glucosa. (B) Para PYK, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, mM MgCl 5
2, KCl 50 mM, β-NADH, ADP 2,5 mM, 0,2 mM de 0,1% de Triton X-100, fosfoenolpiruvato 5 mM, 0,5 unidades /ml de lactato deshidrogenasa. (C) Para LDH, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, EDTA 1 mM, β-NADH, Triton X-100, piruvato mM 0,1% 1 0,2 mM. (D) Para G6PDH, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, mM MgCl 5
2, 0,1% de Triton X-100, 2 mM de glucosa-6-fosfato y 0,2 mM β-NADH. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 20 a 140 g de proteína para HK y 10 g de proteína para PYK, LDH y G6PDH y se realizaron a 37 ° C durante 5 min. Después de la incubación, las muestras se hirvieron inmediatamente y se colocan en hielo. Se midió la absorbancia a 340 nm y el valor se utiliza para calcular la actividad específica de las enzimas se define como la cantidad de sustrato formado por miligramo de proteína por minuto. (E) Para CS, 50 mM Tris-HCl pH 8,1, 0,3 mM de acetil-CoA, 100-X, DTNB 0,1 mM, oxalacetato 0,1% Triton 0,5 mM. La reacción se inició por la adición de 10 g de proteína y lleva a cabo a 30 ° C durante 5 min. Se midió la absorbancia a 412 nm. (F) Para la succinato deshidrogenasa (SDH), tampón de fosfato 50 mM (pH 7,4), 0,1% de Triton X-100, KCN 0,8 mM, 0,06 mM de 2,6-diclorofenolindofenol (DCIPIP), fenazina 1,1 mM (PMS) y 100 g proteína La reacción se lleva a cabo a 25 ° C durante 7 min y se detuvo con malonato de 10 mM. La reducción de DCPIP se monitorizó a 600 nm.
Western Blotting
25 g de extractos de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE estándar y se transfirieron a nitrocelulosa mediante electrotransferencia membranas en tampón compuesto de glicina 39 mM , 48 Tris-base mM, 0,037% de SDS y 20% de metanol. La transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos primarios diluidos en TBS, 0,1% Tween 20 y 5% de BSA. Se utilizaron anticuerpos primarios contra HK I, HKII y VDAC 2 (Abcam).
Consumo de Oxígeno de las células intactas y digitonina permeabilized H460
O
2 tasas de consumo se midieron utilizando polarográfica alta respirometría -Resolución (Oroboros Oxygraph-O2K). Después del período de tratamiento, se eliminó el medio y las células fueron ya sea suspendido en RPMI (mM de glucosa y 2 glutamina 11,1 mM) o DMEM libre de glucosa para la medición de O
2 consumo de células intactas, o en el medio de la respiración pH 7,0 (0,25 M manitol, mM MgCl 10
2, KH 10 mM
2 PO
4, HEPES 10 mM, EDTA 0,08 mM, ácido graso de EGTA 1 mM y 0,1% libre de BSA) para la evaluación de los complejos respiratorios de células permeabilizadas . consumo habitual, oligomicina independiente de la respiración (fuga de protones) y la respiración estimulada por FCCP (máximo respiración) se midieron en células intactas H460 como se describe anteriormente [17]. NAB efectos sobre complejos respiratorios de células digitonina permeabilized H460 0,003% se llevaron a cabo después de la adición de diferentes sustratos /moduladores de piruvato tal como 10 mM + malato 10 mM (complejo sustratos I ligado a), succinato 10 mM (sustrato complejo II ligado a) , 0,5 rotenona mu M, 100 M ADP. Cuando el ensayo de estado 3 inducida por 2-desoxiglucosa (2-DOG), se añadieron 10 mM de 2-DOG. DatLab de software (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) se utilizó para la adquisición y análisis de datos.
Extracción de ARN y síntesis de ADNc de
El ARN total fue aislado de las células H460 usando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total se cuantificó espectrofotométricamente y 1 g se trataron con 1 U de RNasa libre de DNasa durante 30 min. a 37 ° C. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 1 l de EDTA 20 mM y calentamiento durante 10 min. a 65 ° C. la síntesis de ADNc se realizó utilizando el ARN tratado con ADNasa acuerdo con alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit de Applied Biosystems.
PCR en tiempo real
La expresión de genes se realizó mediante PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems) y SYBR Green Power-PCR master Mix (Applied Biosystems). Para esta prueba pares de cebadores fueron sintetizados sobre la base de secuencias de GenBank de mRNA. Las secuencias de los cebadores se presentan en la Tabla S1. El método comparativo Ct se utilizó para comparar los cambios en los niveles de expresión de genes [18]. Actina se utilizó como control endógeno.
Electron Microscopy
Las células se lavaron una vez en PBS caliente y se fijaron en una solución de pH 7,2 que contiene 2,5% de glutaraldehído, tampón cacodilato 0,1 M de sodio, post- fijado con 1% OSO
4 (tetróxido de osmio) en tampón cacodilato 0,1 M de sodio. Después, las células se lavaron con PBS, se deshidrataron con acetona y se incluyeron en Epon. Las secciones ultra delgadas (70 nm) fueron teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se observaron en un microscopio electrónico Zeiss 900. Para la morfometría mitocondrias, se tomaron veinte micrografías electrónicas de cada muestra y se analizaron para la morfología. Las mediciones de cada mitocondria perfiles de área en secciones ultrafinas se realizaron utilizando el software Image J (NIH).
resonancias magnética nuclear (RMN) para el análisis de Metabolómica
Se llevó a cabo la detección de Metabolómica de las células H460 como se describe en [19] con algunas modificaciones. En resumen, medios de cultivo de células no tratadas y tratadas con NaB H460 se sustituye por DMEM libre de glucosa suplementado con glucosa y células mM D- [U
13C] 5 se incubaron durante 1 h. Después de la incubación, se retiró el medio y aproximadamente 3 × 10
7 células se suspendieron en DMEM libre de glucosa que contiene óxido de deuterio 10%. Unidimensional
espectros 13C de células intactas metabolitos H460 se obtuvieron a 25 ° C. Los espectros de células H460 metabolitos fueron adquiridos con un Brucker DRX 400 MHz usando una sonda de triple resonancia (TXI). procesamiento y análisis de los espectros se realizaron con Topspin 2.0 y asignación metabolito hecho por la comparación del desplazamiento químico de los metabolitos conocidos depositados en la base de datos v Metaboloma humano 1.0.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el gráfico pad Prism 5. Los resultados se expresaron como medias ± SEM para
n
experimentos independientes. La significación estadística se determinó por el estudiante de
t
prueba,
unidireccional
ANOVA y
de dos vías ANOVA
.
Resultados
butirato de sodio y tricostatina a inhibió la proliferación de las células H460 y se indujo cambios morfológicos compatibles con un proceso de diferenciación
Inicialmente, se realizaron ensayos para evaluar NAP y los TSA efectos sobre la viabilidad celular para determinar las mejores condiciones experimentales para estudiar los efectos HDACIs sobre el metabolismo de la energía sin interferencias causadas por la citotoxicidad. Como se observa por microscopía de contraste de fase, las células H460 tratadas con NaB exhibieron diferencias discretas en comparación con las células control. La morfología observada fue compatible con la de las células diferenciadas, lo que sugiere que puede haber NaB contrarrestado vías de regulación que en el tumor de las células conducirían a la desdiferenciación. Los resultados de la Figura 1, muestran que el tratamiento con NaB 10 mM producen células que eran menos confluentes y son ligeramente más alargada que las no tratadas (Figura 1C y D). Curiosamente, la morfología de las células tratadas H460 NaB se parecía a las células A549, una célula de cáncer de pulmón más diferenciada que no muestra cambios morfológicos por tratamiento NaB (Figura 1A y B). Estas alteraciones en la forma de la célula eran posiblemente relacionadas con la reorganización del citoesqueleto, ya que el tratamiento de células con NaB produce una redistribución marcada de F-actina como se revela por tinción con rodamina marcado phaloidin (Figura S1; Método S2). Sobre la base de esta observación se planteó la cuestión de si 10 mM NAB podría haber tenido efectos citotóxicos sobre las culturas. Los experimentos que implican el recuento de células sencillo llevado a cabo a las 24 y 48 h, mostraron un efecto dependiente de la dosis sobre la proliferación (Figura S2A). A las 24 h, el tratamiento con NaB 10 mM indujo una reducción de 50% en las células no expuestas al HDACi. A las 48 h de incubación el número de células vivas en NAB 10 mM era aproximadamente el 10%. células H460 incubadas con NaB a concentraciones de 1, 3 y 10 mM y después se investigó la viabilidad usando el ensayo de MTT. Los resultados (Figura S2B) mostraron un efecto moderado a las 24 h produciendo casi el 80% de viabilidad en NAB 10 mM y aproximadamente el 30% de viabilidad después de 48 h de incubación con la misma concentración. En esencia, se obtuvieron los mismos resultados cuando estos experimentos se repitieron con TSA, usando concentraciones que abarcan desde 0,02 hasta 1 M, a excepción de que en la concentración más alta, TSA parecía ser más tóxico que el NaB (Figura S2D-E). Estos resultados mostraron que NaB y TSA, aunque pertenecen a diferentes clases químicas, comparten efectos similares. Aunque el número de células fue claramente reducida como resultado de la acción NaB y TSA, los principales efectos de los dos inhibidores podrían ser mejor interpretados como inhibición de la proliferación, en lugar de un efecto tóxico directo. Con el fin de probar si las células tratadas fueron dañadas por los HDACIs, la liberación de lactato deshidrogenasa se ensayó después del tratamiento durante 24 y 48 h con NaB y TSA (Figura S2F) a varias concentraciones. liberación de lactato deshidrogenasa no se vio afectada significativamente por la NAB a las 24 h (Figura S2C). A las 48 h, y sólo a una concentración de 10 mM ¿El tratamiento NaB liberación de lactato deshidrogenasa inducida significativamente. Por otra parte, la inspección de las células tratadas por microscopía de fluorescencia después de la tinción con DAPI (Figura S1) reveló núcleos intactos y la cromatina, un resultado que argumentan contra el daño celular. Debido a la amplia gama de actividades de NAB, se llevaron a cabo experimentos para comprobar si el tratamiento de células H460 con este inhibidor podría influir en la distribución de células a lo largo de las principales etapas del ciclo celular. Estos experimentos se llevaron a cabo mediante la cuantificación de las células tratadas y no tratadas por medio de la clasificación de células activadas por fluorescencia. Los resultados de la Figura S3A muestran que tras un tratamiento de 24 h, la mayoría de las células, aproximadamente el 80%, se encontraron en la fase G0 /G1 del ciclo celular con una reducción concomitante de la fase S. La incubación de células con 0,2 mM TSA durante 24 h produjo un perfil similar (Figura S3B). Teniendo en cuenta estos resultados, el tratamiento de NaB 10 mM durante 24 h inducidas diferenciación y la inhibición del crecimiento celular, pero no era tóxico para las células H460. Por lo tanto, los experimentos que implican la incubación a largo plazo de las células con las HDACIs no se extendieron más allá de las 24 h
.
Las células fueron incubadas a 37 ° C incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2 y se fotografiaron bajo campo claro mediante el sistema de documentación de microscopio invertido Nikon TS100. células (A) A549 no tratadas. células (B) A549 tratados con NaB 10 mM durante 24 h. (C) células H460. (D) H460 células tratadas con NAB 10 mM durante 24 h.
El butirato sódico disminuye la liberación de lactato de las células H460, reduce la expresión de GLUT 1 y el aumento de GLUT 3 de expresión
En lo que respecta el metabolismo de la energía, una de las principales características de las células altamente proliferativas, incluyendo las células tumorales, es su cambio a la glucólisis anaeróbica [3], [20], [21]. La presión selectiva, en su caso, la producción de un fenotipo alterado tal debe ser el resultado de los mecanismos de regulación que de alguna manera son capaces de detectar el estado de energía de las células. Por lo tanto, como un primer paso hacia el descubrimiento de las vías metabólicas afectadas por la NAB y TSA, nos preguntamos si estos HDACIs podrían afectar directamente el flujo glucolítico de células H460. Esta serie de experimentos se inició mediante la medición de la cantidad de lactato en un medio de cultivo después de la incubación de células con 3 y NaB 10 mM durante 24 h. La cantidad de lactato liberado luego se controló a intervalos regulares durante un período de 60 min. Los resultados se muestran en la Figura 2A. Los valores observados en la liberación de lactato fueron similares a las observadas por Pereira da Silva [19]. Se puede observar que NaB reducción de la liberación de lactato en una forma dependiente de la dosis. Se obtuvo un patrón similar de inhibición de la liberación de lactato después de la incubación de las células con 0,2 mM TSA durante 24 h (Figura S4A). Después de 60 min. de incubación, las células tratadas con TSA liberan aproximadamente el 60% de la cantidad de lactato liberado por los controles. fluctuaciones de lactato podrían ocurrir como consecuencia de las perturbaciones en cualquier etapa de la vía glicolítica. Teniendo en cuenta que en el presente trabajo los experimentos se realizaron con células en cultivo, el reciclaje de lactato a través de la gluconeogénesis se descartó. Una posible destino para el lactato podría ser el metabolismo oxidativo de las células, asumiendo por supuesto que las mitocondrias de las células tumorales eran funcionales. Por lo tanto, la liberación de lactato se ensayó después de la incubación de las células H460 con NaB durante 24 h seguido de la adición de antimicina A. Los resultados se expresaron como la relación entre la liberación de lactato en presencia y ausencia de antimicina A, se muestra en la Figura 2B. Después de 60 min. con NAB y antimicina A, la liberación de lactato se estabilizó a cabo exhibiendo un aumento del doble en los células no tratadas. 0,2 mM TSA produjo una respuesta similar a la antimicina A después de 60 min. de incubación (Figura S4B). Además de mostrar que el metabolismo oxidativo es operativo en células H460, y se supone que el aumento en las células tratadas HDACi, estos resultados también apoyan la interpretación de que NaB y TSA afectó de hecho el flujo glucolítico. Sin embargo, la captación de glucosa por las células tumorales podría constituir por sí misma el marcapasos para toda la ruta glicolítica. Por lo tanto, los experimentos fueron diseñados para probar si NaB tuvo ningún efecto sobre la expresión de GLUT 1 y GLUT 3 usando QRT-PCR. Los resultados en la Figura 2C muestra que NaB incubó a 3 y 10 mM durante 24 h reduce la expresión de GLUT 1 (1,6 y 4, respectivamente) y el aumento de GLUT 3 expresión (2.9x) en células H460.
Después 24 h de tratamiento con 3 mM o NaB 10 mM, H460 células se incubaron con medio de glucosa suplementada. Alícuotas de los sobrenadantes se recogieron cada 10 minutos y se incubaron en tampón hidrazine pH 9,2, con un exceso de NAD
+ y lactato deshidrogenasa (LDH) para la medición de lactato en libertad. (A) Cinética de liberación de lactato y la representación de la liberación de lactato después de 60 minutos (en el recuadro). (B) Después de 30 minutos de incubación con glucosa, se añadió 2 mg /ml de antimicina A a la cultura. Las alícuotas del sobrenadante se tomaron a intervalos de 10 minutos y lactato liberado se midió. La relación de la producción de lactato de células H460 en presencia y ausencia de antimicina A evidencia la estimulación de la producción de lactato cuando la fosforilación oxidativa se inhibió por la adición de este fármaco (indicada por la flecha negro). Los valores representan la media ± SEM; N = 4, * P & lt; 0,05. (C) Las células fueron tratadas con 3 mM o NAB 10 mM durante 24 h y GLUT 1 y (D) GLUT 3 de expresión se determinó mediante PCR en tiempo real. La actina se utilizó para normalizar las cantidades de ADNc. Los valores representan la media ± SEM; N = 3, * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
butirato sódico aumento de las mitocondrias actividad hexoquinasa obligado
La reducción observada en GLUT 1 y el aumento de la expresión de GLUT 3 (figura 2C) sugirió que un mecanismo de compensación para la captación de glucosa era operativa en las células. Por lo tanto, nos preguntamos si la actividad de HK, un elemento importante en la cinética de la captación de glucosa y el flujo glucolítico, podría desempeñar un papel. Para investigar esto, se realizó la actividad HK y la expresión de las isoformas de HK se evaluó mediante qRT-PCR. La Figura 3A muestra que, como resultado de la incubación de células H460 con NaB 10 mM durante 24 h, la actividad de las mitocondrias unido HK aumentó dos veces más que la de los controles no tratados. Por el contrario, NaB no afectó a la actividad de citosólica HK. La localización intracelular de HK I también fue confirmada por inmunofluorescencia. Los resultados se muestran en la (Figura S5; Método S2). En estos experimentos, la detección de mitofusina (NMF) I y II, las proteínas que están ancladas a la mitocondria y participan en el mantenimiento de su morfología y de la fusión, se realizó en la misma preparación a fin de proporcionar marcadores de los orgánulos. Comparación de las placas de NMF (y manchado en rojo) a HK (teñido en verde), mostró que ambas proteínas co-localizados en la mitocondria. La actividad enzimática más alta se observa en la Figura 3A podría haber reflejado un incremento en la expresión de HK inducida después de una incubación a largo plazo de las células con NAB. Esta posibilidad se investigó mediante el ensayo de expresión HK I y II HK usando QRT-PCR en células H460 expuestos a 3 y 10 NaB mM durante 24 h. Los resultados se muestran en la Figura 3B. Ambas concentraciones de NaB aumentaron significativamente la expresión de HK I. Por el contrario, NaB indujo una disminución en la expresión de HK II. En los experimentos de medición de expresión HK II (Figura 3B), los valores obtenidos después de la incubación de las células con 3 y 10 mM NaB no fueron significativamente diferentes. La confirmación de que NaB indujo un aumento de la expresión de HK I se obtuvo de los experimentos que determinan la cantidad real de HK traducido por medio de transferencias de Western. Los resultados se muestran en la Figura 3C. Se puede observar que el tratamiento de células H460 con NaB 10 mM durante 24 h aumentó claramente la intensidad y el área de la banda correspondiente a HK I asociado a la mitocondria. Sin embargo, no se observó ninguna alteración en la cantidad de HKII. Por el contrario, citosólica HK I y II eran apenas detectable en los controles y células tratadas. La mayor cantidad de HK se muestra en la Figura 3C no puede ser explicado por un aumento de la disponibilidad del aceptor hexoquinasa mitocondrial, la VDAC, ya que las cantidades de esta proteína no cambió significativamente después del tratamiento con NaB. Mientras que el efecto de NaB sobre la expresión de las isoformas de HK se demostró claramente, el inhibidor no afectó a la actividad de cualquiera de PYK o LDH. Los resultados se muestran en la Tabla 1. El hecho de que 10 mM NaB no afectó a estas enzimas glucolíticas refuerza la idea de que la HDACi es parcialmente selectivos en su efecto de modular la actividad de las isoformas de HK.