Extracto
Antecedentes
Los derivados hidroxilados de colesterol, tales como los Oxisteroles, desempeñar papeles importantes en el metabolismo lipídico. En particular, 25-hidroxicolesterol (25HC) ha sido implicado en una variedad de eventos metabólicos incluyendo la homeostasis del colesterol y la aterosclerosis. 25HC es detectable en el plasma humano después de la ingestión de una comida rica en oxiesteroles y tras una entrada de colesterol de la dieta. Además, se han encontrado los niveles de Oxisteroles, incluyendo 25HC a ser elevados en suero hipercolesterolémicos.
Metodología /Principales conclusiones
A continuación, se demuestra que el receptor de estrógeno (ER) media alfa cambios de expresión génica y las respuestas de crecimiento inducidos por 25HC en células de mama y cáncer de ovario. Por otra parte, 25HC exhibe la capacidad ER-dependiente como 17β-estradiol (E2) para inhibir la sobre regulación de HIF-1α y el factor de crecimiento de tejido conjuntivo por condiciones de hipoxia en cardiomiocitos y preparaciones de corazón de rata y para prevenir la apoptosis inducida por hipoxia.
Conclusiones /Importancia
la acción de los estrógenos ejercida por 25HC se puede considerar como un factor adicional implicado en la progresión de tumores de mama y de ovario. Por otra parte, la actividad similar al estrógeno de 25HC suscitó en el sistema cardiovascular puede desempeñar un papel en contra ambientes de hipoxia
Visto:. Lappano R, Recchia AG, De Francesco EM, Angelone T, Cerra MC, Picard D, et Alabama. (2011) El metabolito del colesterol 25-hidroxicolesterol Activa los receptores de estrógeno α mediada por la señalización en las células del cáncer y en los cardiomiocitos. PLoS ONE 6 (1): e16631. doi: 10.1371 /journal.pone.0016631
Editor: Vincent Laudet, Escuela Normal Superior de Lyon, Francia |
Recibido: 7 Septiembre, 2010; Aceptado 27 de diciembre de 2010; Publicado: 31 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Lappano et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, proyecto nº 8925/2009.) (http://www.airc.it/) y el Ministero dell'Università e Ricerca Scientifica e Tecnologica (MUR) (http: //www.istruzione.it/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el receptor de estrógeno (ER) α y β pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares de factores de transcripción de ligando-inducible [1]. La unión de 17β-estradiol (E2) a ERs induce la homodimerización del receptor y la interacción con elementos de respuesta de estrógeno específico (Eres) situadas dentro de las regiones reguladoras de genes diana [2]. Dos dominios de activación separados median en la actividad transcripcional ER-dependiente: la función de activación (AF) -1 situada en el amino-terminal y el dependiente de hormonas AF-2 se encuentra en el dominio de unión a ligando (LBD) [3]. La unión de ligandos a ER induce la formación de un bolsillo hidrofóbico AF-2 que regula el reclutamiento de cofactores y de manera importante la farmacología del receptor de [4] - [5]
Los resultados previos obtenidos tanto en cultivo de células y modelos animales. han indicado que ER desempeña un papel crucial en la mediación de los efectos del estrógeno en desarrollo de la glándula mamaria y cáncer de mama progresión [6] - [7]. Además, el estrógeno se ha demostrado para prevenir la disfunción vascular y la lesión de una manera ER-dependiente [8] - [10], para reducir la hipertrofia de cardiomiocitos [11] y para disminuir el tamaño del infarto y la apoptosis de los miocitos en modelos animales con oclusión coronaria [12] . Diversos mecanismos están implicados en la acción protectora ejercida por E2 en los cardiomiocitos. El estrés oxidativo y la posterior generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) se cree que desencadenar la apoptosis de los cardiomiocitos [13], mientras que la capacidad de ER activado-E2 para contrarrestar estos intermedios redox es muy probablemente un factor clave de la cardioprotección general. La respuesta de las células con el medio ambiente de oxígeno reducido implica al inducible por hipoxia del factor-1 (HIF-1), que regula la expresión de genes como la proteína matricellular llamado factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) que pertenece a la familia de CCN de reguladores de crecimiento (
Cyr61
, CTGF y
noviembre
) [14]. Los niveles de CTGF están regulados durante la reparación de heridas [15], inflamación [16], trastornos fibróticos [17], el crecimiento del tumor [18] - [19] y la angiogénesis [18], [20]. La acumulación de pruebas también se ha sugerido que CTGF ejerce un papel crucial en los procesos fibróticos cardíacas, lo que indica que como un posible biomarcador y un candidato potencial para la intervención terapéutica [21]
.
Oxisteroles son derivados del colesterol que desempeñan funciones importantes en hidroxilados metabolismo de los lípidos [22]. 25-hidroxicolesterol (25HC) que se sintetiza a partir del colesterol por un hidroxilasa específico [23], actúa como un potente inhibidor de la biosíntesis de colesterol en diferentes tipos de células [24]. 25HC se detectó en plasma de rata después de la ingestión de una comida rica en oxiesteroles y tras una entrada de colesterol de la dieta [25]. Del mismo modo, los niveles de oxiesteroles, incluyendo 25HC, fueron más altos en el suero hipercolesterolémicos en comparación con las que se encuentran en el suero normocolesterólemico [26]. A continuación, los ratones deficientes en la enzima oxysterol-catabolizing oxysterol 7α-hidroxilasa (Cyp7b) mostraron concentraciones elevadas de ambos 25HC y 27HC, lo que sugiere un papel regulador provocada por Cyp7b en estos derivados de colesterol hidroxilados [27].
En el presente estudio, hemos demostrado que 25HC provoca efectos estrogénicos de activación ER-señalización mediada ya sea en células de mama y cáncer de ovario o en cardiomiocitos. Los resultados obtenidos fueron confirmados, al menos en parte, en los corazones de rata aislados y perfundidos.
Materiales y Métodos
Reactivos
17β-estradiol (E2), 25-hidroxicolesterol (25HC), cloruro de cobalto (CoCl
2), PD98059 (PD), SB202190 (SB) y actinomicina D se adquirieron de Sigma-Aldrich, Inc., Milán, Italia. Los experimentos realizados usando 25HC de Sigma-Aldrich, Inc., Milán (Italia) se confirmaron con 25HC comprado de Research Plus, Inc., Barnegat, NJ. ICI 182.780 (ICI) se obtuvo de Tocris químicos. Todos los compuestos se solubilizan en sulfóxido de dimetilo (DMSO), excepto E2 y PD, que se disolvieron en etanol.
Cell Cultura
El cáncer de mama MCF7 y células HEK293 de riñón embrionario humano se mantuvieron en DMEM con rojo fenol suplementado con 10% FBS. SKBR3 de mama y células de cáncer de ovario BG-1 se mantuvieron en RPMI1640 y DMEM, respectivamente, sin rojo fenol suplementado con 10% FBS. La línea celular de cardiomiocitos-como murino NS-1 fue proporcionado amablemente por el Dr. William C. Claycomb (Centro Médico de la Universidad del Estado de Louisiana, Nueva Orleans, LA). HL-1 en las células se cultivaron de acuerdo con el protocolo publicado [28] en un medio Claycomb (JRH Biosciences, Sigma-Aldrich, Inc., Milán, Italia) suplementado con 10% FBS (JRH Bioscience, Sigma-Aldrich, Inc., Milán, Italia), 100μg /ml de penicilina /estreptomicina, 0,1 mM noradrenalina (Sigma-Aldrich, Inc., Milán, Italia) y 2 mM de
l
-glutamine (Invitrogen, Milán, Italia). Todas las líneas celulares se cultivaron en una incubadora a 37 ° con 5% de CO
2. Para las células de estimulación hipóxica HL-1 se trataron con CoCl
2 o cultivadas en presencia de la tensión de oxígeno baja (2% de O
2) en una incubadora HERAcell (ThermoScientific-Heraeus, Milán, Italia). Todas las líneas celulares para ser procesados por inmunotransferencia y ensayos de RT-PCR se cambiaron a medio sin suero y rojo fenol 24 h antes de los tratamientos.
transfecciones, ensayos de luciferasa y experimentos de silenciamiento génico
Los plásmidos y luciferasa Los ensayos se describe anteriormente [29] - [32]. En particular, se utilizan vectores de expresión que codifican la longitud total ER y la forma ERβ codifica la proteína de 485 aa [29] - [32]. Las células se sembraron en placas de 10 cm, mantenidas en medio libre de suero durante 24 h y luego se transfectaron durante 24 h adicionales antes de los tratamientos utilizando Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals, Milán, Italia) y vectores de control apropiados. Los plásmidos SureSilencing ™ shRNA para ratón HIF-1α y los respectivos plásmidos de control negativo (shRNA) fueron adquiridos de Superarray Bioscience Corporation (Frederick, MD, EE.UU.) y se utilizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Cat. KM03799P). Brevemente, las células se sembraron en placas de 10 cm, y luego transfectadas en medio libre de suero durante 24 h antes de los tratamientos con una mezcla que contiene 15μl /placa Fugene6 Reactivo y 5μg /control de placa de shRNA o shRNA HIF-1α (shHIF-1α) plásmido. Para el silenciamiento de HIF-1α, el fabricante ofrece 4 ARN corto horquilla (shRNA) secuencias pre-diseñadas separadas para el mismo gen, envasados en 4 columnas vertebrales de plásmidos separados (numerados como 1-4). En nuestros experimentos, una única secuencia de plásmido shRNA independiente (n.3) era suficiente para silenciar la expresión de genes HIF-1α. El control shRNA es una secuencia artificial revueltos que no coincide con ningún gen humano, ratón o rata.
ER ensayos de unión
La capacidad de 25HC para competir con [3H] E2 para la unión a ER se evaluó ya sea en células MCF7 o el uso de lisados de células Hek293 en presencia o ausencia de dos picomoles de proteína ER humano recombinante purificado comprado de PanVera, Invitrogen Srl Milán, Italia. células MCF7 fueron despojados de cualquier estrógeno manteniéndolos en medio sin suero durante 2 días, a partir de entonces las células se incubaron con 1 nM [2,4,6,7-3H] E2 (89 Ci /mmol; GE Healthcare, Milán, Italia) y concentraciones crecientes de E2 no marcado o 25HC durante 2 horas a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de CO2 de aire /5%. Después de eliminar el medio, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo /0,1% de metilcelulosa dos veces, se recogieron por raspado y centrifugación, y se lisaron con 100% de etanol, 500 l por placa de 60 mm, durante 10 minutos a temperatura ambiente [33]. La radiactividad de los extractos se midió por recuento de centelleo líquido. Ensayo de unión también se realizó utilizando Hek293 lisados de células enteras. Las células fueron despojados de cualquier estrógeno manteniéndolos en medio sin suero durante 2 días, y luego se lisaron en 500μl de tampón RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; 0,5% de Nonidet P-40; 0,5 mM EDTA) en presencia de una mezcla de inhibidores de proteasas que contienen 1,7 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 200 mmol /litro, sodiumorthovanadate 200 mmol /litro y 100 mmol /litro de fluoruro de sodio. La concentración de proteína se determinó usando el reactivo de Bradford de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Sigma-Aldrich, Inc., Milán, Italia). Cantidades iguales de extracto de toda la proteína se incubaron en ausencia o presencia de dos picomoles de ER recombinante y se incubaron con 1 nM de [3H] E2 y concentraciones crecientes de E2 sin marcar o 25HC durante 2 horas a 4 ° C. Atados y radioligandos libres se separaron en Sephadex G-25 columnas PD-10. La cantidad de receptor unido a [3H] E2 se determinó por recuento de centelleo líquido.
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) y Re-Chip ensayos
MCF7 células fueron cultivadas en placas de 10 cm a 70 -80% de confluencia, cambió a medio libre de suero durante 24 h y después se trató con vehículo, 10 nM E2 o 1μM 25HC para 1 h. Posteriormente, las células fueron reticulado con 1% de formaldehído y se sonicaron. Los sobrenadantes se immunocleared con ADN sonicado de salmón /proteína A agarosa (Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, Nueva York) y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-ER o no específica de IgG (Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milán, Italia). Los sedimentos se lavaron, se eluyó con un tampón que consiste en 1% de SDS y 0,1 mol /L de NaHCO3, y se digirieron con proteinasa K. ADN se obtuvo por extracción con fenol /cloroformo y se precipitó con etanol. Un volumen de 4 l de cada muestra se utilizó como molde para amplificar una región que contiene ERE, que se encuentra en el promotor pS2 por PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Milán, Italia). Los cebadores utilizados fueron 5'-GGCCATCTCTCACTATGAATCACTTCTGC-3 '(PS2 hacia delante) y 5'-GGCAGGCTCTGTTTGCTTAAAGAGCG-3' (PS2 inversa). Los datos se normalizaron a la entrada para la inmunoprecipitación. En los experimentos de Re-chip, los complejos se eluyeron mediante incubación durante 30 min en tampón de Re-IP (ditiotreitol 0,5 mM, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-Cl pH 8,1, NaCl 150 mM) y se sometieron a el procedimiento de chip, utilizando anti-SRC-1, anticuerpos SRC-3 y CBP (todos comprados de Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milán, Italia).
transcripción reversa y PCR en tiempo real
La expresión génica se evaluó mediante PCR en tiempo real como anteriormente hemos descrito [32]. Para pS2, PR, catepsina D, ciclina A, ciclina D1, HIF-1α, CTGF, FAS, SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1 y la proteína ribosomal 18S, que se usó como un gen de control para obtener valores normalizados, los cebadores fueron: 5 '-GCCCCCCGTGAAAGAC-3' (pS2 hacia delante) y 5'-CGTCGAAACAGCAGCCCTTA-3 '(pS2 inversa); 5'-GAGTTGTGAGAGCACTGGATGCT-3 '(PR hacia delante) y 5'-CAACTGTATGTCTTGACCTGGTGAA-3' (PR inversa); 5'-CTGGATCCACCACAAGTACAACA-3 '(catepsina D hacia delante) y 5'-CGAGCCATAGTGGATGTCAAAC-3' (catepsina D inversa); 5'-TGCACCCCTTAAGGATCTTCCT-3 '(Ciclina A hacia delante) y 5'-GTGAACGCAGGCTGTTTACTGT-3' (Ciclina A inverso); 5'-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3 '(Ciclina D1 hacia delante) y 5'-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3' (Ciclina D1 inversa); 5'-TGCATCTCCATCTTCTACCCAAGT-3 '(HIF-1 hacia delante) y 5'-CCGACTGTGAGTGCCACTGT-3' (HIF-1α inversa); 5'-CATTAAGAAGGGCAAAAAGTGCAT-3 '(CTGF hacia delante) y 5'-TGCAGCCAGAAAGCTCAAACT-3' (CTGF inversa); 5'-CGCTCGGCATGGCTATCT-3 '(FAS hacia delante) y 5'-CTCGTTGAAGAACGCATCCA-3' (FAS inversa); 5'-CCCGGATCGTCTTTGAGAAG-3 '(SERPINF1 hacia delante) y 5'-TCCAGAGGTGCCACAAAGCT-3' (SERPINF1 inversa); 5'-CCGTGCCAGCCTATTTCAAT -3 '(HSPA1L hacia delante) y 5'-AGCAATCACACCTGCATCCTT-3' (HSPA1L inversa); 5'-GCAGCGCCATGAGATTGTG-3 '(SELENBP1 hacia delante) y 5'-CGGATCTCCAAGGGAATAAGC-3' (SELENBP1 inversa), y 5'-GGCGTCCCCCAACTTCTTA-3 '(18S hacia delante) y 5'-GGGCATCACAGACCTGTTATT-3' (18S inversa), respectivamente .
inmunotransferencia
se realizaron lisados celulares y ensayos de inmunotransferencia como se describe anteriormente [32]. Los anticuerpos contra ER (F-10), ciclina D1 (M-20), CTGF (L-20), fosforilados ERK1 /2 (E-4) y ERK2 (C-14), β-actina (C-2) y β-tubulina (H-235-2) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (DBA, Milán, Italia). ERβ y HIF-1α se compraron de R & amp; D Systems, Inc. (Milán, Italia). Fosfo-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) y p38MAPK se adquirieron de señalización Cell Technology, Inc. (Milán, Italia).
Ensayos
proliferación y TUNEL
ensayos de proliferación cuantitativas se realizaron como se describe anteriormente [ ,,,0],32]. células HL-1 se sembraron en 2 pocillos portaobjetos de cámara Lab-Tek® II y se trataron durante 18 h. Después de la eliminación de medio, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% tamponada (pH 7,4) durante 30 min. Los portaobjetos se enjuagaron dos veces en PBS, pH 7,4. Un
In situ
kit de detección de muerte celular (DeadEnd ™, Sistema fluorométrico TUNEL, Promega Corp, Milán, Italia) se utilizó posteriormente para realizar el ADN marcado del extremo 3'-hidroxilo mediante TUNEL (Terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT) - mediada Nick End etiquetado) ensayo de dUTP-X como se describe anteriormente [34]. Etiquetado de las células se demostró que se correlaciona con criterios morfológicos típicos de la apoptosis. ADN se marcó en extremos 3 'con fluoresceína-dUTP por incubación a 37 ° C con tampón de reacción que contenía TdT en una cámara humidificada durante 1 h. Los núcleos de las células se tiñeron con yoduro de propidio. Después de tres lavados en PBS, la fragmentación del ADN de apoptosis se detectó directamente mediante la visualización de ADN marcado usando microscopio de fluorescencia. Para el control negativo, se incubaron los portaobjetos sin TDT; para obtener un control positivo, diapositivas fueron tratados con DNasa I 1μg /ml durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la exposición a dUTP fluoresceína y TDT.
preparaciones de corazón aislado y perfundido
Se aprobaron todos los protocolos experimentales por el Comité para el uso de Animales del Departamento de Fármaco-Biología de la Universidad de Calabria (ID aprobación 110 /2000A). Los procedimientos seguidos en el estudio estaban en conformidad con las normas de la Comunidad Europea sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio y con el
Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
publicada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH publicación No. 85-23, revisada en 1996). ratas macho adultas (Wistar, 220-280g, Harlan, Udine, Italia) fueron anestesiados por vía intraperitoneal inyección de carbamato de etilo (2 g /kg de peso corporal). Los corazones fueron entonces diseccionaron y se conectan a un aparato de Langendorff para la perfusión con una solución de Krebs-Henseleit (KHS) compuesto por (en mM) NaCl 113, KCl 4,7, NaHCO3 25, MgSO4 1.2, CaCl2 1.8, KH2PO4 1.2, glucosa 11, manitol 1,1, Na-piruvato 5 y gaseado con 95% O
2-5% de CO
2 (pH 7,4, 37 ° C). KHS fue entregado a un caudal constante de 12 ml /min. Para medir la actividad cardiaca, un balón de látex lleno de agua, conectado a un medidor de BLPR (WRI, Inc. EE.UU.), se inserta a través de la válvula mitral hacia el ventrículo izquierdo para permitir contracciones isovolúmicos y para grabar continuamente los parámetros mecánicos. El globo se llenó progresivamente con agua para obtener una presión diastólica final ventricular izquierda inicial de 5 a 8 mmHg [35]. Todos los corazones se sometieron a perfusión para un periodo de equilibrio de 15 min. Después del período de equilibrio, los corazones (n = 3) fueron asignados aleatoriamente a uno de los siguientes grupos: Grupo 1 (control): KH gaseado con 95% O
2-5% de CO
2; Grupo 2: KH gasifica con 95% de O
2-5% de CO
2 más 1 nM E2; Grupo 3: KH gasifica con 95% de O
2-5% de CO
2 más 100 nM 25HC; Grupo 4: KH gasifica con 50% de O
2-45% N
2-5% de CO
2; Grupo 5: KH gasifica con 50% de O
2-45% N
2-5% de CO
2 más 1 nM E2; Grupo 6: KH gasifica con 50% de O
2-45% N
2-5% de CO
2 más 100 nM 25HC
Todos los corazones se perfundieron durante 60 minutos para investigar el efecto. de cada compuesto y de los diferentes niveles de oxígeno en los cambios de CTGF y la expresión de ARNm de HIF-1α. Solución que contiene tratamientos estaba recién preparada antes de los experimentos. la presión del ventrículo izquierdo, la frecuencia cardíaca y el flujo coronario se controlaron durante todo el protocolo de perfusión. Al final de las perfusiones, ventrículos fueron extirpados e inmediatamente procesadas para la extracción de RNA.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA seguido de prueba de Newman-Keuls 'para determinar diferencias en los medios. P & lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativa
Resultados
25HC activa ER en las células cancerosas
Comenzamos evaluando si 25HC es capaz de transactivate un gen indicador ER transfectadas transitoriamente en. células de cáncer de mama (MCF7), que expresan ER y no ERβ como se juzga por RT-PCR (datos no mostrados). Curiosamente, 25HC activa ER de una manera dependiente de la dosis, aunque con una menor eficacia en comparación con E2 (Fig. 1A). Seguidamente, evaluó si 25HC podría antagonizar la activación transcripcional inducida por E2. células MCF7 se trataron entonces simultáneamente con el aumento de las concentraciones de tanto 25HC y E2, sin embargo, las respuestas transcripcionales fueron similares a los obtenidos utilizado E2 solo (Fig. 1A). Por el contrario, la actividad de luciferasa inducida por 10 nM E2 o 1μM 25HC fueron abrogadas usando dosis crecientes de la ICI antagonista de ER (Fig. 1B), lo que sugiere que ER media la activación de la transcripción tras la exposición a cada compuesto. Para proporcionar más datos con respecto a la capacidad de 25HC para activar ER y evaluar si ERβ también podría responder a 25HC, transfectadas transitoriamente células HEK293 ER-negativo con el gen reportero ER junto con el vector de expresión que codifica ER o ERβ. Es de destacar que sólo se permitió la expresión de ER 1μM 25HC para inducir la actividad de la luciferasa, que fue abolida por 10μM ICI (Fig. 1C-D). Para proporcionar más pruebas con respecto a la capacidad de 25HC para activar ER pero no ERβ, recurrimos a un sistema completamente heteróloga. En células HEK293, 1μM 25HC activa una proteína quimérica que consiste en el dominio de unión de ADN (DBD) del factor de transcripción de levadura Gal4 y el LBD de ER pero no ERβ (Fig. 1E-F). Una vez más, la transactivación de ER fue abolida por 10μM ICI (Fig. 1E-F). Para corroborar los resultados antes mencionados, hemos comprobado si 25HC podría inducir la expresión de los genes diana ERβ SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1, que se informaron de responder al tratamiento E2 [36]. El uso de células HEK293 transfectadas transitoriamente con un plásmido de expresión ERβ, la transcripción de estos genes fue estimulado por E2 pero no por 25HC (Fig. S1). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que 25HC activa ER de una manera selectiva y muestran que ER-LBD es suficiente para la respuesta transcripcional
.
células (A) MCF7 fueron transfectadas con un gen reportero luciferasa ER junto con el interno control de transfección de luciferasa de Renilla y se trata con concentraciones crecientes (escala logarítmica) de E2 y 25HC. Por otra parte, las células se trataron simultáneamente con dosis similares de cada compuesto. Los valores de actividad de luciferasa normalizadas de las células tratadas con vehículo (-) se establecieron de la inducción 1 veces, sobre la cual se calculó la actividad inducida por los tratamientos. células (B) MCF7 transfectadas con el gen reportero de ER fueron tratadas con 10 nM E2 o 1μM 25HC solo y en combinación con el aumento de la concentración del antagonista de ER ICI, como se indica. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por triplicado. células (C-F) HEK293 se transfectaron con el gen reportero ER luciferasa (EREluc) y ER (C) o ERβ (D) los plásmidos de expresión, con Gal4 GK1 gen informador y las proteínas de fusión Gal4 que codifica el ligando de unión de dominio (LBD) de ER (GalERα) (e) o ERβ (GalERβ) (F) y tratados con 10 nM E2 o 1μM 25HC solo y en combinación con antagonistas de 10μM ER ICI, como se indica. Cada punto de datos representa la media ± SD de tres experimentos realizados por triplicado.
Sobre la base de los resultados obtenidos en los experimentos de transfección, pregunta si 25HC podría comportarse como un ligando y competir con E2 para la la unión a ER. En un ensayo de unión de células completas con células MCF7 25HC desplaza el radiomarcado E2 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2A). Del mismo modo, cuando se añadió ER recombinante a un lisado celular HEK293, que por sí mismo no se une a E2, 25HC compitió eficazmente contra el trazador E2 (Fig. 2B-C). Los resultados de estos ensayos de unión son compatibles con la idea de que 25HC une ER directamente, pero serán necesarios experimentos adicionales para establecer el modo de acción de forma inequívoca.
Los gráficos muestran la unión residual del trazador radiactivo en presencia de concentraciones crecientes de E2 sin marcar y 25HC en las células MCF7 (a), en lisados de células Hek293 en presencia (B) o ausencia de la proteína recombinante ER (C). Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de las muestras por triplicado de tres experimentos separados. Tenga en cuenta que la cantidad de trazador unido en ausencia de competidor se fijó arbitrariamente en 100% y que los valores absolutos subyacentes diferente entre los tres grupos.
25HC induce el reclutamiento de ER a la secuencia promotora pS2 en células MCF7
sobre la base de los resultados antes mencionados, se evaluó si 25HC podría inducir el reclutamiento de ER a la región de ADN específico con el ERE, que dentro de la secuencia del promotor pS2. Realizar un ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) en las células MCF7, el tratamiento con 1h 1μM 25HC induce el reclutamiento de ER al promotor pS2 como se observa utilizando 10 nM E2 (Fig. 3A). Por otra parte, para verificar si 25HC puede reclutar coactivadores al promotor PS2, se realizó un ensayo de Re-chip usando anticuerpos contra el SRC-1 y SRC-3, que pertenece al receptor de esteroides coactivador (SRC) familias y en contra de la CBP ( proteína de unión a CREB) [37]. Todos los co-activadores fueron reclutados de manera eficiente al promotor pS2 exposición de las células MCF7 a 10 nM E2, sin embargo 1μM 25HC mostró una ligera eficacia (Fig. 3A). Por lo tanto, E2 y 25HC muestran una capacidad diferente en el reclutamiento de co-activadores, que contribuyen a la potencia agonística de los ligandos.
(A) y E2 25HC inducen el reclutamiento de ER en el sitio ERE situado en el promotor de pS2 secuencia en las células MCF7. Las células fueron tratadas durante 1 h con vehículo, E2 (10 nM) o 25HC (con 1 m) y sometido al procedimiento de la cromatina inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-IgG específicos anti-ER o. Para los ensayos de Re-chip, anti-SRC-1, SRC-3 y anticuerpos CBP fueron utilizados. Las secuencias amplificadas fueron evaluados por PCR en tiempo real. (B-C) Evaluación de la expresión del ARNm de PS2, receptor de progesterona (PR), catepsina D, ciclina A y ciclina D1 por PCR en tiempo real en MCF7 y células BG-1. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 10 nM E2 y 1μM 25HC. Los resultados obtenidos a partir de experimentos realizados por triplicado se normalizaron para la expresión 18S y se muestran como el cambio veces de la expresión de ARN en comparación con las células tratadas con vehículo. Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por triplicado. (•), (°), (▪), (□) (♦) indican p
. & Lt; 0,05 para las células que recibieron vehículo (-) frente a tratamientos
regula 25HC la expresión de ER genes diana en MCF7 y células BG-1
Seguidamente, evaluó el potencial de 25HC para regular la expresión de genes diana conocidos, tales como ER pS2, PR, catepsina D, ciclina a y ciclina D1 en cáncer de mama MCF7 y células de cáncer de ovario BG-1. Como se determinó por el tiempo real RT-PCR, un 24 h de exposición a 1μM 25HC regulados hasta la expresión de mRNA de todos los genes examinados, similar al tratamiento con 10 nM E2 (Fig. 3B-C). Para corroborar estos resultados, se determinó la capacidad de 25HC para modular la expresión de ER y ciclina D1 niveles de proteína en MCF7 y células tumorales BG-1. Hasta la fecha, la baja regulación de ER por los estrógenos ha sido considerado como un sello distintivo de la activación del receptor [38], mientras que la sobre regulación de la ciclina D1 por E2 ha sido ampliamente informado [39]. Cabe destacar que un 24 h de exposición a 1μM 25HC reguladas por los niveles de proteína ER (Fig. 4A-B). Por el contrario, un tratamiento de 24 h con 1μM 25HC hasta reguladas expresión de la proteína Ciclina D1, que fue abrogada por 10μM ICI (Fig. 4C-D). En conjunto, estos resultados sugieren que 25HC es capaz de regular la expresión de ER genes diana como E2.
inmunotransferencias de ER (A, B) y ciclina D1 (C, D) de MCF7 y células BG-1. Las células fueron tratadas durante 24 h con vehículo (-), 10 nM E2 o 1μM 25HC y en presencia de 10μM ER-antagonista ICI, como se indica. β-actina sirve como control de carga. 25HC induce efectos proliferativos en las células MCF7 y BG-1 (E-H). Las células se trataron durante 5 días con concentraciones crecientes (escala logarítmica) de E2 y 25HC y se contaron en el día 6 (E, G). Las células fueron tratadas con 10 nM E2 o 1μM 25HC y en combinación con 10μM ER-antagonista ICI y se contaron en 6 días (F, H). Proliferación de las células que reciben vehículo se estableció como 100% a la que se calculó el crecimiento celular inducido por tratamientos. Cada punto de datos es la media ± SD de tres experimentos independientes. (•), (°) indican
p
. & Lt; 0,05 para las células que recibieron vehículo (-) frente a tratamientos
25HC induce efectos proliferativos en las células MCF7 y BG-1
a continuación, tratamos de evaluar la contraparte biológica de los efectos mencionados anteriormente ejercidas por 25HC. Los ensayos de crecimiento realizados en MCF7 y células de cáncer de BG-1 demostraron que 25HC es capaz de inducir efectos proliferativos de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4E y 4G). A continuación, las respuestas de crecimiento a 10 nM E2 y 1μM 25HC fueron abolidas por 10μM ICI (Fig. 4F y 4H), lo que sugiere que ER media la proliferación celular inducida por exposición a ambos compuestos.
imita 25HC los efectos de E2 contra la apoptosis inducida por hipoxia en los cardiomiocitos
a fin de evaluar las propiedades estrogénicas de 25HC, recurrimos a un sistema modelo completamente diferente, como los cardiomiocitos HL-1 [28], que expresan ER y los niveles muy bajos, a juzgar por ERβ RT-PCR (datos no mostrados). Se ha informado que E2 protege a las células de lesión hipóxica en diferentes contextos de células [40] - [42]. Por lo tanto, se evaluó si E2 y 25HC podrían proteger HL-1 cardiomiocitos de la apoptosis inducida por el agente de la hipoxia-mimético conocido CoCl
2 [43] - [44]. La determinación de la degradación del ADN mediante el ensayo TUNEL, aproximadamente el 70% de las células HL-1 resultó positivo para la tinción de TUNEL después de la exposición a CoCl
2 (Fig. 5 y la Fig. S2). Es de destacar que el porcentaje de células apoptóticas se redujo significativamente en presencia de cualquiera de 10 nM E2 o 1μM 25HC (Fig. 5 y la Fig. S2). Los efectos protectores ejercidas por ambos compuestos fueron abrogadas mediante 10μM ICI, que por sí solo no indujo la apoptosis (Fig. 5 y Fig. S2). Tomados en conjunto, los resultados mostrados indican que E2 y 25HC pueden proteger a los cardiomiocitos de la apoptosis inducida por hipoxia de una manera ER-dependiente.
No se detectaron cambios apoptóticos utilizando TUNEL (en verde) y los núcleos se tiñeron de yoduro de propidio ( PI, en rojo), como se indica. fotografías representativas después del tratamiento 18h con vehículo y 100μM CoCl2, 10 nM E2, 1μM 25HC solo, o una combinación de 100μM CoCl2 con 10 nM E2 en presencia o ausencia de 10μM ICI, 100μM CoCl2 con 1μM 25HC en presencia o ausencia de 10μM ICI.
E2 y 25HC impiden la expresión inducida por hipoxia HIF-1α de CTGF y en cardiomiocitos
se ha informado anteriormente que HIF-1α media la expresión de CTGF estimulada por la hipoxia en diferentes contextos celulares [ ,,,0],45] - [47]. Mientras que el potencial regulación de HIF-1α por E2 se ha sugerido en algunos modelos [48] - [49], la capacidad de los estrógenos para influir en la expresión de CTGF inducida por hipoxia en el sistema cardiovascular que queda por investigar. Sobre la base de estas observaciones, hemos comprobado que HIF-1α y CTGF están regulados tanto a nivel de ARNm y proteínas de una manera dependiente del tiempo de 100μM CoCl
2 en células HL-1 (Fig. 6A, C) . Se observaron respuestas similares incubación de las células HL-1 en presencia de la tensión de oxígeno baja (2% de O
2) (Fig. 6B, D). A continuación, la expresión inducida por hipoxia de HIF-1α y CTGF fue abolida mediante el inhibidor de la síntesis de ARN de ADN cebado con actinomicina D (Fig. S3), lo que sugiere que los mecanismos de transcripción son responsables de la sobre regulación de ambos HIF-1α y CTGF . A continuación, se determinó que el silenciamiento de HIF-1α abroga la inducción de CTGF observados ya sea por exposición a la CoCl
2 o condiciones de hipoxia (2% de O
2) (Fig. 6E-F), lo que indica que media HIF-1α la sobre regulación de CTGF por la hipoxia en las células HL-1. A partir de entonces, nos preguntamos si E2 y 25HC podrían influir en HIF-1α y la expresión de CTGF. Curiosamente, encontramos que, o bien 10 nM E2 o 1μM 25HC prevenir la sobre regulación de HIF-1α y CTGF, ya sea por CoCl
2 o baja tensión de oxígeno (2% de O
2) por lo tanto mRNA (Fig. S4) y los niveles de proteína (Fig. 7A-B).