Extracto
Los microARN (MIR) son pequeñas, endógena, los ARN no codificantes que regulan la estabilidad y /o traducción del mRNA objetivos complementarios. MIR han surgido no sólo como moduladores críticas de los procesos fisiológicos normales, pero su desregulación puede tener un impacto significativo de la próstata y otros cánceres. La expresión de miR-23b y miR-27b, que son codificados por el mismo grupo de miR (miR-23b /-27b), se downregulated en metastásico, los tumores resistentes a la castración en comparación con el cáncer de próstata primario y el tejido benigno; sin embargo, su posible papel en la progresión del cáncer de próstata es desconocida. Se encontró que la expresión ectópica de miR-23b /-27b en dos líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a la castración independientes resultó en la supresión de la invasión y la migración, así como reducción de la supervivencia en agar blando (una medida de anoikis). Sin embargo, no hubo efecto de miR-23b /-27b sobre la proliferación celular que sugiere que estos miRs funcionan como metástasis (pero no el crecimiento) supresores en el cáncer de próstata. A la inversa, la inhibición de miR-23b /-27b en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP dependiente de andrógenos menos agresivo resultó en la invasión y migración mejorada también sin afectar a la proliferación. Mecánicamente, se encontró que la introducción de miR-23b /-27b en metastásico, las líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a la castración dieron como resultado una atenuación significativa de la actividad Rac1 sin afectar a los niveles totales de Rac1 y causaron aumento de los niveles del supresor de tumor E-cadherina. La inhibición de estas miRs tuvo el efecto opuesto en las células LNCaP dependientes de andrógenos. Estos resultados sugieren que el miR-23b /-27b son supresores de metástasis que pueden servir como nuevos biomarcadores y agentes terapéuticos para la enfermedad resistente a la castración
Visto:. Ishteiwy RA, Ward, TM, Dykxhoorn DM, Burnstein KL (2012) el microARN Cluster -23b /-27b Suprime la metastásico fenotipo de las células del cáncer de próstata resistente a la castración. PLoS ONE 7 (12): e52106. doi: 10.1371 /journal.pone.0052106
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 31 de julio de 2012; Aceptado: 9 de noviembre de 2012; Publicado: December 26, 2012
Derechos de Autor © 2012 Ishteiwy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de subvención CA132200 (KLB a) del Departamento de Defensa y la formación predoctoral subvención W81XWH-11-1-0314 (RAI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
durante más de medio siglo, la deprivación androgénica ha sido el tratamiento estándar para el cáncer de próstata avanzado y metastásico, como tumores dependen inicialmente en andrógenos para la supervivencia y el crecimiento. Desafortunadamente, en la mayoría de los pacientes, los tumores progresan con el tiempo de una forma incurable, resistente a la castración y metastásico. Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias eficaces y precisos indicadores de pronóstico para mejorar la atención clínica de los hombres con cáncer de próstata.
La metástasis, un sello distintivo de malignidad, es la migración de las células tumorales a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo del tumor original sitio a órganos distantes. desarrollo metastásico procede a través de un proceso de múltiples pasos que incluye la invasión local, el movimiento en el torrente sanguíneo (intravasación), la supervivencia en la práctica, la salida de los vasos sanguíneos (extravasación), la iniciación y el mantenimiento de las micrometástasis en sitios distantes y, finalmente, la vascularización de los tumores nuevos [ ,,,0],1]. Para proceder por esta cascada metastásica, las células tumorales primarias se acumulan los cambios genéticos y epigenéticos, incluyendo la desregulación de los patrones de expresión de genes miARN. Elucidar los mecanismos que facilitan la migración de las células del cáncer y la invasión es un objetivo importante de la investigación del cáncer, como la metástasis sigue siendo la causa del 90% de las muertes por tumores sólidos [1]. La mediana de supervivencia para los pacientes con cáncer de próstata localizado es mayor de 5 años, mientras que los hombres con enfermedad metastásica han disminuido considerablemente las tasas de supervivencia [1].
Los microARN (MIR), pequeña no codificante ARN de 18 a 24 nucleótidos, se predice para regular la expresión de más de 90% de la proteína que codifica genes, lo que afecta diversos procesos celulares y moleculares [2]. MIRS modulan los niveles de ARNm y la traducción a través de apareamiento de bases entre la secuencia canónica semilla de los miARN (nucleótidos 2-8 en el extremo 5 ') y las secuencias complementarias de los partidos de semillas ARNm diana, que normalmente se encuentran en la región no traducida 3' (UTR ) [3]. MicroARNs silencian sus objetivos afines por escisión de ARNm, la represión de traducción, la desestabilización del mRNA o una combinación de estos mecanismos [4]. Más de 50% de los genes miR anotada humanos se encuentran en regiones cromosómicas que son susceptibles a la amplificación, deleción o traslocación durante el curso del desarrollo del tumor [5]. MIRS juegan un papel crítico en la metástasis, probablemente debido a su capacidad de post-transcripcionalmente regular las redes de genes importantes para la invasión celular, la motilidad y la migración [6].
La biogénesis de MIR es un muy regulado, proceso de varios pasos [ ,,,0],7]. Más del 40% de los MIR humanos se organizan en grupos evolutivamente conservados, que se cotranscribed como discretos policistrónico pri-miRNAs. Un gran número de MIR y miR racimos están desreguladas en la oncogénesis y el desarrollo metastásico [8].
miR-23b y miR-27b, que comprenden un grupo en el cromosoma humano 9, son específicamente las reguladas en la castración humana muestras clínicas resistentes a cáncer de próstata (CRPC) [9] - [12], así como en células de modelos CRPC [10], [13]. Curiosamente, Sun et al. [12] encontró que miR-23b /expresión -27b se reduce significativamente (2,8 veces) en los tumores primarios (en comparación con el tejido normal adyacente) y se reduce aún más por 3,2 veces en muestras CRPC metastásicos. En este estudio, 15 de 17 muestras de tumores CRPC exhibieron regulación a la baja de miR-23b /-27b en comparación con muestras de tumores primarios [12]. A pesar de la correlación de la disminución de miR-23b /-27b con el aumento de la patogénesis de enfermedades, el papel de miR-23b /-27b en la enfermedad metastásica CRPC no ha sido bien caracterizado. Aquí nos proporcionan pruebas de que el miR-23b /-27b suprime los procesos metastásicos clave, incluyendo la invasión celular, la migración y la supervivencia independiente del anclaje sin afectar la proliferación celular. Estos efectos son acompañados por un aumento de los niveles de E-cadherina y atenuación de la actividad Rac1
E-cadherina, una molécula de adhesión celular, suprime el fenotipo invasivo y migratoria de las células del cáncer [14] -. [17]. La pérdida de E-cadherina se asocia típicamente con la invasividad tumoral, diseminación metastásica y el mal pronóstico del paciente en una variedad de cánceres, incluyendo el de próstata. Por ejemplo, la pérdida de E-cadherina confiere la capacidad metastásica de las células, relativamente no agresivos de mama transformado epiteliales [16]. Además, las células E-cadherina negativo presentan una mayor invasión y el potencial metastásico en comparación con células E-cadherina positivos en la próstata de rata modelo de tumor Dunning [14], [15], [18]. La Rho GTPasa Rac1, que regula los reordenamientos del citoesqueleto necesarios para la migración celular, está fuertemente asociado con el cáncer de próstata agresivo [19] - [22]. Rac1 elevada es necesaria para el comportamiento invasivo de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 [23]. Por lo tanto, los datos presentados aquí son consistentes con un papel para el miR-23b /cluster -27b en la supresión de la metástasis a través de efectos sobre el E-cadherina y Rac1.
Materiales y Métodos
Cultivo Celular
La líneas celulares de cáncer de próstata humano ALVA31 (obtenido a partir de los Dres. Stephen Loop y Richard Østensen, Departamento de Asuntos de Veteranos del Centro Médico, Tacoma, WA) [24], LNCaP (American Type Culture Collection, Manassas, VA), PC3 -ML (obtenido de Dr. Alessandro Fatatis, Drexel University College de Medicina) [25] se pasaron y se mantuvo en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 UI /ml de penicilina, 100 g /ml de estreptomicina y 100 g /ml L-glutamina. Todos los cultivos se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
Aislamiento de RNA y RT-PCR cuantitativa
El ARN total se aisló usando el aislamiento mirVana miARN kit (Applied Biosystems, Foster City, California). El TaqMan tallo-bucle método RT-PCR usando el kit de Taqman® miARN transcripción inversa y los ensayos Taqman® miARN (Applied Biosystems) se utilizó para evaluar la expresión de miR-27b.U6 ARN nuclear pequeño sirve como un control interno para todos los experimentos .
inmunotransferencia
Las proteínas celulares se extrajeron y se separaron en geles de SDS-PAGE y análisis Western blot se realizaron de acuerdo con los procedimientos estándar. Western Blot de β-actina en la misma membrana se utiliza como control de carga. Los anticuerpos utilizados fueron anti-E-cadherina (BD 610181), anti-Rac1 (Millipore 23A8), y anti-actina (Santa Cruz 1616).
Los plásmidos y Producción de Lentiviral
El humana miR-23b /-27b precursor (pMIRNA-23b /-27b-GFP) y el control mezclado (pMIRNA-revueltos-GFP) clonado en vectores de lentivirus (Sistemas Biosciences (SBI) Mountain View CA, EE.UU.) se transfectaron en células HEK LentiX ( Clontech, Mountain View CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. expresión de GFP en células ALVA31 y PC3-ML transducidas se determinó mediante citometría de flujo.
Citometría de Flujo
Trypsinized células se permeabilizaron usando 0,05% de tripsina con EDTA 0,53 mM (Cellgro). La citometría de flujo se realizó en un Accuri C6 citometría de uso de software Cflow de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Teléfonos transfecciones
nucleótidos antisentido modificados químicamente (antagomirs) contra el miR-23b y miR-27b o antagomirs de control fueron adquiridos de Applied Biosystems y se transfectaron a 50 nM usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realizaron todos los ensayos experimentales de 72 horas después de la transfección.
Ensayos de Migración
ensayos de cero se realizaron en ALVA31 células 72 horas después de la transducción con miR-23b /-27b o revueltos de control o en células LNCaP 72 horas después de la transfección con antagomir-23b /o controlar -27b antagomir. Una punta de pipeta estéril se arrastró a través de monocapas de células confluentes para crear de cero. Las monocapas fueron lavadas dos veces para eliminar los desechos celulares y se incubaron a 37 ° C 5% de CO
2 durante 4 horas. Las fotografías fueron tomadas inmediatamente después del rascado y de nuevo después de 4 horas. Image J se utilizó para medir la anchura de cero como una función del tiempo. El porcentaje de reducción de distancias (cero) se calculó como el porcentaje de la zona libre de células restante en comparación con el área de la herida inicial. Dos experimentos independientes se realizaron con un total de al menos 6 arañazos para cada línea celular.
Ensayos de proliferación de células
ALVA31, PC3-ML (que expresa el miR-23b /-27b o revueltos de control) y las células LNCaP (transfectadas con antagomir-23b /-27b o controlar antagomir) se sembraron a una densidad inicial de 10.000 células /pocillo en una placa de seis pocillos. En los puntos de tiempo indicados, se tripsinizaron las células y las células viables (aquellos que no incluyen azul de tripano) se contaron usando un hemocitómetro.
invasión de Matrigel Los ensayos
se realizaron Matrigel Invasión de ensayo (BD Biosciences) utilizando células ALVA31 y PC3-ML 72 horas después de la transducción con miR-23b /-27b o revueltos control de las células LNCaP y 72 horas después de la transfección con antagomir-23b /o controlar -27b antagomir. 50.000 células se mueren de inanición de suero durante 16 horas y luego se sembraron en la cámara superior del aparato transwell con la membrana de Matrigel recubierto (24 inserto así, tamaño de poro de 8 mm). Medio suplementado con 10% FBS se utilizó como quimioatrayente. Después de la incubación a 37 ° C durante 48 horas, las cámaras superiores fueron eliminados con un algodón para eliminar las células no migratorias o no invasivos. Las células en la superficie inferior de la membrana fueron fijadas con metanol frío, se tiñeron con 0,01% de cristal violeta y se contaron bajo un microscopio.
Soft Agar Ensayos
ensayos de agar blando se realizaron en ALVA31 o células PC3-ML 72 horas después de la transducción con miR-23b /-27b o revueltos control. Anclaje independiente de crecimiento se evaluó como se describe anteriormente [26]
Rac1 Ensayos de actividad
ensayos de actividad se realizaron en Rac1 ALVA31 o células PC3-ML 72 horas después de la transducción con miR-23b /. - 27b o revueltos de control. Unida a GTP Rac1 se separó de PIB-Rac1 utilizando un enfoque desplegable como se describe anteriormente [19]. Brevemente, los lisados celulares se incubaron con 200 mg /ml PBD-GST [dominio de unión a p21-, PBD, del PAK efector Rac1 /Cdc42 (quinasa activada por p21)]. GTP-Rac1 se recuperó tras la incubación con perlas de glutatión-agarosa. Se recogieron Complejos desnaturalizados y se resolvieron por SDS-PAGE. Activo Rac1 se detectó mediante transferencia de Western con anticuerpos anti-Rac1 (Millipore). Un total de 5% del lisado original también fue analizado por inmunotransferencia para determinar los niveles totales de Rac1 (PIB y GTP).
Resultados
miR-23b /-27b Suprime Motilidad , la invasión y la independiente del anclaje crecimiento de las células del cáncer de próstata resistente a la castración
Dada la correlación inversa entre el miR-23b /-27b expresión y el fenotipo maligno de cáncer de próstata humano, que busca evaluar el papel potencial antineoplásico (s) para este cluster miARN. A tal fin, el miR-23b /cluster -27b se expresó ectópica utilizando un vector lentiviral (también codifica GFP) en dos líneas independientes altamente agresivos resistentes a la castración cáncer de próstata de células, ALVA31 y PC3-ML. 72 horas después de la transducción, las células se analizaron para la expresión de GFP mediante citometría de flujo con el fin de determinar la eficiencia de la transducción para cada experimento (S1). Los experimentos se realizaron sólo cuando más de un 95% de las células expresó GFP. Dado que el miR-27b está situado a 3 'de miR-23b, que supervisó los niveles de miR-27b por qPCR transcriptasa inversa después de la transducción con lentivirus que codifican este cúmulo miARN o un control de miARN no específica (datos no mostrados). Transducción con el miR-23b /vector lentiviral -27b resultó en niveles miR-27b comparables a las que se encuentran de forma natural en las células MCF7, que sirvieron como control positivo para el miR-27b [27]. Alternativamente, miR-23b /-27b se inhibió en la línea LNCaP dependiente de andrógenos usando antagomirs, que son oligonucleótidos sintéticos complementarios a los genes miARN objetivo que conducen a la escisión de los genes miARN correspondiente (S2).
Para determinar si miR-23b /-27b regula los procesos metastásicos celulares, se analizaron los efectos de la alteración de miR-23b /expresión -27b sobre la motilidad celular resistente a la castración y la migración. El uso de los ensayos de cero, se encontró que la expresión ectópica de miR-23b /-27b en la línea CRPC, ALVA31 disminución de la motilidad celular de aproximadamente 2 veces después de sólo 4 horas (Figura 1A). A la inversa, la inhibición endógena de miR-23b /expresión -27b en las células LNCaP, que tienen relativamente altos niveles endógenos de estos miRNAs y exhiben poca motilidad, resultó en mayor que 2 veces aumento de la motilidad en comparación con las células control transfectadas con antagomir (Figura 1B ).
-27b expresión disminuye la migración de células de cáncer de próstata resistente a la castración mientras que la inhibición de miR-23b /-27b aumenta la migración de las células de cáncer de próstata andrógeno-dependientes. los ensayos de cero se realizaron en células que expresan ALVA31 miR-23b /-27b o revueltos control (A) y las células LNCaP transfectadas con 50 nM antagomir-23b-27b o controlar antagomir (B). Las imágenes de las zonas despejadas (imágenes representativas se muestran a la derecha) fueron tomadas antes y después de una incubación de 4 horas y las áreas despejadas midieron utilizando el software Image J. El porcentaje medio de reducción de distancias (± SD) (debido a la migración de células) se muestra para dos experimentos independientes a partir de 7 arañazos (A) y 6 arañazos (B) (*** p & lt; 0,001).
a continuación, se determina si el miR-23b /expresión -27b invasividad de las células resistentes a la castración utilizando cámaras de invasión de Matrigel afectada. Se añadieron células privadas de suero a las cámaras superiores de la transwell y el número de células invasoras través de la barrera de Matrigel en respuesta a quimioatrayente (suero) durante un período de tiempo de 48 h se evaluaron. Introducción de miR-23b /-27b en ALVA31 y células PC3-ML disminuyó significativamente el número de células invasoras en más de 2 veces (Figura 2A y B). Por el contrario, el agotamiento de miR-23b /-27b actividad en la línea celular LNCaP andrógeno-dependientes menos agresivo mejora de forma significativa la invasión de células (Figura 2C).
-27b expresión disminuye la capacidad de invasión de las células del cáncer de próstata resistente a la castración mientras que la inhibición de miR-23b /-27b en células de cáncer de próstata andrógeno-dependientes aumenta la invasividad. A, ensayos de invasión de Matrigel se realizaron en ALVA31 células (A) y células PC3-ML (b) expresar miR-23b /-27b o revueltos control de las células transducidas. Los paneles superiores muestran regiones representativas de los filtros de cámara con células violeta cristal manchado. El factor de cambio (± SEM) representa el número de células invadidas por cámara dividido por los controles a partir de tres experimentos independientes realizados por triplicado para A y los medios (± SD) de un experimento independiente realizado por triplicado para B (*** P & lt; 0,001 ). C, las células LNCaP fueron transfectadas con 50 nM de control antagomir o antagomir-23b /-27b. ensayos de invasión Matrigel se llevaron a cabo 72 horas después de la transfección como se explicó anteriormente. Se muestran las medias (± DE) de dos experimentos independientes realizados por triplicado (*** P & lt; 0,001).
Además de la migración y la invasión, las células de carcinoma metastásico, con frecuencia adquieren la capacidad de crecer en de manera independiente de anclaje, resistencia a la anoikis. Por lo tanto, que analizaron los efectos de miR-23b /-27b expresión en la supervivencia de células de cáncer de próstata en agar blando. ALVA31 células y PC3-ML (miR-23b /-27b expresar y revuelto transducidas de control) se sembraron en los medios de comunicación bajo el apego (agar blando) y la supervivencia de la colonia se evaluó 2-4 semanas después de la siembra. La formación de colonias se vio afectada significativamente en ALVA31 y líneas de células P3-ML expresar miR-23b /-27b en comparación con los controles revueltos (Figura 3). Estos datos sugieren fuertemente que el miR-23b /-27b expresión confiere sensibilidad a la anoikis células de cáncer de próstata resistentes a la castración agresivos.
-27b disminuye el crecimiento de anclaje independiente de líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a la castración. ensayos de agar blando se realizaron en ALVA31 y células PC3-ML expresar miR-23b /-27b o transducidas con control mezclado (** P & lt; 0,01). El número medio de colonias (± SEM) por placa a partir de dos experimentos independientes realizados por triplicado para cada línea celular se muestra (** p & lt; 0,01).
Curiosamente, la sobre expresión de miR-23b /- 27b en las líneas celulares resistentes a la castración, ALVA31 y P3-ML, no afectaron significativamente la proliferación celular (Figura 4A y B). Además, la inhibición de estos miRs en células de cáncer de próstata LNCaP dependientes de andrógenos también no afectó las tasas de proliferación (Figura 4C). Estos resultados sugieren que el miR-23b /cluster -27b puede jugar un papel clave en el proceso metastásico, como se indica por los fenotipos observados en ensayos de invasión, migración y anoikis. Sin embargo, las alteraciones en el nivel de la miR-23b /cluster -27b no tuvieron ningún efecto sobre la proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata
.
-27b no regular la proliferación de células de cáncer de próstata. A y B, la proliferación de células que expresan miR-23b /-27b se comparó con la de las células control transducidas revueltos. El número de células media (± SEM) de un total de tres experimentos independientes realizados por triplicado se muestra para ALVA31 células y el número de células medio (± SD) de un experimento representativo realizado por triplicado se muestra para las células PC3-ML. C, se evaluó la proliferación de las células LNCaP transfectadas con antagomir-23b /-27b o controlar antagomir. Se muestra el número de células media (± DE) de dos experimentos independientes realizados por triplicado.
Expresión ectópica de miR-23b /-27b aumenta notablemente los valores de proteína E-cadherina y Rac1 Reduce Actividad
Para comprender los mecanismos moleculares de miR-23b /-27b mediada por la inhibición de metástasis fenotipos, se analizó la expresión de los factores clave en la migración de células de cáncer y la invasión. Por lo general, la migración y la invasión de las células tumorales es promovida por la pérdida de la interacción de las uniones adherentes con el citoesqueleto y los cambios subsiguientes en las actividades de la familia Rho GTPasas pequeñas como Rac1 y Cdc42 [28]. Se encontró que la expresión ectópica de miR-23b /-27b resultó en un marcado incremento de los niveles de proteína E-cadherina en células PC3-ML ALVA31 y. Por el contrario, la inhibición de miR-23b /-27b en las células LNCaP generado una disminución en los niveles de E-cadherina (Figura 5).
-27b aumenta significativamente la expresión de E-cadherina en líneas celulares resistentes a la castración. ALVA31 células PC3-ML o que expresan miR-23b /-27b o transducidas con control mezclado y las células LNCaP transfectadas con antagomir-23b /o controlar -27b antagomir se sometieron a Western Blot para la E-cadherina y actina. borrones representativos se muestran de un total de 2-6 experimentos.
actividad Rac1 se asocia con y parece ser esencial para el fenotipo metastásico del cáncer de próstata, así como, otros cánceres epiteliales [19] , [29]. Rac1 actividad endógena promueve el crecimiento de anclaje independiente y es necesario para el comportamiento invasivo de la línea celular PC3 CRPC [29]. Por estas razones, se determinó si la expresión ectópica de miR-23b /-27b en las células de cáncer de próstata agresivos afectó la actividad Rac1. Introducción de miR-23b /-27b en ALVA31 y PC3-ML, ambos de los cuales tienen una alta actividad Rac1 endógena [19], atenuó significativamente la actividad de Rac1 sin afectar los niveles totales de Rac1 (Figura 6). Tomados en conjunto, estos datos proporcionan una visión mecanicista en el papel de miR-23b /-27b en la supresión de la metástasis fenotipos.
-27b disminuye significativamente la actividad de Rac1, pero no los niveles totales de Rac1 en líneas celulares de cáncer de próstata resistentes a la castración. ensayos de actividad se realizaron en Rac1 ALVA31 (A) y las células PC3-ML (B) que expresan miR-23b /-27b o transducidas con control mezclado. Unida a GTP Rac1 se separó de PIB-Rac1 usando un ensayo de pull-down como se describe en Materiales y Métodos. Se recogieron los complejos que contienen GTP-Rac1 (Rac1 activo), desnaturalizado y se resolvieron por SDS-PAGE seguido de transferencia Western con anticuerpos anti-Rac1. Rac1 total (PIB-y unida a GTP) representa el 5% del lisado celular original. Actina se utilizó como control de carga. La cuantificación de los tres experimentos independientes se muestra con barras de error representan SEM (* P & lt; 0,05), (** p & lt; 0,01).
Discusión
MIR modulan una amplia variedad de factores biológicos y procesos patológicos, incluyendo la cascada metastásica. Más de un millar de MIR están codificadas en el genoma humano y la elucidación de sus funciones es un área importante de investigación [6]. Dado que muchos MIR tienen un papel en la apoptosis y la mitogénesis [30] su contribución potencial a la metástasis puede ser difícil de discernir. Mostramos aquí que el miR-23b /-27b suprimió la migración y la invasión de las células del cáncer de próstata agresivos sin ejercer influencias de confusión sobre la proliferación celular. MIRS con este tipo de características se describen como candidato "supresores de metástasis" [6], [31].
La capacidad de las células tumorales para contrarrestar la anoikis, migrar e invadir requiera la obtención de múltiples rasgos moleculares [32] . Nuestros datos muestran que la expresión ectópica de miR-23b /-27b en líneas de células metastásicas CRPC, ALVA31 y PC3-ML, resultó en un crecimiento disminuido en agar blando, así como la disminución de la migración celular y la invasión. A la inversa, la inhibición de miR-23b /-27b en la línea celular de cáncer de próstata dependiente de andrógenos, LNCaP, resultó en la migración celular y la invasión mejorada. Para que las células epiteliales de tumor para invadir y migrar, la integridad de la membrana epitelio y el sótano debe ser interrumpido permitiendo que las células para obtener acceso en el estroma subyacente. Este proceso requiere la interrupción de los contactos célula-célula epitelial, que pueden ocurrir a través de disminución de los niveles de moléculas de adhesión celular tales como E-cadherina. La expresión de miR-23b /-27b aumentó los niveles de proteína E-cadherina en dos líneas celulares CRPC independientes; por el contrario la inhibición de miR-23b /-27b en una línea celular de cáncer de próstata andrógeno-dependientes menos agresivo, LNCaP, resultó en una disminución de los niveles de E-cadherina.
La pérdida de la molécula de adhesión celular E-cadherina en la próstata las muestras de pacientes con cáncer está fuertemente asociada con el comportamiento metastásico y los pobres resultados clínicos [14], [15], [18]. Estos estudios apoyan la desregulación E-cadherina como un evento crítico en la progresión del cáncer de próstata y son consistentes con nuestros resultados que el miR-23b /-27b-expresión dio lugar a un aumento de los niveles de E-cadherina y una disminución en los rasgos metastásicos. Las bases moleculares de la regulación de E-cadherina en el miR-23b /27b que expresan las células de cáncer de próstata es desconocida. Si bien se especuló que este efecto se debe a miR-23b /-27b mediada por la inhibición (ya sea directa o indirecta) de uno o varios de los represores de la transcripción conocidos E-cadherina [33] - [35], No se observó evidencia consistente de la represión de la torcedura represores E-cadherina, Slug, Snail, ZEB1 o Zeb2 en líneas celulares que sobreexpresan CRPC miR-23b /-27b (datos no mostrados). Estos hallazgos sugieren la posible participación de otros represores y /o que el miR-23b /-27b mediada por la regulación de la E-cadherina se produce a través de un mecanismo (s) más complejo.
El proceso de metástasis no sólo implica la pérdida de adherencias célula-célula, pero las células tumorales también debe adquirir la capacidad de migrar con el fin de colonizar sitios distantes. La Rho GTPasa Rac1 regula reordenamiento del citoesqueleto de actina requerida para la migración celular. La sobreexpresión de Rac1 se asocia con una mayor potencial metastásico de próstata y otros tipos de cáncer epitelial [36] - [38]. elevada actividad Rac1 se produce en CRPC, promueve resistentes a la castración, así como, el crecimiento de anclaje independiente y es necesario para el comportamiento invasivo de la línea celular PC3 CRPC [19], [21]. Una variedad de activadores de Rac1 han demostrado ser importantes en la progresión del cáncer de próstata o en la adquisición de un fenotipo invasivo. Por ejemplo, nosotros y otros demostraron la importancia de factores de intercambio de nucleótidos de guanina (Rho) GEFs en la progresión de CRPC [21], [22], [26], [39]. Además, el aumento de expresión de ciertos Rac1 GEFs se correlaciona con el aumento de la recurrencia bioquímica [22] y la disminución de la supervivencia libre de enfermedad en pacientes con cáncer de próstata [40]. Las proteínas que disminuyen la actividad Rac1 través de la hidrólisis de GTP, activando las proteínas GTPasa (GAP), actúan como supresores tumorales [41]. A pesar de que el miR-23b /-27b no afectó a los niveles del total Rac1, la introducción de estos MIR en ALVA31 y células PC3-ML reducido los niveles de Rac1 activa (unida a GTP). Por lo tanto, suponemos que el miR-23-B /27-B debe inhibir una o más de las muchas activadores aguas arriba de Rac1 o indirectamente aumentar proteínas inhibidoras Rac1.
Mientras que la expresión de miR-23b /-27b mediada la reducción de la actividad de Rac1 y dio lugar a un aumento de los niveles de proteína e-cadherina, estos efectos son sospechosos de ser indirecta. Desde miRs individuales a menudo regulan numerosos genes diana, miR-23b /-27b puede reprimir a múltiples objetivos y las redes que finalmente dan lugar a los grandes cambios fenotípicos que hemos observado. Un número de miR-23b y de destino miR-27b genes se han identificado en otros tipos de células de cáncer en los que estos miRs se expresan diferencialmente en comparación con el tejido normal, incluyendo cáncer de mama, el hígado y el pulmón [42] - [50]. Sin embargo, dado que muchas de las proteínas codificadas por estos genes blancos están involucrados en la regulación de la proliferación celular, anticipamos que estos genes no representan las metas pertinentes en células de cáncer de próstata. Además, se identificaron numerosos candidato objetivos informáticos predijeron de miR-23b /-27b que están vinculados a Rac1 de señalización y regulación de E-cadherina, incluyendo la PI3-quinasa, MAPK, TGF-beta, Wnt, mTOR, Jak-STAT, similar a toll receptor y Notch entre otros. Dentro de estas redes complejas de integración, objetivos de miR-23b /-27b pueden converger para regular la actividad de Rac1 y E-cadherina. Estamos buscando activamente estos objetivos posibles. Además, será importante para delinear las funciones individuales de los dos miRs en este clúster en la invasión y migración de las células de cáncer de próstata.
Desde metástasis son responsables de la mortalidad de los pacientes en casi todos los carcinomas humanos, la capacidad de miR-23b /-27b para impedir los procesos metastásicos podría ser de valor clínico. La pérdida de miR-23b /-27b puede servir como un marcador pronóstico para el cáncer de próstata agresivo. Los biomarcadores que distinguen indolente de cáncer de próstata agresivo se necesitan con urgencia, y la pérdida de miR-23b /-27b pueden predecir la enfermedad metastásica. Desde MIR también tienen un uso potencial como modalidades terapéuticas [51], el miR-23b /-27b "imita" deben ser evaluados en modelos preclínicos de la metástasis del cáncer de próstata.
Apoyo a la Información
Slide S1.
Evaluación de la eficacia de transducción de las células PC3 y ALVA31-ML. La expresión de GFP de ALVA31 (A) o células PC3-ML (B) 72 horas después de la transducción dos secuenciales con los vectores de lentivirus GFP-codificado pMIRNA-miR-23b /o -27b pMIRNA-revueltos vectores de lentivirus (Biosciences Systems (SBI) Mountain View CA, EE.UU.). expresión de GFP en células transducidas y no transducidas se determinó mediante análisis FACS
doi:. 10.1371 /journal.pone.0052106.s001 gratis (TIF)
Slide S2.
niveles de miR-27b disminución de las células LNCaP transfectadas con antagomir-23b /-27b. células LNCaP fueron transfectadas con 50 nM antagomir-23b /-27b o controlar antagomir. los niveles de miR-27b se determinaron mediante PCR en tiempo real las 72 horas después de la transfección. Los valores son el nivel de miR-27b normalizado a U6 snRNA en las células LNCaP transfectadas con el control antagomir
doi:. 10.1371 /journal.pone.0052106.s002 gratis (TIF)
Reconocimientos
agradecemos a los Dres. BALAKRISHNA y Vinata Lokeshwar, Pedro Salas (Universidad de Miami Miller School of Medicine), Jennifer Richer (Universidad de Colorado Health Sciences Center) para proporcionar generosamente reactivos y consejos. También agradecemos al Dr. Seth Wander, Dekaung Zhao, Carol Maiorino, el Dr. Leah Lyons, el Dr. Wu Fayi, Stephanie Peacock y Cale Fahrenholtz (Universidad de Miami Miller School of Medicine) para el asesoramiento y la asistencia.